Temperatuer(℃)

R e s id u a l a c tiv ity (% )

2．β-キシロシダーゼ Iの熱安定性

 本酵素は 40℃以下の熱処理において 93％以上の残存活性を示した。温度が 40℃以 上になると残存活性は急激に下がり、60℃以上になると完全に活性を失った（Fig. 3-7）。

Fig. 3-7. Thermostability of β-xylosidase I.

β-Xylosidase I was incubated at various temperatures for 10 min, and then residual activities were assayed.

3．β-キシロシダーゼ Iの活性に与える pHの影響

本酵素はそれぞれ pH7.0で最も高い活性を示した(Fig. 3-8)

。

Fig. 3-8. Effects of pHs on enzyme activity.

β-Xylosidase I was assayed in 100 mM buffer of various pHs containing 2 mM

p-nitrophenyl-β-xylopyranoside. The buffers used were: ▲, acetic acid-sodium acetate; ●, sodium-potassium phosphate; ○, Tris-HCl; and △, Na₂CO₃-NaHCO₃.

0 20 40 60 80 100 120

2 5 8 11 14

pH

R e la tiv e a c tiv ity (% )

0 20 40 60 80 100 120

0 5 10 15

pH

R e la tiv e a c tiv ity (% )

4．β-キシロシダーゼ Iの pH安定性

本酵素は、pH 6.0〜7.6において、4℃、24時間処理した場合、 20 mMのリン酸溶 液において 82％以上の残存活性を示したが、20 mMの Tris-HCl溶液と酢酸溶液および 炭酸溶液において、ほぼ活性を示さなかった(Fig. 3-9)。

Fig. 3-9. Effects of pHs on the stability of xylosidase I.

Xylosidase I was incubated in 100 mM buffers of various pHs at 4℃ for 24 h, and then residual activities were assayed. The buffers used were: ▲, acetic acid-sodium acetate; ●, sodium-potassium phosphate; ○, Tris-HCl; and △, Na₂CO₃-NaHCO₃.

（3）β-キシロシダーゼI の NH2-末端アミノ酸配列

β-キシロシダーゼ Iの NH2-末端アミノ酸配列は MNITNPVLXGFNPDであった。

（4）β-キシロシダーゼI の酵素活性に与える各種試薬の影響

β-キシロシダーゼ I活性に与える各種試薬の影響を Table 3-2に示す。調べた試薬の

中では、Hg²⁺、Ag²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺が酵素活性を著しく阻害した。一方、SH試薬である PCMB、PCMB、CH₂ICOOHや、キレ-ト剤である EDTAおよび変性剤であるSDSはほ とんど本酵素活性を阻害しなかった。

      Table 3-2. Effect of chemical regents on β-xylosidase I activity        

Compound¹ Residual activity（%）

None 100

FeSO₄・7H₂O 67

FeCl3・6H2O 73

CaCl2・7H2O 100

HgCl2 24

PbCl2 93

CuSO₄・5H₂O 24

AgNO₃ 23

MnSO₄・4-5H₂O 72

CoCl₂・6H₂O 83

NiSO₄・6H₂O 87

ZnSO4・7H2O 24

MnCl2・7H2O 72

BaCl2・2H2O 76

CH2ICOOH 93

PCMB² 46

PMSF³ 108

EDTA 100

SDS 90

1The incubation was performed at the concentration of 1 mM compound.

2PCMB, p-chloromercuribenzoic acid.

3PMSF, phenylmethyl sulfonyl fluoride.

第 6 節 キシラナーゼとβ-キシロダーゼの生産に与える D-グルコースの影響

【方法】

  B. pumilus X-6-19 strain U-3 株を 30℃において、Table 1-1に示す 500 mLの液体培地

（3 Lコルベンを使用）を用いて振盪培養した。この時、1% (w/v) D-グルコースを含 む培地と含まない培地を使用し、それぞれの培地から経時的に培養液をサンプリング

した後、遠心分離（2,000xg、10分、4℃）した。上清中のキシラナーゼ活性および沈 殿した菌体中のβ-キシロシダーゼ活性を測定した。菌体の破砕は本章第 3 節に示す方 法によって行った。

【結果】

Fig. 3-10に示すように、D-グルコースを含む培地で増殖した B. pumilus X-6-19 strain U-3株のβ-キシロシダーゼ活性の生合成は著しく抑制された。一方、キシラナーゼは、

D-グルコー スを加えた培地においても D-グルコースを加えない培地とほぼ同じ活 性 を示した。

Fig. 3-10. Synthesis of xylanase (A) and β-xylosidase (B) in the presence (■) and absence (●) of D-glucose.

