熊本大学学位論文

熊本大学学位論文

シクロデキストリンによるタクロリムスの消化管吸収改善における 薬物排出ポンプの関与

2003

湯之前  清和

シクロデキストリンによるタクロリムスの消化管吸収改善における 薬物排出ポンプの関与

2003 湯之前  清和

Contribution of Multidrug Efflux Pump Contribution of Multidrug Efflux Pump Contribution of Multidrug Efflux Pump

Contribution of Multidrug Efflux Pump to the Enhancing Effects to the Enhancing Effects to the Enhancing Effects to the Enhancing Effects of of

of of C C C Cyclodextrin on Oral Bioavailab yclodextrin on Oral Bioavailab yclodextrin on Oral Bioavailab yclodextrin on Oral Bioavailability of Tacrolimus ility of Tacrolimus ility of Tacrolimus ility of Tacrolimus

Kiyokazu Yunomae

Contribution of Multidrug Efflux Pump to the Enhancing Effects of Cyclodextrin on Oral Bioavailability of Tacrolimus

Kiyokazu Yunomae

Tacrolimus is a novel immunosuppressive drug, but is known to exhibit low oral bioavailability and a wide range of variability in absorption, ranging from 8 to 69%, a mean of about 20% in human. Some of the reasons for such drawbacks are the very low aqueous solubility of tacrolimus and a first pass metabolism via a combination of cytochrome P450 3A (CYP3A) and P-glycoprotein (P-gp) in the intestinal epithelial cells. In this study, the enhancing effects of cyclodextrins (CyDs) on the solubility of tacrolimus, and the inclusion mechanism of the tacrolimus/CyDs complexes were investigated and the in vivo absorption behavior of the drugs after oral administration of the tacrolimus/CyDs complexes was studied in rats. In addition, the contribution of P-gp to the enhancing effects of CyDs on the oral bioavailability of tacrolimus was examined using Caco-2 and multidrug resistance Caco-2 (Caco-2R) cells. Furthermore, the effects of CyDs on the function of multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2) were investigated. The results obtained here are summarized as follows:

1) The hydrophilic CyDs increased the solubility of tacrolimus in water with a concentration-dependent manner. The solubilizing ability of natural CyDs increased in order of γ-CyD < α-CyD < β-CyD. Of the

β-CyDs derivatives,

dimethyl-β-CyD (DM-β-CyD) showed the greatest solubilizing ability through the formation of the stable complex in a molar ratio of 1:1. The dissolution rate of tacrolims was markedly augmented by complexation with DM-β-CyD.

2) Of the

β-CyDs derivatives, DM-β-CyD showed the strongest interaction with

tacrolimus in the circular dichroism spectra and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopic studies. NMR spectroscopic study indicated that hydrophobic side chains of tacrolimus are involved in the complexation with DM-β-CyD.

3) After oral administration of the tacrolimus/DM-β-CyD suspension to rats, the blood levels of tacrolimus significantly increased compared with that of drug alone. The variation in blood levels was markedly decreased when the drug was administered as the tacrolimus/DM-β-CyD complex.

4) A nonlinear relationship was observed between the AUC value of blood tacrolimus after oral administration and the amount of tacrolimus dissolved in the suspension for oral administration. This observation suggested that the increase in AUC value of tacrolimus by DM-β-CyD may be caused by not only the solubilizing activity of DM-β-CyD but also inhibition of the efflux and/or metabolism in the gastrointestinal tract.

5) Of the CyD derivatives, dimethyl-α-CyD (DM-α-CyD), DM-β-CyD and

methyl-β-CyD (M-β-CyD) reduced the viability of Caco-2 and Caco-2R cells

above 25 mM and 50 mM, respectively. In addition, DM-α-CyD, DM-β-CyD and M-β-CyD decreased transepithelial electrical resistance and increased [

³

H]mannitol permeation through Caco-2 and Caco-2R cell monolayers at relatively low concentrations. In contrast, hydroxypropyl-α,

β, γ-CyDs and

sulfobutylether 4, 7-β-CyDs did not affect viability and cell monolayer’s integrity of Caco-2 and Caco2R cells up to 100 mM.

6) DM-β-CyD significantly released membrane components such as cholesterol, phospholipids and proteins, while DM-α-CyD released preferentially phospholipids from Caco-2 and Caco-2R cell monolayers.

7) In the Caco-2 and Caco-2R cell monolayers, basolateral to apical permeation of tacrolimus was inhibited by pretreatment of the apical membranes with DM-β-CyD (10 mM, 30 min). The inhibitory effect was similar and lower to the treatment of P-gp inhibitors (cyclosporin A, verapamil and quinidine) in Caco-2 and Caco-2R cell monolayers, respectively.

8) The pretreatment with DM-β-CyD significantly inhibited the basolateral to apical permeation of rhodamine 123, a representative P-gp substrate, and BCECF, a MRP2 substrate, in Caco-2 and Caco-2R cell monolayers.

DM-α-CyD significantly inhibited the permeation of rhodamine 123 in Caco-2 cell monolayers, but not in Caco-2R cell monolayers. However, these inhibitory effects of DM-CyDs were apparently lower than those of P-gp and MRP2 inhibitors.

9) DM-β-CyD released the P-gp and MRP2 and reduced the P-gp and MRP2 levels in Caco-2 and Caco-2R cell monolayers. The results of RT-PCR analysis indicated that DM-β-CyD affects a transcription of P-gp and MRP2 only very slightly in Caco-2 and Caco-2R cell monolayers.

10) P-gp and MRP2 resided in both caveolae and non-caveolae fractions of Caco-2 cell monolayers, whereas P-gp localized in caveolae and MRP2 resided in both caveolae and non-caveolae fractions of Caco-2R cell monolayers. DM-β-CyD lowered the cholesterol level and slightly decreased P-gp and MRP2 levels in caveolae of Caco-2 and Caco-2R cell monolayers.

These results suggested that the enhancing effect of DM-β-CyD on the oral bioavailability of tacrolimus is due not only to its solubilizing effect but also, at least in part, to its inhibitory effect on the P-gp-mediated efflux of tacrolimus from intestinal epithelial cells. The inhibitory mechanism of DM-β-CyD was through the release of P-gp from apical membranes, resulting from the extraction of cholesterol from caveolae in Caco-2 and Caco-2R cell monolayers. In addition, DM-β-CyD inhibited not only the P-gp but also the MRP2 in a similar mechanism.

The present results will be useful for understanding the mechanism of the

enhancing effect of DM-β-CyD on the oral bioavailability of hydrophobic drugs

which are substrates of efflux transporters in intestinal epithelial cells.

