Control Rapamycin 3-MA
HOS
B
CYTO-IDHoe33342
025/12018
図４
B
ControlPSM (100 %)
CYTO-ID
BF MitoTracker Overlay
A
A375
ControlPSM (100 %) 18/1683
CYTO-ID
BF MitoTracker Overlay
Figure 1
114/12786
TRAIL
025/12045
022/11852
022/11964
022/11955
Control
MitoTracker
A375 18/1673
Overlay
25/12045
C
BF CYTO-ID図５
ControlRapamycin3-MA
Cyt-ID MitoTracker Overlay Zoom
HOS
PSM (100 %)PSM (25 %)
Figure 2
A2058
PSM (25%)PSM (100%)Control
A
B
図６
pmTOR P62
GAPDH
PSM 25% PSM 100%
LC3-I/II
C 12 24 36 48 72 (h) C 12 24 36 48 72 (h)
Figure 3
A B
0 20 40 60 80 100 120
A2058
Viability (%)
0 20 40 60 80 100 120
HOS
Viability (%)
143B
D
143B
ControlPSM (100 %)PSM (25 %)
CYTO-ID
BF MitoTracker Overlay
C
図７
✳ ✳
✳
(h)
0 20 40 60 80 100
120 MG63
Viability (%)
0 20 40 60 80 100
120 SAOS-2
Viability (%)
A
B
Figure 4
Viability (%)
C
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
100 HOS
図８
✳ ✳
✳ ✳
✳
0 20 40 60 80 100 120
140 HOS
Viability (%)
0 20 40 60 80 100 120 140
160 HOS
Viability (%)
A B
0 20 40 60 80 100
120 143B
0 20 40 60 80 100 120
140 143B
Viability (%) Viability (%)
C D
0 20 40 60 80 100 120
140 A2058
Viability (%) Viability (%)
0 20 40 60 80 100 120
140 A2058
E F
Figure 5 図９
✳ ✳
✳
✳
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Control TRAIL 3-MA 1.3 3-MA 2.5 3-MA 5 TRAIL + 3-MA 1.3 TRAIL + 3-MA 2.5 TRAIL + 3-MA 5 CQ 100 CQ 300 TRAIL + CQ 100 TRAIL + CQ 300 Baf 100 Baf 300 TRAIL + Baf 100 TRAIL + Baf 300 A2058
Viability (%)
0 20 40 60 80 100 120
Control TRAIL 3-MA 1.3 3-MA 2.5 3-MA 5 TRAIL + 3-MA 1.3 TRAIL + 3-MA 2.5 TRAIL + 3-MA 5 CQ 100 CQ 300 TRAIL + CQ 100 TRAIL + CQ 300 Baf 100 Baf 300 TRAIL + Baf 100 TRAIL + Baf 300 SAOS-2
Viability (%)Viability (%)
0 20 40 60 80 100 120 140
HOS
Viability (%)
0 20 40 60 80 100 120
SAOS-2
Figure 6
A B
C D
図１０
✳ ✳ ✳ ✳
025/12045 ControlTRAIL3-MA
Cyt-ID MitoTracker Overlay Zoom
TRAIL + 3-MA
HOS
Figure 7 図１１
PSM
Apoptosis TRAIL
Mitochondrial fragmentation
Apoptotic Cell death
Mitochondrial clustering
Autophagy (toxic) Autophagy
(protective)
Non-apoptotic Non-autophagic death
Autophagic death
apoptosis-resistant cancer cells Inhibition
Flow
Promotion Cell death
Figure 8
TRAIL 3-MA 3-MA
CQ
図１２
図1. PSMの腫瘍選択性（ 参考文献1より引用 ）
（A）各種細胞株をPSM単独培地で培養した場合の細胞生存率。HDFおよびMelanocytes
では有意な細胞死は見られない。A375（ 悪性黒色腫 ）、A549 ( 肺癌 )、MG63（ 骨肉腫 ） 細胞株では有意な細胞死が見られる。***P < 0.001
