HHH H
8. WST-1 法
血球計数盤を用いて計数したCaco-2 細胞を5 x 105 cells/mLに調製後、96ウェル培養 プレートの各ウェルに100 µLずつ播種し、37℃、5％ CO2インキュベーター内で20時 間培養した。 培地を除去し、各ウェルをHBSS（100 µL）で注意して3回洗浄後、各 試験溶液を 100 µL 添加し、37℃で 1 時間インキュベートした。 試験溶液を除去後、
HBSS（100 µL）で注意して3回洗浄した。 各ウェルにHBSS 100 µL と WST-1 溶 液 10 µL 添加し、37℃で2時間インキュベートさせることで発色させ、マイクロプレー トリーダーを用いて450 nm における吸光度を測定した。 その際、参照波長は620 nm とした。
9. SDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）
Caco-2 細胞に作用させた上清溶液に2x sample buffer（4% SDS、20% グリセロール、
12％ β-メルカプトエタノールおよび適量のブロモフェノールブルーを含む 0.1 M
Tris-HCl 緩衝液（pH 6.8））を等量加え、100℃、3分間加熱し、還元状態の泳動用試料 を作成した。 1 レーンあたり 20 µL の試料を各アクリルアミド濃度（P-gp および MRP2 ; 7%、flotillin-1 ; 10%、caveolin ; 15%）の running gel、4.75% stacking gel を 用いて電気泳動（20 mAで約1時間後、40 mA で約 2 時間）を行った。 泳動用緩衝 液として 0.192 M グリシン、0.1% SDS、0.025 M Tris を用いた。
10. Caco-2 および Caco-2R 細胞単層膜の培養
血球計数盤を用いて計数した Caco-2 細胞を 2 x 105 cells/mL に調整後、Fig. 69 に示 すようなTranswell®（直径 3 µmの細孔をもつポリカーボネートメンブラン）に 1.5 mL 播種し、15 日間から 21 日間培養した。 なお、その間毎日培地交換を行った。 膜の basorateral 側には2.6 mLの DMEM を満たし、同様に培地交換を行った。
Fig. 69. Method of Transepithelial Electrical Resistance (TEER) Measurement of Caco-2 or Caco-2R Cell Monolayers on Transwell® Membrane
24 mm diameter insert 6 well cluster plate
6 well cluster plate Upper compartment
Cell Lower compartment Transwell
Microporous membrane
MILLPORE
Millicell®-ERS
11. 漏出成分の定量
[3H]Cholesterol の漏出
[3H]Cholesterol の漏出の評価は、Ohvo らの方法に準じて行った。96) 35 mm 組 織培養ディッシュに前述した方法で単層膜を形成させた後、[3H]cholesterol（5 µCi/mL
of serum） 含 有 DMEM で 24 時 間 培 養 す る こ と で 細 胞 内 コ レ ス テ ロ ー ル を
[3H]cholesterol に置換した。 DMEM を除去し、HBSS で3 回洗浄した。 各 CyDs 試験液を添加後、経時的に50 µL ずつサンプリングを行い、シンチレーター（HIONIC FLUORTM、Packard）2 mL に溶解し、液体シンチレーションカウンターにより 3H の放射活性を測定した。 漏出率を以下の式より算出した。
total [3H]cholesterol in sample
% [3H]Cholesterol efflux ＝
total [3H]cholesterol in the cells at time zero
リン脂質の漏出
35 mm 組織培養ディッシュに前述した方法で単層膜を形成させた後、DMEM を
除去し、HBSSで 3 回洗浄後、各 CyDs 試験液を添加した。 30 分間インキュベ ート後、上清液を遠心分離（4000 rpm、3 min）し、上清 0.5 mLをリン脂質C-テ ストワコー発色試液 0.5 mL と混合して発色後、分光光度計で 600 nm の吸光度を 測定し、リン脂質量を算出した。
総タンパク質の漏出
35 mm 組織培養ディッシュに前述した方法で単層膜を形成させた後、DMEM を