目 目 目

目        次 次 次 次

緒言 ---

1

第 1 章 タクロリムスとシクロデキストリンの相互作用 --- 8

第 1 節 序 --- 8

第 2 節 溶解度法による検討 --- 9

第 1 項 タクロリムスの溶解度に及ぼす各種シクロデキストリンの影響 ---- 9

第 2 項 タクロリムスの溶解度に及ぼす温度の影響 --- 13

第 3 節 円二色性（CD）スペクトル法による検討 --- 16

第 4 節 核磁気共鳴（NMR）スペクトル法による検討 --- 17

第 5 節 考察 --- 22

第 6 節 小括 --- 24

第 2 章 シクロデキストリン包接によるタクロリムスの経口バイオアベイラビ リティの増大 --- 26

第 1 節 序 --- 26

第 2 節 タクロリムス/シクロデキストリン複合体からの薬物溶解挙動 --- 26

第 3 節 タクロリムスの消化管吸収に及ぼすシクロデキストリンの影響 --- 29

第 1 項 ラットに静脈内投与後の全血中濃度 --- 29

第 2 項 ラットに経口投与後の全血中濃度 --- 32

第 4 節 考察 --- 40

第 5 節 小括 --- 44

第 3 章 Caco-2細胞における

P-糖タンパク質および MRP2

の機能に及ぼす

シクロデキストリンの影響 --- 46

第 1 節 序 --- 46

第 2 節 Caco-2 細胞とシクロデキストリンの相互作用 --- 47

第 1 項 細胞傷害性 ---

47

第 2 項 膜抵抗値（TEER）に及ぼす影響 ---

50

第 3 項 マンニトール透過に及ぼす影響 --- 52

第 4 項 細胞膜成分の漏出に及ぼす影響 --- 52

第 3 節 タクロリムス透過に及ぼす影響 ---

57

第 1 項 懸濁液による検討 ---

57

第 2 項 溶液による検討 ---

59

第 3 項 シクロデキストリン前処理による検討 --- 60

第 4 節 ローダミン

123

透過に及ぼす影響 --- 65

第 5 節 BCECF 透過に及ぼす影響 --- 69

第 6 節 P-糖タンパク質および MRP2 発現に及ぼす影響 ---

71

第 7 節 ジメチル-β-シクロデキストリンによる薬物排出ポンプ機能阻害 におけるカベオラの関与 --- 75

第 1 項 カベオラ画分のコレステロール含量に及ぼす メチル化シクロデキストリンの影響 --- 75

第 2 項 P-糖タンパク質および MRP2 の細胞膜局在性に及ぼす ジメチル-β-シクロデキストリンの影響 --- 77

第 3 項 P-タンパク質および MRP2 の機能に及ぼす カベオラ阻害剤の影響 ---

78

第 8 節 考察 --- 80

第 9 節 小括 --- 85

第 4 章 多剤耐性

Caco-2

細胞（Caco-2R）における

P-糖タンパク質

および MRP2 機能に及ぼすシクロデキストリンの影響 --- 88

第

1

節 序 ---

88

第

2

節 Caco-2R 細胞とシクロデキストリンの相互作用 --- 89

第

1

項 細胞傷害性 --- 89

第

2

項 膜抵抗値（TEER）に及ぼす影響 --- 90

第

3

項 マンニトール透過に及ぼす影響 --- 92

第

4

項 細胞膜成分の漏出に及ぼす影響 --- 95

第

3

節 タクロリムス透過に及ぼす影響 --- 98

第

4

節 ローダミン

123

透過に及ぼす影響 --- 101

第

5

節 BCECF 透過に及ぼす影響 --- 105

第

6

節 P-糖タンパク質および MRP2 発現に及ぼす影響 ---

107

第

7

節 ジメチル-β-シクロデキストリンによる薬物排出ポンプ機能阻害 におけるカベオラの関与 --- 112

第

1

項 カベオラ画分のコレステロール含量に及ぼす メチル化シクロデキストリンの影響 --- 112

第

2

項 P-糖タンパク質および MRP2 の細胞膜局在性に及ぼす ジメチル-β-シクロデキストリンの影響 --- 114

第

3

項 P-タンパク質および MRP2 の機能に及ぼす カベオラ阻害剤の影響 --- 116

第

8

節 考察 --- 118

第

9

節 小括 --- 123

総括 --- 126

謝辞 --- 131

実験の部 --- 132

参考文献 ---

149

本論文 本論文 本論文

本論文でででで使用使用使用した使用したしたした主主主主ななな略語一覧表な略語一覧表略語一覧表 略語一覧表

A to B apical to basolateral apical 側から basolateral 側へ AUC area under the concentration-time curve 血中濃度-時間曲線下面積 BCECF 2’,7’-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein

BCECF-AM 2’,7’-bis(2-carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein-acetoxymethyl ester

BSA

bovine serum albumin ウシ血清アルブミン

B to A basolateral to apical basolateral 側から apical 側へ

CD circular dichroism 円二色性

CLtot total clearance 全身クリアランス

Cmax maximum plasma level 最高血中濃度

CyD cyclodextrin シクロデキストリン

DM-CyD 2,6-di-O-methyl-cyclodextrin ジメチル-CyD

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium ダルベッコ変法イーグル培地 dNTP deoxynucleoside triphosphate デオキシリボヌクレオシド三リン酸

DNA deoxyribonucleic acid デオキシリボ核酸

DNase deoxyribonuclease デオキシリボ核酸分解酵素

DS average degree of substitution 平均置換度

EIA enzyme immunoassay 酵素免疫測定法

EDTA disodium ethylenediaminetetraacetate エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム

F absolute bioavailability 絶対バイオアベイラビリティ（吸収率）

FBS fetal bovine serum ウシ胎児血清

HB-β-CyD hydroxybutyl-β-cyclodextrin ヒドロキシブチル-β-CyD HBSS Hanks’ balanced salt solution ハンクス緩衝液

HEPES N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonic acid

HP-CyD 2-hydroxypropyl-cyclodextrin ヒドロキシプロピル-CyD HPLC high performance liquid chromatography 高速液体クロマトグラフィー

K stability constant 安定度定数

M-β-CyD methyl-β-cyclodextrin メチル-β-CyD

MRP multidrug resistance-associated protein 多剤耐性関連タンパク

MRT mean residence time 血中平均滞留時間

NMR nuclear magnetic resonance 核磁気共鳴 Papp apparent permeability coefficient みかけの透過係数 PBS phosphate-buffered saline リン酸緩衝液

P-gp P-glycoprotein P-糖タンパク質

RNA ribonucleic acid リボ核酸

RNase ribonuclease リボ核酸分解酵素

RT reverse transcription 逆転写

PCR polymerase chain reaction ポリメラーゼ連鎖反応

SBE-β-CyD sulfobutyl ether-β-cyclodextrin スルフォブチルエーテル-β-CyD

SDS sodium dodecylsulfate ドデシル硫酸ナトリウム

PAGE polyacrylamide gel electrophoresis ポリアクリルアミド電気泳動 TEER transepithelial electrical resistance 上皮細胞単層膜上下間電気抵抗 Tmax time required to reach the maximum 最高血中濃度到達時間

本論文本論文

本論文本論文はははは学術雑誌学術雑誌学術雑誌に学術雑誌ににに掲載掲載掲載された掲載されたされたされた次次次次ののの論文の論文論文を論文ををを基礎基礎基礎基礎とするものでとするものでとするものであるとするものであるある。ある。。。

1) Comparative Studies of the Enhancing Effects of Cyclodextrins on the Solubility and Oral Bioavailability of Tacrolimus in Rats

Arima H., Yunomae K., Miyake K., Irie T., Hirayama F. and Uekama K.:

J. Pharm. Sci., 90 90 90 90, 690-701 (2001).

2) Contribution of P-glycoprotein to the Enhancing Effects of Dimethyl-β-cyclodextrin on Oral Bioavailability of Tacrolimus

Arima H., Yunomae K., Hirayama F. and Uekama K.:

J. Pharmcol. Exp. Ther., 297 297 297 297, 547-555 (2001).

3) Involvement of Cholesterol in the Inhibitory Effect of Dimethyl-β-cyclodextrin on P-glycoprotein and MRP2 Function in Caco-2 Cells

Yunomae K., Arima H., Hirayama F. and Uekama K.:

FEBS Lett. , (2003) : in press.