第 7節 要約と考察

【要約】

  B. pumilus X-6-19 strain U-3株は β-キシロシダーゼを細胞内に蓄積し、培養上清中に はほとんど分泌しなかった。本酵素を本菌の細胞抽出液から、除核酸、硫安分画、DE52 cellulose、DEAE-Toyopearl 650S、Phenyl-Toyopearl 650Mを用いたカラムクロマトグラ フィーにより電気泳動的に単一に精製した。本酵素は、DEAE-Toyopearl 650Sカラム クロマトグラフィーにおいて、二つのピークが見られ、それぞれキシロシダーゼI、II と命名した。両酵素とも分子量 10〜12万のホモダイマーであった。

β-キシロシダーゼⅠの NH₂-末端アミノ酸配列はMNITNPVLXGFNPD であった。

β-キシロシダーゼⅠの至適pHは 7.0、40℃で最大活性を示した。また、pH6.0〜7.6、

40℃まで安定であった。本酵素はHg²⁺、Ag²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺により著しく阻害されたが、

PMSF、CH₂ICOOH、EDTAなどには阻害されなかった。

  B. pumilus X-6-19 strain U-3株のいて、D-グルコースが存在するとβ-キシロシダーゼ の生合成は抑制さたが、キシラナーゼの生合成は抑制されなかった。

【考察】

  β-キシロシダーゼは菌体内に蓄積し、培養液中にはほとんど分泌しないことがわか った。本酵素はexo 型でキシランやキシロオリゴ糖の非還元末端からキシロース単位 で加水分解酵素であるから、キシロオリゴ糖を生産する目的のためには、マイナスと なる。

  B. pumilus X-6-19 strain U-3株の親株は D-グルコースやラクトースが存在すると、グ ルコース効果によりキシロオリゴ糖の生成が抑制された（第 1章）。しかし、変異株で ある U-3株は、D-グルコースが存在し、これを炭素源やエネルギー源として利用する にもかかわらず、キシロオリゴ糖の生成は抑制されなかった。さらに、U-3株は、グ ルコースが存在するとβ-キシロシダーゼの生合成は抑制されるのに、キシラナーゼの 生合成は抑制されないことが示された。これらの性質は長鎖キシロオリゴ糖を生産す る上で、極めて有効な要素と考察した。 

 本酵素の NH2-末端アミノ酸配列は、14 残基までの比較において、B. pumilus IPO²⁶⁾、 B. pumilus PLS^27,28)、Butylrivibrio fibrisolvens²⁹⁾、Bacillus sp. KK-1³⁰⁾とそれぞれ、85.7、

78.6、70.0、78.6%の identity を示した。

第 4章 キシラナーゼによるキシロオリゴ糖の生産

第 1 節 序

本章では、Bacillus pumilus X-6-19 strain U-3株由来キシラナ-ゼの最終調製酵素標品 を用いて、キシランからキシロオリゴ糖の生産性を分析することとした。キシロース は endo型のキシラン分解酵素であるが、その分解生産物であるキシロオリゴ糖の鎖長 は酵素の種類によって異なる。本菌の培養液に蓄積するキシロオリゴ糖は長鎖の割合 が多いが、精製したキシラナーゼ標品を使用してキシロースからキシロオリゴ糖を生 産させ、キシロオリゴ糖を分析することにより、本菌の特性が裏付けられることが期 待できる。 

第 2節 酵素反応の条件

【方法】

  1% (w/v) キシランを含む50 mM リン酸ナトリウムカリウム緩衝液（pH7.0）7.5 mL にキシラナーゼの最終調製酵素標品 13μg を加え、30℃で反応を行った。反応開始0、 1、2、6、18 、24時間後に酵素反応液 0.5 mLをサンプリングし、生成したキシロオ リゴ糖を TLCにより分析した。TLC分析は第 2 章第 2 節で述べた方法で行った。

【結果】

酵素反応生産物をTLCにより分析したところ、反応時間が進むにつれてキシロトリ オース以上のキシロオリゴ糖の割合が高くなることがわかった。また、酵素反応は反 応開始 18時間後にほぼ完了することがわかった。

第 3 節 キシロオリゴ糖のHPLC による分析

【方法】

 本章第 2節で述べた方法によって 24時間酵素反応を行った後、酵素反応液を遠心分 離（12,000xg、10分、4℃）し、上清を回収した。上清を濃縮後、Shodex NH2P-50 4E カラム（4.6×250 mm、Shoko Co., Ltd., Tokyo）を装備した日立高速液体クロマトグラ フ（Hitachi）により分析した。用いた溶離液はアセトニトリル：水（65：35、v/v）、

流速は 0.5 mL/min; and detection、キシロオリゴ糖の検出は示差屈折計を用いて行った。

【結果】

  Fig. 4-1に示すように、酵素反応溶液中から、キシロビオース、キシロトリオース、

キシロテトラオース、キシロペンタオースが、検出された。キシロースは検出されな かった。また、未同定ではあるが、キシロヘキサオース、ヘプタオースなどと予想さ れる長鎖キシロオリゴ糖が見いだされた。

Fig. 4-1 HPLC analysis of reaction products with the purified xylanase.