除去し、HBSSで 3 回洗浄後、各 CyDs 試験液を添加した。 30 分間インキュベ ート後、上清液を遠心分離（4000 rpm、3 min）し、上清 0.7 mLを20% トリクロ ロ酢酸溶液と混合し、氷上で 15 分間インキュベートした。 遠心分離（16,000 rpm、
15 min）し、上清を取り除き、冷アセトン 0.5 mL により pellet を洗浄後、遠心分 離（16,000 rpm、15 min）により冷アセトンを除去した。 15 分間乾燥させた pellet に直接 BCA kit working reagent 210 µL を加え、ピペッティングによりよく混和し
x 100
レートリーダーで 570 nm の吸光度を測定し、総タンパク質量を算出した。
12. TEER 測定
Transwell® にて単層膜を形成後、DMEM を HBSS に交換し、30 分間プレイン キュベーション後、各試験溶液を apical 側に添加し、経時的に TEER を測定した。
TEER 測定には、Fig. 69 に示す Millicell®-ERS を用い、銀 / 塩化銀からなる2つ の電極を細胞単層膜の apical 側と basolateral 側にそれぞれ浸して測定した。
13. Caco-2 および Caco-2R 細胞単層膜透過実験
Transwell® にて単層膜を形成後、DMEMをHBSSに交換し、30分間プレインキュベ ーションを行った。 各条件下で、各種薬物溶液を apical 側、あるいは basolateral 側 に添加し、経時的にそれぞれ反対側から 100 µL ずつサンプリングを行った。その際、
volume補正のため100 µLのHBSSを補った。 それぞれの薬物濃度は、以下に示す定 量法で測定した。 また、見かけの透過係数（Papp）は、時間（sec）に対する透過量（mol）
をプロットし、次式から算出した。
dQ / dt Papp =
A・C0
Q ：透過量（mol）
A ：細胞表面積（cm2） C0 ：初濃度（mol/mL）
Papp ：見かけの透過係数（cm/sec）
タクロリムスの定量
タクロリムス溶液を添加した層の反対側（apical 側または basolateral 側）から、
経時的に100 µLずつサンプリングし、in vivo 実験におけるEIAと同様の方法で定量 を行った。 ただし、抽出操作は省略した。
ローダミン 123 の定量
ローダミン 123 を添加した添加した層の反対側（apical 側または basolateral 側）
から、経時的に100 µLずつサンプリングし、蛍光検出器を用いてHPLC 法により定 量した。 HPLC 条件は以下の通りである。
HPLC条件
カラム ： TSK gel ODS-80TM (4.6 x 150 mm) 移動相 ： アセトニトリル：1% 酢酸（2：3 v/v）
流速 ： 1.0 mL/min 注入量 ： 20 µL
検出波長 ： 励起波長 507 nm、蛍光波長 529 nm
BCECF の定量
BCECF-AM（5 µM）を添加した層の反対側（apical 側または basolateral 側）か
ら、2 時間後に 1 mL ずつサンプリングし、蛍光分光光度計（日立 F-4500）を用い
て定量した。 励起波長は 439 nm、蛍光波長は525 nm とした。
フェナセチンの定量
Transwell® の apical 側から、経時的に100 µLずつサンプリングを行い、UV検出 器を用いてHPLC 法により定量した。 HPLC 条件は以下の通りである。
HPLC条件
カラム ： HYPERSIL ODS-5 (4.6 x 250 mm) 移動相 ： アセトニトリル：水（1：1 v/v）
流速 ： 1.0 mL/min 注入量 ： 20 µL
検出波長 ： 249 nm
[3H] mannitolの定量
Transwell® の basolateral 側から、経時的に 100 µLずつサンプリングを行い、シ ンチレーター（HIONIC FLUORTM、Packard）2 mL に溶解し、液体シンチレーショ ンカウンターにより3Hの放射活性を測定した。
14. Western blot 分析
1）試料の調製
35 mm 組織培養ディッシュに前述した方法で単層膜を形成させ、DMEM を除
去し、HBSSで3回洗浄した。 各試験液を 30 分間作用させた後、試験溶液を除 去し、HBSSで3回洗浄した。 Lysis buffer（3％ SDS、2 mM dithiothreitol、
73 µM pepstatin A、0.1 mM leupeptin、1 mM phenylmethylsulfonyl fluorideを 含有したPBS）を 500 µL添加し、氷冷下で45 分間、5分おきに攪拌しながらイ ンキュベートした。 遠心分離（16,000 rpm、10 min）後、上清を分取し、lysate とした。 漏出タンパク質の検出は、35 mm 組織培養ディッシュに前述した方法 で単層膜を形成させ、DMEM を除去し、PBSで3回洗浄した後、細胞単層膜を各 種 CyD で 30 分間処理後、その上清を回収した。 上清3 mL（35 mm 組織培 養ディッシュ 2 枚分）をトリクロロ酢酸沈殿法により濃縮し試料とした。