緒 緒

緒 緒        言 言 言 言

マクロライド系抗生物質であるタクロリムス（Fig. 1）は、シクロスポリン A と 並ぶ代表的な免疫抑制剤の一つであり、他人から移植された臓器を非自己として認 識し、拒絶反応を起こす免疫応答の初期の段階を効果的に抑える。  現在臨床使用 されているタクロリムス製剤には、臓器移植の際の拒絶反応抑制剤（PROGRAF^®

（ カ プ セ ル 剤 、 注 射 剤 ）） と 、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 の 治 療 を 目 的 と す る 軟 膏 剤

（PROTOPIC^®軟膏）がある。  前者は、肝移植・腎移植における拒絶反応の抑制、

骨髄移植における移植片対宿主病の治療に効果を発揮している。¹⁾  しかしながら、

タクロリムスの有効治療域（5 〜 20 ng/mL）は狭く、20 ng/mL 以上で高カリウ ム血症、腎機能障害および高血糖といった副作用を発現し、5 ng/mL 以下では拒絶 反応を起こす危険があるため、臨床使用される際には薬物治療モニタリング（TDM）

が必要である。²⁾  また、現在市販されているタクロリムスの経口カプセル剤

PROGRAF

^® のバイオアベイラビリティは低く（約

20%）

、患者間の吸収変動も大き

い（8 〜 69%）ことから、消化管吸収性に優れる製剤の開発が望まれている。^3,4)

OH

・

・・

・H²O H3C

HO H3C

H3C

N O

O CH

CH O

OH

OCH³

O O

O

CH OCH³

Fig. 1. Chemical Structure of Tacrolimus

  一方、タクロリムスの低いバイオアベイラビリティや吸収のバラツキは、タクロリ ムスの水への低い溶解度（2.4 〜 3.6 µM、室温）に加えて、消化管粘膜での P-糖タ ンパク質（P-glycoprotein、以下 P-gpと略記）や薬物代謝酵素 CYP3A の発現量の個 体差などに起因することが知られている。^5,6)

 

Fig. 2 は、薬物の消化管吸収に対する多剤排出ポンプ（P-gp

および multidrug

resistance-associated protein 2（MRP2）

）と CYP3A の寄与を模式化したものであ る。 

P-gp

は、多剤耐性遺伝子（multidrug resistance 1、

MDR1

）がコードする分 子量 170 kDaの膜糖タンパク質であり、抗癌剤などを含むさまざまな生体異物を、

ATP

の加水分解に依存して細胞外へ排出する ATP binding cassette（ABC）トラン スポーターである。  その基質特異性は広く、脂溶性の高い薬物（ベラパミル、ビン ブラスチン等）だけでなく、水溶性薬物（シメチジン、ラニチジン等）など、多くの 薬物を細胞外に排出することが知られている。^7-9)  また P-gp は脳血管内皮細胞や 肝細胞などの正常組織でも発現しており、小腸上皮細胞中に発現した P-gp は免疫抑 制剤や抗癌剤などの消化管吸収の障壁となっている。  一方、分子量 45 〜 55 kDa のヘムタンパク質である Cytochrome P450 の分子種である CYP3A は、肝臓や小

腸に豊富に存在し、特に、ヒトでは十二指腸や空腸での発現が高く、多くの薬物の初 回通過効果に関与していることが知られている。^10-12)  また、先に述べた P-gp と

CYP3A

の基質はオーバーラップする場合が多く、¹³⁾ これらが連携的に作用すること

により、基質となる薬物のバイオアベイラビリティを低下させることも知られている。 

このような背景から、タクロリムスの溶解性を改善し、かつ小腸上皮細胞における

P-gp

や CYP3A の機能を制御することにより、タクロリムスのバイオアベイラビリ

ティの改善が期待できる。  これまで、タクロリムスの溶解性の改善策として、水溶 性高分子との固体分散体形成や界面活性剤を利用した例が報告されているが、^14,15) いずれも十分なバイオアベイラビリティの改善効果は得られておらず、他の方策の開 発が望まれている。  また、界面活性剤などの製剤添加剤が P-gp や CYP3A の発 現にどのような影響を与えるかについてもほとんど知られていない。

 

MRP2（Fig. 2）は、MRP

ファミリーのひとつであり、P-gp と同様 ABC トラン スポーターに属する膜タンパク質である。 

MRP2

の基質選択性は広く、グルクロ ン酸抱合体、グルタチオン抱合体などの各種抱合体や非抱合型の有機アニオンなどの 比較的水溶性の高い化合物を基質とし、多剤耐性に関与することが知られている。

16-18)  また、MRP2 は、癌細胞だけでなく小腸上部にも多く発現しており、小腸上

皮細胞からの有機アニオン薬物の排出に関与することが報告されている。^18,19)

Fig. 2. Schematic Illustration of the Role of Multidrug Efflux Pumps (P-glycoprotein (P-gp), multidrug resistance-associated protein 2 (MRP2)) and CYP3A in Intestinal Epithelial Cells

efflux pumps (P-gp, MRP2) drugs

mucosal side

serosal side

excretion

metabolites CYP3A

efflux pumps (P-gp, MRP2) drugs

mucosal side

serosal side

excretion

metabolites CYP3A

  シクロデキストリン (cyclodextrin、以下 CyD と略記) はデンプンに CyD 生成

酵素を作用させて得られる環状のオリゴ糖であり、種々の薬物をその疎水空洞内に取 り込んで包接複合体を形成する単分子的ホスト分子に分類される。^20,21) 

CyDs

の超 分子的な包接特性は、食品、化粧品、臨床検査薬、繊維、樹脂など多方面で利用され ており、薬剤学・製剤学領域では、CyDs の包接作用を利用して、不安定な医薬品の

安定化、溶解性の調節、バイオアベイラビリティの向上、油状あるいは低融点物質の 粉体化、揮散性の防止、苦味・悪臭および局所刺激性の軽減などへの応用が試みられ

ている。^22-26)  しかしながら、天然 CyDs を薬物送達システム（

Drug Delivery

System、以下 DDS と略記）に応用するには物性や包接能に限界があるため、機能

性や生体適合性を高めた種々の CyDs 誘導体が開発され、

DDS

への応用に関する基 礎研究が活発に行われている。^24-27)  たとえば、

CyDs

の水溶性を高めたメチル化体、

ヒドロキシアルキル化体、スルフォブチル化体、分岐 CyDs などの親水性誘導体は 難水溶性薬物の速放出用担体として有用であり、最近では包接対象が低分子から生理 活性ペプチドやタンパク性薬物などの高分子へ拡がり、その応用範囲も経口投与製剤 から注射剤や経皮、経粘膜適用剤などの非経口投与製剤へ拡大している。^28-33)