（B）Annexin ⅤとPropidium iodide染色を用いたフローサイトメトリー。Mediumおよ びPSM単独培地でそれぞれ48時間培養を行った場合、A375細胞株に比してHDF細胞株
ではAnnexin Ⅴ陽性細胞が少ない事がわかる。
図2. 低温大気圧プラズマ照射装置（ 参考文献１より引用 ）
(A)(B) 低温大気圧プラズマ照射装置の模式図 (C) 実際に実験で使用している装置
(D) ガラス管先端より発生したプラズマをmediumへ向かって照射している
図3. PSMによるバックグラウンドオートファジーの抑制
(A)(B) A375, HOS細胞株ではPSM処理によってバックグラウンドのCYTO-IDドットが 著名に減少した。このCYITO-IDドットはrapamycinにて著しく増加し、3-MAにて完全 に消失した。
図4. (A)(B) HOS, A549細胞株はPSMによって障害され、CYTO-IDドットは著名に減少 している。(C) HDFではCYTO-IDドットを認めず、PAM処理による変化もない。
図5. PSM処理によるミトファジーの誘導
(A)(B) 未処理の細胞ではミトコンドリアとオートファゴソームの局在は保たれる。PSM
処理をした細胞ではミトコンドリアが断片化・凝集し、CYTO-IDドットがクラスターを形 成する。オーバーレイ像では黄色の蛍光が見られ、ミトファジーが誘導されている。
(C) TRAIL処理ではミトファジーは観察されていない。
図6. PSM濃度別での蛍光顕微鏡像
(A) 高濃度 PSM 処理ではミトコンドリアの断片化・クラスター形成ならびにミトコンド
リアとオートファゴソームの共在が見られる。低濃度 PSM 処理ではバックグランド
CYTO-ID ドットは減少するが、ミトコンドリア形態には変化がない。Rapamycin 処理で
はオートファゴソームが増加し、その一部はミトコンドリアと共存している。
(B) 高濃度PSM処理では点状となったミトコンドリアの凝集が、低濃度PSM処理ではミ
トコンドリアの短縮化が観察される。
図7.
(A) PSM濃度別での細胞生存率
高濃度 PSM では細胞死が誘導されるが、低濃度 PSM では細胞死は誘導されていない ( n=3 )。✳P＜0.05
(B) WBによるオートファジー関連分子の動態解析
低濃度 PSM 処理では p62 分子のタンパク質レベルが添加後 24〜48 時間でしているが、
LC3-Ⅱレベルは増加しない。高濃度PSM処理では添加後36〜48時間で両者のレベル増加
が見られる。
図8. PSM＋オートファジー阻害剤処理時の細胞生存率
(A)(C) HOS・MG63細胞株では、3-MA ( 5mM )ならびにBaf ( 100nM )両者でPSMによ る細胞死が抑制された。(B) SAOS-2細胞では3-MAでは効果が見られなかったが、Bafで 細胞死が抑制された（ n=3 ）。✳P＜0.05
図9. PSM＋オートファジー阻害剤or全カスパーゼ阻害剤・抗酸化剤処理時の細胞生存率.
(A)(C)(E) HOS, 143B, A2058細胞株に対してPSM＋3-MA（ 5mM ）, CQ ( 25μM ), Baf
( 100nM )で処理したが、PSMによる細胞死はどの場合も保たれた( n=3 )。
(B)(D)(E) 同様の細胞株に対してPSM＋MnTBAP ( 30μM ), z-VAD-FMK ( 10μM ) で 処理した。A2058 以外では MnTBAP によって PSM による細胞死が抑制されている。
z-VAD-FMKでは細胞死は抑制されない ( n=3 )。✳P＜0.05
図10. TRAIL処理時の細胞生存率
(A)(B) TRAIL 単独処理ではいずれの細胞でも生存率は低下しない。3-MA ( 1.3mM, 2.5mM, 5mM )およびCQ ( 100μM, 300μM ) は濃度依存的に生存率を減少させる( n=3 )。
(C)(D) 3-MA 併用により TRAIL による細胞死が増強するが、HOSではこの増強効果が
z-VAD-FMKによって抑制された。SAOS-2では抑制されなかった( n=3 )。✳P＜0.05
図11. TRAILと3-MA併用時の蛍光顕微鏡画像
TRAIL 単独は CYTO-IDドットを増加させ、3-MAはそれらを消失させた。ミトコンドリ
アはTRAILによって過剰融合し、一方3-MAによって分裂し、凝集した。しかし、いずれ
の場合でも CYTO-IDドットはミトコンドリアと別な位置に観察された。TRAILと3-MA を併用すると、CYTO-IDドットは大きなクラスターを形成しミトファジーを誘導した。
図12. PSMは異なる種類の細胞死を誘導する
PSMは非アポトーシス/非オートファジー細胞死に加えて、細胞障害性オートファジーが関 連した細胞死を誘導する可能性が示唆された。また、TRAIL と 3-MA を併用した場合、
TRAILにおける腫瘍抵抗性が解除され、細胞死が誘導されたと考えられる。
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研究業績
Ⅰ 発表 ①一般発表 5（ 単4 / 共1 ） ②特別発表 なし
Ⅱ 論文 ①原著論文 なし ②症例報告 なし ③総説 なし
Ⅲ 著書 なし
以上