2） P-gp、MRP2、caveolin および flotillin-1 の検出
SDS-PAGE後、PVDF 膜に転写（100 V、3時間）した。 転写した PVDF 膜 をblocking buffer（5％ skim milk、10 mM Tris pH 7.5、100 mM NaCl、0.1%
Tween 20）を用いて、25℃で 1 時間 blocking し、P-gp、MRP2、caveolin お よび flotillin-1 を検出するためにそれぞれの一次抗体（mouse anti-human P-gp C219 monoclonal antibody（1：100）、mouse anti-human MRP2 M2I-4 monoclonal antibody（1：100）、anti-caveolin C13630 polyclonal antibody（1：
5000）、mouse anti-flotillin-1 clone 18 antibody（1：250）） を25℃ で一晩作用 させた。 PBS - Tween 20（0.1％）で洗浄後、BSA（2%）- PBS - Tween 20（0.1%）
溶液で希釈した二次抗体（P-gp、MRP2 and flotillin-1；peroxidase-conjugated sheep anti-mouse IgG antibody（1：1000）、caveolin；peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit IgG antibody（1：5000））を25℃ で1時間作用させた。 PBS - Tween 20（0.1％）溶液で洗浄後、ECL Western blotting analysis system
（Amersham）を用いてそれぞれのバンドを検出した。
15. Cholesterol-loaded DM-β-CyD 試験液の調製
コレステロール粉末（200 mg）をねじ口試験管 (15 mL) に入れ、10 mM DM-β-CyD
（HBSS）溶液10 mL を加えて密栓し、溶解平衡に達するまで (7日間) 振盪した。 そ の 溶 液 を 遠 心 分 離 後 (2,000 rpm、5 min)、 上 清 を フ ィ ル タ ー （Advantec 製 DISMIC-3CP）でろ過し、cholesterol-loaded DM-β-CyD 試験液を得た。 ろ液中のコ レステロール濃度を HPLC 法により定量したところ、1.55±0.03 mM（0.6±0.01 mg/mL）であった。
HPLC条件
カラム ： µBONDAPAK C18(4.6 x 250 mm)
移動相 ： アセトニトリル：イソプロパノール（60：40 v/v）
流速 ： 1.0 mL/min 注入量 ： 20 µL 検出波長 ： 202 nm 16. 銀染色
35 mm 組織培養ディッシュに前述した方法で単層膜を形成させ、DMEM を除去し、
HBSSで3回洗浄した後、単層膜を各種 CyD で 30 分間処理後、その上清を回収した。
上清3 mL（35 mm 組織培養ディッシュ 2 枚分）をトリクロロ酢酸沈殿法により濃縮
し試料とした。 試料に 1x sample buffer 20 µL を加え、100℃で 3 分間加熱し、還 元状態の泳動用試料を作成した。 SDS-PAGE 終了後、ゲルを銀染色キットを用いて 銀染色した。
17. Reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）分析 1）Total RNAの抽出
60 mm 組織培養ディッシュに前述した方法で単層膜を形成させ、DMEM を除
去し、HBSS で 3 回洗浄した。 各試験液を 30 分間作用させた後、試験溶液を 除去し、HBSSで3回洗浄した。 0.05% トリプシン / 0.02% EDTA 溶液を用い て細胞を剥離し、遠心分離（4000 rpm、3 min）後、上清を除去した。 RNeasy Mini Kit（QIAGEN）を用いて、total RNAを抽出し、DNase（1 units）および RNase 阻害剤（35 unit）を用いて、37℃で 30 分間処理した。 分光光度計にて 260 nm の吸光度を測定し全 RNA 量を算出した。
2）RT 反応
全 RNA（3 µg）に対して、下記に示すそれぞれの reverse プライマー（1 µM）