  一方、CyDs はその空洞サイズに応じて、赤血球膜などの生体膜から主な構成成分 であるリン脂質やコレステロールなど脂質類を熱力学的平衡に基づいて可溶化し、溶 血や生体膜の形態変化を惹起すること、またその際、CyDs は赤血球や生体膜からタ ンパク質を二次的に遊離させることが報告されている。^34,35)  さらに、近年、赤血球 膜を含む細胞膜にはカベオラやラフトと呼ばれるコレステロールやスフィンゴ脂質 が豊富な脂質マイクロドメイン（Fig. 3 参照）が存在し、CyDs誘導体、なかでもメ チル β-CyD およびヒドロキシプロピル β-CyD（構成グルコース数：7個）は、細胞 膜表面上の脂質マイクロドメインからコレステロールを引き抜き、そのドメイン構造 を破壊することが報告されている。^36,37)

Fig. 3. Schematic Illustration of Caveolae and Rafts in Cell Membranes

  脂質マイクロドメインの一つであるカベオラは細胞表面の小さなくぼみ（直径：約

50〜100 nM）であり、一方、ラフトは細胞表面の動的なドメイン（直径：約 30 nm）

である（Fig. 3）。  カベオラを構成する主要なタンパク質として、コレステロール結 合能をもつカベオリンが最初に見出され、コレステロール輸送などに関与していると 考えられている。^38-40)  また、カベオラおよびラフトは、シグナル伝達に関与する多 くのタンパク質が局在（H-Ras, epidermal growth factor receptor (EGF-R), glycosyl

phosphatidyl inositol (GPI) anchor proteins, G proteins

など）しており、これら脂 質マイクロドメインを β-CyD 誘導体を用いて破壊すると、局在したタンパク質を介 するシグナル伝達が阻害されることが報告されている。^41-45)  さらに、

Demeule

らは、

多剤耐性細胞や脳血管内皮細胞において、P-gp がカベオラに局在することを報告し

46)、Field らは、小腸刷子縁にもカベオラが存在することを報告している。³⁹⁾

以上のような背景から、

CyDs

は小腸上皮細胞における P-gp や CYP3A の発現量

caveolae rafts

: phospholipids : cholesterol

: glycosphingolipids : caveolin

caveolae rafts

: phospholipids : cholesterol

: glycosphingolipids : caveolin

や機能に影響を及ぼし、その結果タクロリムスの消化管吸収挙動が変化する可能性が 考えられる。  実際、親水性 CyDs 誘導体の一つであるジメチル-β-CyD（DM-β-CyD）

が抗癌剤 doxorubicin の多剤耐性癌細胞内への取込みを P-gp 阻害作用に基づいて 促進する可能性を Grosse らが報告している。^47-49)  しかしながら、これまで CyDs をタクロリムスの製剤化に応用した例は点眼剤のみであり、^50,51)  タクロリムスの経 口バイオアベイラビリティに対する CyDs の影響を検討した例はない。  また、

CyDs

の Caco-2 細胞障害性およびその単層膜透過性に及ぼす影響に関する報告は

わずかであり、^52,53)

P-gp

を介した薬物の汲み出しおよび P-gp 発現量に対する

CyDs

の影響に関する詳細はまだ明らかでない。

このような背景のもと、本論文の第

1

章では、タクロリムスと各種 CyDs との相 互作用を溶解度法、円二色性および核磁気共鳴スペクトル法を用いて検討した。  第

2

章では、タクロリムスの溶解性および

in vivo

消化管吸収挙動に及ぼす CyDs の 影響について検討した。  また、第

3

章では、DM-β-CyD によるタクロリムスの経 口バイオアベイラビリティ増大効果における P-gp の役割の解明を企図して、

Caco-2

細胞を用いて、タクロリムスの単層膜透過に及ぼす CyDs の影響を各種 P-gp 阻害 剤と比較検討し、さらに、P-gp 発現量に及ぼす CyDs の影響を検討した。  また、

P-gp

の検討に加えて、

P-gp

と同じく小腸上皮細胞に発現し、薬物排出ポンプとして

働く MRP2 に対する CyDs の影響を検討した。  さらに、Caco-2 細胞単層膜にお ける P-gp や MRP2 の細胞膜局在性を明らかにするとともに、これら薬物排出ポン プに対する

DM-β-CyD

の阻害効果におけるカベオラの関与について検討した。  第

4

章では、多剤耐性 Caco-2（Caco-2R）細胞を用いて、Caco-2 細胞の場合と同様の検 討を行った。  なお、Caco-2 細胞は CYP3A の発現が極めて弱いことから、基質と なる薬物の代謝過程の影響を無視できる利点がある。  以下に、本研究で得られた知 見を詳述する。  なお、本研究で用いた CyDs の構造を Table 1 に示す。

Table 1. Chemical Structures of CyD Derivatives Used in This Study

Compound n R

2

, R

3

, R

6

DS

^a)

α-CyD

6 H -

β- CyD

7 H -

γ- CyD

8 H -

DM-β-CyD

^b)

7 R

2

,R

6

=CH

3

,R

3

= H 14

M-β-CyD

^c)

7 H or CH

3

12.5 or 12.6

HP-β-CyD

^d)

7 [CH

2

CH(CH

3

)O]

X

H

(x=0, 1, 2,

‥‥ )

4.8 HB-β-CyD

^e)

7 [CH

2

CH(CH

2

CH

3

)O]

y

H

(y=0, 1, 2,

‥‥

) 2.7, 3.4 or 5.0 SBE-β-CyD

^f)

7 H or (CH

2

)

4

SO

3

Na 3.9 or 6.2

a) The average degree of substitution. ^b) 2,6-Di-Ο^-methyl-β-CyD.

c) Randomly methylated β-CyD. ^d) 2-Hydroxypropyl-β-CyD. ^e) 2-Hydroxybutyl-β-CyD.

f) Sulfobutyl ether β-CyD.

n H

O

H R₃O H

OR₂ H

CH₂OR₆ H

O

n H

O

H R₃O H

OR₂ H

CH₂OR₆ H

O

n H

O

H R₃O H

OR₂ H

CH₂OR₆ H

O H

O

H R₃O H

OR₂ H

CH₂OR₆ H

O

結果 結果 結果

結果と と と と考察 考察 考察 考察

第第第

第 1

1 1 1 章

章章 章    タクロリムスタクロリムスタクロリムスタクロリムスととととシクロデキストリンシクロデキストリンシクロデキストリンシクロデキストリンののの相互作用の相互作用相互作用相互作用

第第第

第 1

1 1 1 節

節節 節    序序序序

臓器移植における最大の問題点は、移植された臓器を非自己として認識し、それ を排除しようとする拒絶反応である。  タクロリムス（Fig. 1）は、

Streptomyces

tsukubaensis

から分離されたマクロライド系抗生物質であり、免疫応答の初期段階

を効果的に抑えることから、様々な臓器移植における拒絶反応抑制剤として臨床応 用されている。¹⁾  しかしながら、タクロリムスは治療域が狭く（5 〜 20 ng/mL）