The enzyme reaction was conducted as described in the legends of Fig. 4-2. The reaction mixture incubated for 24 h was concentrated on a evaporator. The concentrated sample was analyzed under the following conditions: column, Shodex NH2P-50 4E (Shoko Co., Ltd., Tokyo); mobile phase, CH3CN-H2O（65：35, v/v ）; flow rate, 0.50 mL/min; and detection, refractive index.

Symbols: M, marker; X1, xylose; X2, xylobiose; X3, xylotriose; X4, xylotetraose ; and X5, xylopentaose.

第 4節 要約と考察

【要約】

B. pumilus X-6-19 strain U-3株の培養液から得たキシラナーゼの精製標品は、キシラ

ンからキシロトリオース以上の長鎖を多量に含むオリゴ糖を生成した。キシロースの 生成は見られなかった。

【考察】

キシラナーゼによって生産されたキシロオリゴ糖の組成を調べたところ、キシロト リオース以上の長鎖オリゴ糖を多量に含むことがわかった。また、キシロースによる キシロビオースの生成量は B. pumilus X-6-19株やその変異株 U-3株の培養液中のオリ ゴ糖に比べて、すくなこと、また、キシロースの生成が見られないことは、B. pumilus

X-6-19 strain U-3株の生産するキシラナーゼによるキシロオリゴ糖生産の有利な点で

ある。

B. pumilus X-6-19 strain U-3 株由来キシラナーゼは、B. pumilus IPO株 ²³⁾や

Trichoderma longibrachiatum株 ³⁰⁾由来キシラナーゼに比べ、長鎖オリゴ糖の生産量が 多いことがわかった。

B. pumilus X-6-19株やその変異株 U-3株の培養液中には長鎖オリゴ糖が多く含まれ

ており（Fig. 1-1 など）、このような結果は、これらの菌株が生産するキシラナーゼの 特性によるもであるといえる。

総括

本論文では、キシロオリゴ糖高生産性菌を選択し、本菌の生産する長鎖キシロオリ ゴ糖を効率的、かつ多量に得ることを目的として研究を進め、次のような成果を得る ことができた。 

B. pumilus X-6-19株は、培養液中にキシロトリオース（X3）以上の長鎖オリゴ糖を

含むオリゴ糖を蓄積することを見いだした。B. pumilus X-6-19 が、長鎖キシロオリゴ 糖をより効率的に生産するための培養条件を検討した結果、1% (w/v) 酢酸ナトリウム 三水和物を添加することにより、コントロールと比較して 1.5倍量の長鎖キシロオリ ゴ糖を生産することがわかった。さらに長鎖キシロオリゴ糖の生産量を上げるため、

紫外線照射および、NTG処理によりキシロオリゴ糖高生産性変異株の取得を試みた。

その結果、得られた変異株 4,170株中、長鎖キシロオリゴ糖を親株の 3.2倍量生産す るキシロオリゴ糖高生産性変異株 U-3株を取得することが出来た。

B. pumilus X-6-19のキシロオリゴ糖蓄積に与える種々の炭素源の影響を調べた際、

D-グルコースやラクトース一水和物を添加した時、キシロオリゴ糖の生産が抑制され た。これはグルコース効果により、キシラン分解酵素系の発現が抑制されたためであ ると考えられる。しかし、変異株 U-3株は親株と比較して培養開始後早い時期にグル コースを完全に利用しており、グルコース存在下でもキシラン分解酵素が発現するよ うな変異が遺伝子内部で生じたものと思われる。

  B. pumilus X-6-19 strain U-3株の生産するキシラナーゼを、硫安分画、CM52 cellulose、

CM-Toyopearl 650Sを用いたカラムクロマトグラフィーにより、電気泳動的に単一に

精製した。本酵素は、分子量 26,000のモノマーであった。本酵素の至適 pH 6.0であ り、55℃において最大活性を示した。また、pH 6.0〜9.0、45℃まで安定であった。本 酵素は native PAGEの結果から、等電点が pH 8.3よりも高い塩基性タンパク質であっ た。

  Wongら ^19）は、真菌、細菌由来キシラナーゼの分子量や等電点など物理化学特性に 基づき、キシラナーゼを分子量 30,000以下で弱塩基性性キシラナーゼと分子量30,000 以上で弱酸性キシラナーゼに分類した。また、Henrissat^20）は、疎水性クラスター分析 によって、キシラナーゼを F/10 および G/11 の二つのファミリーに分類した。それぞ れには、高分子量キシラナーゼと低分子量キシラナーゼが属する。一般に、高分子量 キシラナーゼは、キシランに対する加水分解速度が速く、生産物に低分子キシロオリ ゴ糖が多い。一方、低分子キシラナーゼは、基質に対する加水分解速度は遅いが、加 水分解生産物に長鎖キシロオリゴ糖が多い。B. pumilus X-6-19 U-3株が生産するキシ ラナーゼは、G/11 の低分子量キシラナーゼファミリーに分類され、長鎖キシロオリゴ