2 µL、5x first strand buffer 4 µL、0.1 M dithiothreitol 2 µL、10 mM deoxynucleoside triphosphate（dNTP） 混 合 液 1 µL お よ び 逆 転 写 酵 素
（SuperScript II®）1 µL を加え、PCR Thermal Cycler を用い 42℃ で 50 分間 RT 反応を行い、それぞれの cDNA を得た。
3）PCR 反応
Diethylpyrocarbonate（DEPC）処理水 78.5 µL、10x PCR buffer 10 µL、25 mM MgCl2 6 µL、10 mM dNTP 混合液 2 µLおよび下記に示すそれぞれの forward
（3’）プライマーと reverse（5’）プライマーを 0.5 µL ずつ加え、さらにRT 反 応で得られたそれぞれの反応物含有溶液 2 µL および耐熱性ポリメラーゼ（Taq DNA polymerase、5 U/µL）溶液 0.5 µL を混合し、PCR Thermal Cycler を用い、
95℃で 11 分間プレインキュベートしポリメラーゼを活性化後、94℃ で 1 分間
の変性、55℃ で 1 分間のアニーリング、72℃ で 2 分間のDNA伸長反応を 25 サイクル行い、DNA を増幅した。
4）アガロースゲル電気泳動
PCR により増幅された DNA 10 µL に10x loading buffer 1 µL を加え、全量 を 0.1 mg/mL エチジウムブロマイドを含む 0.5x TBE（Tris-borate EDTA；45 mM Tris、45 mM ホウ酸、1 mM EDTA）で作成した2% アガロースゲルに添加 後、ミニゲル電気泳動層（Mupid）にて泳動した。 トランスイルミネーターによ りゲルを撮影した。
各遺伝子に対するプライマー
human MDR1 (PCR product: 541 bp)
forward : 5’-GAGGTGAAGAAGGGCCAGACG-3’
reverse : 5’-TTCTGGATGGTGGACAGGCGGTGA-3’
human MRP2 (PCR product: 558 bp)
forward : 5’-GAAGACGATGACTATGGGCTGA-3’
reverse : 5’-ACGAAACCAAAGGCACTCCAGA.-3’
human β-actin (PCR product: 314 bp)
forward : 5’-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3’
reverse : 5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’
18. Flow cytometry
35 mm組織培養ディッシュに前述した方法で単層膜を形成させ、DMEM を除去し、
HBSSで3回洗浄した。 各濃度の CyDs を溶解させた HBSS を 2 mL 加え 30 分 間作用させた後、溶液を除去し、HBSS で 3 回洗浄した。 P-gp 発現量の回復実験に おいては、DM-β-CyD（10 mM）で処理後、HBSSを10％ FCS 含有 DMEM に置換 し、各回復時間インキュベートした（37℃、5% CO2）。 また、ローダミン123 の取り 込み実験においては、DM-β-CyD で処理後、0.5 µM ローダミン123 溶液を添加し、37℃
で 60 分間インキュベートした。 洗浄後、0.05% トリプシン / 0.02% EDTA 溶液を 用いて細胞を剥離し、遠心分離（4,000 rpm、3 min）後、上清を除去した。 細胞を0.1%
NaN3含有HBSS 100 µLに懸濁し、2 x 106 cells/100 µLに調整後、PE標識抗P-gp抗 体UIC2を20 µL加え、細胞膜表面のP-gpを標識（4℃、30min）した。 HBSSで3 回洗浄後、遠心分離（4,000 rpm、3 min）し、上清を除去した。 1 mLのHBSSに再 懸濁し、試料とした。 FACSCalibur® により細胞の蛍光強度を測定し、Cell Quest® に より解析した。
19. カベオラ画分の分離
カベオラ画分の単離は、Lisanti 等の方法に準じて行った。97) 150 mm 組織培養デ ィッシュに前述した方法で単層膜を形成させ、DMEM を除去し、HBSS で3 回洗浄し た。 各濃度の CyDs を溶解させた HBSS を 2 mL 加え 30 分間作用させた後、溶 液を除去し、HBSS で 3 回洗浄した。 カベオラ画分の分離は、Fig. 70 に示すように、
sucrose 密度勾配遠心法により行い、すべての操作を氷冷下で行った。 まず、500 mM