高濃度では腎毒性や神経毒性などの副作用を惹起することから、最適治療のために は血中濃度モニタリングが必要とされる。  また、市販のタクロリムス経口剤は投 与後の吸収性が低く、患者個々の吸収変動も大きいことから消化管吸収性に優れる 製剤の開発が望まれている。^3,4)  タクロリムスのバイオアベイラビリティの低さや 吸収の大きなバラツキは、タクロリムスの低い溶解度（2.4 〜 3.6 µM、室温）に加 えて患者間の Cytochrome P450 （CYP）による代謝能や P-gp による消化管管腔 側への排泄能の差異などに起因することが報告されている。^5,6)  しかし、これら代 謝・排泄能を外部から人為的に制御するのは困難であり、タクロリムスの消化管吸 収を改善するためには、まず、第一にタクロリムスの溶解性を改善する必要がある。

タクロリムスの溶解性の改善方法としては、これまでに水溶性高分子との固体分散 体形成、界面活性剤や CyD による可溶化を利用した例が報告されているが、^14,15) それらの可溶化機構や物理化学的相互作用様式に関する詳細な検討は行われていな い。  そこで本章では、CyDs による溶解性の改善とその機構解明を企図して、タ クロリムスと各種 CyDs との相互作用を溶解度法、円二色性スペクトル法および核 磁気共鳴スペクトル法を用いて検討した。

第第

第第 2

2 2 2 節

節節節     溶解度法溶解度法溶解度法溶解度法によるによるによるによる検討検討検討 検討 第

第

第第 1

1 1 1 項

項項項     タクロリムスタクロリムスタクロリムスタクロリムスのののの溶解度溶解度溶解度に溶解度ににに及及及及ぼすぼすぼす各種ぼす各種各種各種シクロデキストリンシクロデキストリンシクロデキストリンシクロデキストリンのののの影響影響影響影響

タクロリムスの水への溶解度に及ぼす CyDs の影響を溶解度法を用いて検討した。 

Fig. 4 に示す溶 解度 相図に おい て、 タク ロリム スの 水へ の溶 解度は  

α-CyD、

SBE4-β-CyD

および各種 HB-β-CyDs の添加濃度の増加につれて直線的に増大し、

いわゆる Higuchi らの分類による AL 型を示した。⁵⁴⁾  一方、SBE7-β-CyD では比 較的溶解度の小さい複合体を形成する系にみられる BS 型相図を示した。  その他の 溶解度相図は、

CyDs

添加濃度の増加につれて指数関数的に増大する AP 型相図を示 し、高次複合体の形成が示唆された。  タクロリムスに対する可溶化能は、天然 CyDs 系では γ-CyD < α-CyD < β-CyD の順に大きくなった。  一方、β-CyDs 誘導体の可 溶化能は、

SBE-β-CyDs < HB-β-CyD

≈ 

HP-β-CyD < M-β-CyD

（

DS 12.5） <<

DM-β-CyD

の順に増大し、中でも DM-β-CyD の可溶化能が他の CyDs に比べて著 しく大きかった。

次に、これら溶解度相図の直線あるいは曲線を解析して複合体の安定度定数を算出 した。  直線的な溶解度増加を示す α-CyD、

SBE-β-CyDs

および HB-β-CyDs 系で は、溶解度相図の直線の傾きと切片の値を用いて式（1）より、見かけの

1：1（ゲス

ト：ホスト）複合体の安定度定数（K1:1）を算出した。 

slope

K

1:1

= --- (1) intercept (1 – slope)

一方、AP 型相図を示す CyDs 系については、式（2）〜（7）を用いて解析し、複合 体の安定度定数を算出した。⁵⁵⁾  すなわち、ゲスト分子（タクロリムス）とホスト分 子（CyD）がモル比

1：n

で遂次的に複合体を形成する場合の平衡関係は式（2）で表 され、各複合体の安定度定数（K1:n）は式（3）で定義される。  ここで、

[D]

f、

[CyD]

f

および [D:(CyD)n

]

はそれぞれ遊離形のゲスト分子、遊離形の CyD 分子および ｎ

次複合体のモル濃度を表す。  式（3）を式（4）、（5）に代入するとそれぞれ式（6）、

（7）が得られる。  ここで、[D]0 は [C]t

= 0

における薬物の溶解度、[D]t および

[CyD]

t はそれぞれゲスト分子の総濃度および CyDの総濃度に相当する。  したがっ

て、[CyD]f がわかれば、非線形最小二乗法で式（6）を処理して安定度定数を算出す ることができる。  まず [CyD]f の初期値を [CyD]t と仮定して、式（6）を

simplex

法で解析し、⁵⁶⁾ 各複合体の安定度定数の初期値を見積った。  さらに、この初期値 と既知の [D]0と [D]t 値を用いて式（7）から [CyD]f 値を算出した。  このような 計算を各安定度定数が収束するまで繰り返した。  その結果、モル比

1：2

〜 1：4

（ゲスト：ホスト）複合体形成を仮定したスキームに基づいて解析すると、1：2 複 合体形成を仮定した場合に赤池の情報量基準（AIC）値 ⁵⁷⁾ が最も小さくなり、実測 値が理論値に最もよく適合した。  したがって、本実験条件下では、α-CyD、

HB-β-CyDs

および SBE-β-CyDs 系はモル比

1

：

1

複合体を形成し、それ以外の

CyDs

は

1：1

ならびに

1：2

複合体を形成するものと推察された。

K

1:1

D + CyD D:CyD K

1:2

D:CyD + CyD D:(CyD)

2

(2) K

1:n

D:(CyD)

n-1

+ CyD D:(CyD)

n

[D:CyD]

K

1:1

=

[D]

f

[CyD]

f

[D:(CyD)

2

] K

1:2

=

K

1:1

[D]

f

[CyD]

f2

(3)

[D:(CyD)

n

]

K

1:n

=

K

1:1

K

1:2

••••• K

1:n-1

[D]

f

[CyD]

fn

[D]

t

= [D]

0

+ [D:CyD] + [D:(CyD)

2

] +

^{••••••••••}

+ [D:(CyD)

n

] --- (4) [CyD]

t

= [CyD]

f

+ [D:CyD] +2 [D:(CyD)

2

] +

^{••••••••••}

+n [D:(CyD)

n

] --- (5) [D]

t

= [D]

0

+ K

1:1

[D]

f

[CyD]

f

+ K

1:1

K

1:2

[D]

f

[CyD]

f2

+

K

1:1

K

1:2

K

1:3

[D]

f

[CyD]

f3

+

^{••••••}

+ K

1:1

K

1:2•••••

K

1:n

[D]

f

[CyD]

fn

--- (6) [CyD]

t

= [CyD]

f

+ K

1:1

[D]

f

[CyD]

f

+ 2 K

1:1

K

1:2

[D]

f

[CyD]

f2

+

3 K

1:1

K

1:2

K

1:3

[D]

f

[CyD]

f3

+

^{••••••}

+ n K

1:1

K

1:2•••••

K

1:n

[D]

f

[CyD]

fn

-- (7)

Table 2 に得られた安定度定数を示す。  天然 CyDs の中では、β-CyD

の K1:1、

K

1:2 が他の天然 CyDs に比べて高値を示した。  また、可溶化能が最も大きかった

DM-β-CyD

の

K

1:1値は β-CyD や HB-β-CyD（DS 3.4）に比べてそれぞれ約

12.4

倍、約

7.8

倍の高値を示したが、K1:2は β-CyDの約 1/9 に低下した。  一方、部分 メチル化体である M-β-CyD（DS 12.5）の

K

1:1 値（660 M^-1）は DM-β-CyD の約

1/9

に低下した。

Fig. 4. Phase Solubility Diagrams of Tacrolimus/CyD Systems in Water at 25℃

The excess amount (2 mg) of tacrolimus was added in the vials containing CyDs solutions at various concentrations in water. The vials were shaken at 25°C. After equilibrium was attained (about 7 days), the solution was filtered and the filtrate was analyzed for the drug by HPLC. Each point represents the mean of 3-5 experiments.

Concn. of CyDs (mM)

B B B B

B B

B B

B

0 0.05 0.10 0.15

0 50 100

B: HP-β-CyD 2-hydroxypropylated

Concn. of tacrolimus (mM)

Concn. of CyDs (mM)

E: α-CyD J: β-CyD C: γ-CyD natural CyDs

J J J J J J J

J

0 0.01 0.02 0.03

0 50 100

S S P

P P P

P P P

P P

0 0.02 0.04 0.06

0 50 100

Concn. of CyDs (mM)

S: SBE4-β-CyD P: SBE7-β-CyD sulfobutyl ether

H H H

H H

H H

H H

0 0.5 1.0 1.5

0 50 100

Concn. of tacrolimus (mM)

Concn. of CyDs (mM)

H: DM-β-CyD G: M-β-CyD methylated

Concn. of CyDs (mM)

Concn. of tacrolimus (mM)

HB-β-CyD R: (D.S. 2.7) A: (D.S. 3.4) F: (D.S. 5.0) 2-hydroxybutylated

0 0.05 0.10 0.15

0 50 100

R R

R R

R R

R R

R

F F

F F

F F

F F

F

A A

Concn. of CyDs (mM)

B B B B

B B

B B

B

0 0.05 0.10 0.15

0 50 100

B: HP-β-CyD 2-hydroxypropylated

Concn. of CyDs (mM)

B B B B

B B

B B

B

0 0.05 0.10 0.15

0 50 100

B: HP-β-CyD 2-hydroxypropylated

Concn. of tacrolimus (mM)

Concn. of CyDs (mM)

E: α-CyD J: β-CyD C: γ-CyD natural CyDs

J J J J J J J

J

0 0.01 0.02 0.03

0 50 100

natural CyDs

J J J J J J J

J

0 0.01 0.02 0.03

0 50 100

S S P

P P P

P P P

P P

0 0.02 0.04 0.06

0 50 100

Concn. of CyDs (mM)

S: SBE4-β-CyD P: SBE7-β-CyD sulfobutyl ether

S S P

P P P

P P P

P P

0 0.02 0.04 0.06

0 50 100

Concn. of CyDs (mM)

S: SBE4-β-CyD P: SBE7-β-CyD sulfobutyl ether

H H H

H H

H H

H H

0 0.5 1.0 1.5

0 50 100

Concn. of tacrolimus (mM)

Concn. of CyDs (mM)

H: DM-β-CyD G: M-β-CyD methylated

H H H

H H

H H

H H

0 0.5 1.0 1.5

0 50 100

Concn. of tacrolimus (mM)

Concn. of CyDs (mM)

H: DM-β-CyD G: M-β-CyD methylated

Concn. of CyDs (mM)

Concn. of tacrolimus (mM)

HB-β-CyD R: (D.S. 2.7) A: (D.S. 3.4) F: (D.S. 5.0) 2-hydroxybutylated

0 0.05 0.10 0.15

0 50 100

R R

R R

R R

R R

R

F F

F F

F F

F F

F

A A

Concn. of CyDs (mM)

Concn. of tacrolimus (mM)

HB-β-CyD R: (D.S. 2.7) A: (D.S. 3.4) F: (D.S. 5.0) 2-hydroxybutylated

0 0.05 0.10 0.15

0 50 100

R R

R R

R R

R R

R

F F

F F

F F

F F

F

A A R

R R

R R

R R

R R

F F

F F

F F

F F

F

A A

Table 2. Stability Constants (K

1:1

and K

1:2

)

^a)

of Tacrolimus/CyD Complexes in Water at 25℃

System K

1:1

(M

^-1

) K

1:2

(M

^-1

)

α-CyD

110

± 7

-

β-CyD

490

± 53

70

± 18

γ-CyD

39

± 5

10

± 4

DM-β-CyD 6060

± 460

8

± 2

M-β-CyD (DS 12.5)

^b)

660

± 70

24

± 4

HP-β-CyD (DS 4.8)

^b)

380

± 37

5

± 1

HB-β-CyD (DS 2.7)

^b)

762

± 22

-

(DS 3.4)

^b)

771

± 11

-

(DS 5.0)

^b)

727

± 51

-

SBE4-β-CyD 430

± 15

-

SBE7-β-CyD 420

± 37

-

a)

K

_1:1

: stability constant of 1:1 complex, K

_1:2

: stability constant of 1:2 complex.

b)

The average degree of substitution.

第 第第

第 2

2 2 2 項

項項 項    タクロリムスタクロリムスタクロリムスタクロリムスのののの溶解度溶解度溶解度溶解度ににに及に及及及ぼすぼすぼすぼす温度温度温度温度ののの影響の影響影響影響

Fig. 5 は、安定度定数が最も大きかった DM-β-CyD

系におけるタクロリムスの水

への溶解度に及ぼす温度の影響を示す。  溶解度相図はいずれの温度においても

A

P

型相図を示し、また、Table 3 に示すように、前項の方法に従って求めた複合体の安 定度定数（K1:1）は温度の上昇に伴い低下した。  一方、K1:2値はいずれの温度にお いても

8

〜 10 M^-1の低値を示した。

 

Fig. 6 は K

1:1値の

van’t Hoff

プロットを示し、プロットの直線から求めた複合体 形成の熱力学的パラメータを

Table 4

に示す。  なお、K1:2値の温度依存性は非常に 小さいことから、熱力学的パラメータの算出は困難であった。

Fig. 5. Effect of Temperature on Phase Solubility Diagram of Tacrolimus/DM-β-CyD System in Water

The excess amount (2 mg) of tacrolimus was added in the vials containing DM-β-CyD solutions at various concentrations in water. The vials were shaken at 25 (

E

), 31 (

J

) and 37°C (

C

). After equilibrium was attained (about 7 days), the solution was filtered and analyzed the filtrate was analyzed for the drug by HPLC. Each point represents the mean of 3-4 experiments.

Table 3. Stability Constants of Tacrolimus/DM-β-CyD Complex in Water at 25, 31 and 37℃

Temperature S

0

(M) K

1:1

(M

^-1

) K

1:2

(M

^-1

)

25℃ 1.58 x 10

^-6

6060±460 8±2

31℃ 4.61 x 10

^-6

4160±233 9±2

37℃ 6.68 x 10

^-6

3424±172 10±2

Each value represents the mean±S.E. of 3-4 experiments.

E E E

E E

E E

E

E

J J J J

J J

J

J

J

C C C C

C C

C

C

C

0 0.5 1 1.5

0 50 100

Concn. of DM-β-CyD (mM)

Concn. of tacrolimus (mM)

Fig. 6. The van’t Hoff Plot for Stability Constants (K

1:1

) of Tacrolimus/DM-β-CyD Complex in Water

Table 4. Thermodynamic Parameters for Complexation of Tacrolimus/DM-β-CyD in Water

System

∆G (kJ･mol^-1

)

^a) ∆H (kJ･mol^-1

)

∆S (J･K^-1･mol^-1

)

^a)

Tacrolimus/DM-β-CyD -21.56 -36.59 -50.43

a)

at 25

℃

.

1/T (x 10³ K^-1) ln (K1:1) (M-1 )

E E

E

6 7 8 9

3.15 3.25 3.35

第第

第第 3

3 3 3 節

節節節     円二色性円二色性円二色性円二色性（（（（CD

CD CD CD）

））スペクトル）スペクトルスペクトル法スペクトル法法による法によるによるによる検討検討検討検討

溶解度法による検討から、タクロリムスは

CyDs

と

1：1

ならびに

1： 2

複合体を形 成することが明らかになった。  そこで本項では、タクロリムスと

CyDs

の相互作用 を

CD

スペクトル法を用いて検討した。  なお、CyDs は安定度定数が大きかった β-CyDs 系列を用いた。 

Fig. 7

は、

1％（v/v）メタノール水溶液中における

β-CyDs 存在または非存在下におけるタクロリムスの CD スペクトルを示す。  タクロリム

スは

220 nm

および

290 nm

付近にそれぞれ正および負のコットン効果を与え、その

強度は β-CyDs 添加により低下した。

Fig. 7. CD Spectra of Tacrolimus (10 µM) in the Absence and Presence of

β-CyDs (1 mM) in 1% (v/v) Methanol/Water at 25℃

Wavelength (nm) [

θ

]

λ

(x 10

4

de g

･

cm

2

/d mo le)

with DM-β-CyD with M-β-CyD with HP-β-CyD with β-CyD Tacrolimus alone -9

-6 -3 0 3 6

200 250 300 350

Wavelength (nm) [

θ

]

λ

(x 10

4

de g

･

cm

2

/d mo le)

with DM-β-CyD with M-β-CyD with HP-β-CyD with β-CyD Tacrolimus alone with DM-β-CyD with M-β-CyD with HP-β-CyD with β-CyD Tacrolimus alone -9

-6 -3 0 3 6

200 250 300 350

-9 -6 -3 0 3 6

200 250 300 350

第第第

第 4

4 4 4 節

節節 節    核磁気共鳴核磁気共鳴核磁気共鳴核磁気共鳴（（（NMR（

NMR NMR NMR）

）））スペクトルスペクトルスペクトルスペクトル法法法法によるによるによるによる検討検討検討検討

  タクロリムス/CyDs 複合体の包接様式を解明するために¹

H‑NMR

法を用いて検討 した。  一般に、薬物と

CyD

との相互作用を¹

H-NMR

スペクトルを用いて評価する には、水系の溶媒が望ましい。  しかしながら、前述したように、タクロリムスの水 への溶解度は極めて低い（2.4〜3.6 µM、室温）ため、重水を溶媒に用いた

NMR

測 定は困難であった。  そこで本研究では、重メタノール/重水系を用いて検討した。 

なお、重メタノール/重水系におけるタクロリムスの¹

H-シグナルは、重クロロホルム

中で測定された既知データ⁵⁸⁾ に基づいて帰属した。 

Fig. 8 は各種

β-CyDs（30 mM）を添加したときのタクロリムス（5 mM）の

1

H-NMR

スペクトルを示す。  β-CyDs を添加するとタクロリムスの

1.2

〜 3.0 ppm 付近のシグナルパターンに変化がみられたが、

3 ppm

以下の低磁場領域ではタクロリ ムスと β-CyDs のピークが重なるため、定量的な解析は困難であった。 

Fig. 9 は

50%（v/v）重メタノール/重水中におけるタクロリムスの

¹

H-ケミカルシフトに及ぼ

す β-CyDs の影響を示す。  なお、Fig. 9 中のシフト変化は、3種の β-CyDs 添加 系で帰属可能なプロトンのみを示す。 

Fig. 9

から明らかなように、シフト変化は

3

種類の

CyDs

の中で DM-β-CyD を添加したときが最も大きかった。

  次に、タクロリムスの¹

H-ケミカルシフトに及ぼす DM-β-CyD

濃度の影響を検討 した結果を

Fig. 10

に示す。  タクロリムスの大部分のプロトンは DM-β-CyD 添加 により低磁場シフトし、その大きさは DM-β-CyD 濃度の増加に伴ない増大した。 

また、タクロリムス分子中の

3、5、 6

位の炭素を含むピペリジン環、

17

位と

19

位の メチル基、29、30 位のプロトンが大きく低磁場シフトし、16 位および

31

位のプロ トンは高磁場シフトした。 

Fig. 11

はタクロリムスの¹

H-NMR

スペクトルに及ぼす 重メタノールの影響を示す。  重メタノールの含量が増加するとタクロリムスの大部 分のプロトンは低磁場シフトした。  しかしながら、16位および

31

位水素は重メタ ノール添加の場合と対照的に DM-β-CyD を添加すると高磁場シフトした。

Fig. 8.

¹

H-NMR Spectra of Tacrolimus (5 mM) in the Absence and Presence of

β-CyDs (30 mM) in 50% (v/v) CD3

OD/D

2

O at Room Temperature

5 4 3 2 1 ppm

tacrolimus alone

with DM- β -CyD

with HP- β -CyD

with M- β -CyD

5 4 3 2 1 ppm

5 4 3 2 1 ppm

tacrolimus alone tacrolimus alone

with DM- β -CyD

with HP- β -CyD

with M- β -CyD

∆δ (ppm

) m) (pp ∆δ 1

F ig. 9. H -N M R C h e m ic al S h if t C h an ge s of T a cr o lim u s ( 5 m M ) b y th e A d di ti on of

β

-C yD s (3 0 m M ) i n 5 0 % ( v /v ) CD OD /D O a t R o om T e m p er a tu re

32

: D M -

β

-C yD , : HP -

β

-C yD , : M-

β

-C yD .

∆δ= δwith CyDs-δdrug alone. Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

OH

CH3 CH3 ・・・・H2OOOH H3C OCH3

OOO

O 1 8 9 10 11 12 13 14

18

1920

21 35

3637

23 2224 252627 O

H3C N

23

4 5 67

2829 30

3132

33 34HO H3CO CH3

17 OCH3

1516

∆δ (ppm

) m) (pp ∆δ 1

F ig. 9. H -N M R C h e m ic al S h if t C h an ge s of T a cr o lim u s ( 5 m M ) b y th e A d di ti on of

β

-C yD s (3 0 m M ) i n 5 0 % ( v /v ) CD OD /D O a t R o om T e m p er a tu re

32

: D M -

β

-C yD , : HP -

β

-C yD , : M-

β

-C yD .

∆δ= δwith CyDs-δdrug alone. Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

. F ig. 9.

1

H -N M R C h e m ic al S h if t C h an ge s of T a cr o lim u s ( 5 m M ) b y th e A d di ti on of

β

-C yD s (3 0 m M ) i n 5 0 % ( v /v ) CD

3

OD /D

2

O a t R o om T e m p er a tu re : D M -

β

-C yD , : HP -

β

-C yD , : M-

β

-C yD .

∆δ= δwith CyDs-δdrug alone. Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

OH

CH3 CH3 ・・・・H2OOOH H3C OCH3

OOO

O 1 8 9 10 11 12 13 14

18

1920

21 35

3637

23 2224 252627 O

H3C N

23

4 5 67

2829 30

3132

33 34HO H3CO CH3

17 OCH3

1516

OH

CH3CH3 CH3 ・・・・H2OOOH H3C OCH3

OOO

O 1 8 9 10 11 12 13 14

18

1920

21 35

3637

23 2224 252627 O

H3C N

23

4 5 67

2829 30

3132

33 34HO H3CO2829 30

3132

33 34HO H3CO CH3

17 CH3

17 OCH3

1516

F ig . 1 0 . E ffe c t o f D M -

β

-C yD C o nc e n tr a ti o n o n

1

H -N M R C h em ic a l S h if t C h a n ge s of T a cr ol im u s ( 5 m M ) i n 50% (v /v ) C D

3

OD /D

2

O a t R oom T e m per a tu re : 5 m M , : 1 0 m M , : 3 0 mM .

∆δ= δwith CyDs-δdrug alone. Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

∆δ (ppm

) 1

F ig . 1 0 . E ffe c t o f D M -

β

-C yD C o nc e n tr a ti o n o n H -N M R C h em ic a l S h if t C h a n ge s of T a cr ol im u s ( 5 m M ) i n 50% (v /v ) C D OD /D O a t R oom T e m per a tu re

32

: 5 m M , : 1 0 m M , : 3 0 mM .

∆δ= δwith CyDs-δdrug alone. Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

F ig . 1 0 . E ffe c t o f D M -

β

-C yD C o nc e n tr a ti o n o n

1

H -N M R C h em ic a l S h if t C h a n ge s of T a cr ol im u s ( 5 m M ) i n 50% (v /v ) C D

3

OD /D

2

O a t R oom T e m per a tu re : 5 m M , : 1 0 m M , : 3 0 mM .

∆δ= δwith CyDs-δdrug alone. Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

∆δ (ppm )

∆δ (ppm

) 1

F ig . 1 1 . E ffe c t o f C D O D C o n c e n tr at io n on H -N M R C h em ic al S h if t C h a n ge s of T a cr ol im u s ( 5 m M ) at R oom

3

Te m p e ra tu re

a)

: w ith 3 0 m M DM -

β

-C yD i n 5 0 % ( v/ v ) C D OD /D O ,

32 b)

: in 7 5 % ( v /v ) CD OD /D O .

32 a) ∆δ=δwithCyDsin 50% v/v CDOD/DO-δdrugalone in 50% v/v CDOD/DO,3232 b)∆δ= δdrugalone in 70% v/v CDOD/DO-δdrugalone in 50% v/v CDOD/DO. 3232 Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

∆δ (ppm

) 1

F ig . 1 1 . E ffe c t o f C D O D C o n c e n tr at io n on H -N M R C h em ic al S h if t C h a n ge s of T a cr ol im u s ( 5 m M ) at R oom

3

Te m p e ra tu re

a)

: w ith 3 0 m M DM -

β

-C yD i n 5 0 % ( v/ v ) C D OD /D O ,

32 b)

: in 7 5 % ( v /v ) CD OD /D O .

32 a) ∆δ=δwithCyDsin 50% v/v CDOD/DO-δdrugalone in 50% v/v CDOD/DO,3232 b)∆δ= δdrugalone in 70% v/v CDOD/DO-δdrugalone in 50% v/v CDOD/DO. 3232 Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

F ig . 1 1 . E ffe c t o f C D

3

O D C o n c e n tr at io n on

1

H -N M R C h em ic al S h if t C h a n ge s of T a cr ol im u s ( 5 m M ) at R oom Te m p e ra tu re : w ith 3 0 m M DM -

β

-C yD i n 5 0 % ( v/ v ) C D

3

OD /D

2

O

a)

, : in 7 5 % ( v /v ) CD

3

OD /D

2

O

b)

.

a) ∆δ=δwithCyDsin 50% v/v CD3OD/D2O-δdrugalone in 50% v/v CD3OD/D2O, b)∆δ= δdrugalone in 70% v/v CD3OD/D2O-δdrugalone in 50% v/v CD3OD/D2O. Positive and negative signs indicate downfield and upfielddisplacements, respectively

.

第第

第第 5

5 5 5 節

節節節     考察考察考察考察

第

1

章では、CyDs による溶解性の改善とその機構解明を企図して、タクロリム スと各種 CyDs との相互作用を溶解度法、円二色性スペクトル法および核磁気共鳴 スペクトル法を用いて検討した。

まず、タクロリムスに対する各種

CyDs

の可溶化能を溶解度法により検討し、得ら れた溶解度曲線より安定度定数を算出した（Fig. 4、Table 2）。  天然

CyDs

系にお けるタクロリムスに対する可溶化能および安定度定数は、 γ-CyD < α-CyD < β-CyD の順に大きくなり、CyDs と相互作用するタクロリムスの疎水性残基は β-CyD の空 洞径に最も良く適合するものと推定された。  一方、β-CyDs 誘導体では、

DM-β-CyD

の可溶化能および安定度定数が他の CyDs に比べて著しく大きかった。  これは

DM-β-CyD

空洞の疎水空間が長いことや界面活性を有するため、安定な複合体を形

成することに起因するものと推察される。  また、

DM-β-CyD

の

K

1:1値は β-CyD や

HB-β-CyD（DS 3.4）に比べてそれぞれ約 12.4

倍、約

7.8

倍の高値を示したが、K1:2

は β-CyD の約 1/9 に低下した。  これらの結果は、DM-β-CyD がタクロリムスと モル比

1：1

の安定な複合体を形成することを示唆する。  一方、部分メチル化体で ある M-β-CyD の

K

1:1 値（660 M^-1）は、DM-β-CyD の約

1/9

と著しく低かった。 

これは、M-β-CyD の水酸基がランダムにメチル化された誘導体の多成分混合物であ るため、包接能の低い高置換体や低置換体の寄与が大きいことに起因するものと推察 される。  置換度が小さい β-CyDs 誘導体（例えば、無置換体、メチル化体、ヒド ロキシプロピル化体）はモル比 1：2 の高次複合体を形成したが、置換基のサイズが 大きくなると（例えば、ヒドロキシブチル化体、スルホブチル化体）1：1 複合体を 形成した。  これは、アルキル側鎖が長くなると

1：1

複合体へ

2

つ目の

CyD

分子 の接近が立体的に阻害されることによるものと考えられる。  また、

SBE-β-CyDs

の

K

1:1 は β-CyD や HB-β-CyD より低値を示した。  これは SBE-β-CyDs における スルホブチル基の負電荷がタクロリムスとの相互作用を低下させるものと考えられ る。 

HP-β-CyD

の K1:1 および K1:2 は β-CyD に比べて低値を示した。  これは、