4−1．緒言
本4章では、第3章で述べたPS−3DOSとPDMSウェル中PS−3DOSを、微小液滴ELISA
に応用した。
微小液滴ELISAは、インクジェットで形成した微小液滴で一連の操作を行うため、一般 的な96穴マイクロプレートを用いて行うELISAに比べて試薬及び試料消費量が約1／1000 と小さく、反応時間も約1／10と迅速である。また、市販のマイクロプレートリーダーと同様に、
吐出位置をプログラムにより制御することで操作を自動化できるという利点がある。しかし、
ELISAでは第一抗体を固定化する場所が液滴と基板の接触部分のみに限られるため、微 小液滴ELXSAではたんぱく質の固定化量が少なく、感度が小さし＼ダイナミックレンジが狭 いという欠点がある。一方、たんぱく質の同定化にPS−3DOSを用いると、比表面積が増加 し、たんぱく質をより多く固定化することが可能である。また、PDMSウェル中に形成させる ことで、試料との接触面積を拡大することもできる。そこで、PDMSウェル中PS−3DOS上で 全ての反応を行うことで、固定化量を増加させ、ELISAの高感度化を目指した。ELISA反 応スキームの各反応時間について最適化を行った。そして、最適化した条イ牛rヒでELISA
を行った。
PDMSウェル中PS−3DOSは水に懸濁させたビーズをインクジェットで吐出し、溶媒の蒸 発によりビーズを集積化させることで作製した。そして、作製したPDMSウェル中PS−3DOS 上で微小液滴ELISAを実施し、PS・3DOSでの微小液滴ELISAと比較した。
4−2．PS−3DOSを用いた微小液滴ELISA
2．5μmビーズ懸濁液（5％）を250滴（約180nL）吐出し、K2C03飽和塩溶液の保湿箱（湿 度43．2±0．4％）で一晩静置した。作製したPS−3DOSは、直径約515μm、高さ48μm、ビ ーズ個数8×105個、インクジェットで吐出した試料とPDMS平面基板の接する面積を1とし たとき、155倍の表面積を有する。作製したPS−3DOS上で微小液滴ELISAを行った。試料 はインクジェットを用いてPS−3DOSの中央に滴下した。構造体を三次元的に作製すること で反応場表面積が飛躍的に増大し、ELISAの高感度化、ダイナミックレンジの拡大が期待 できる。一般的な96穴マイクロプレートと、PDMS平面基板上で行った微小液滴ELISA結
果と比較した。
4−2−1．実験
まず、一連のELISAの手順の中で必要となる試薬を調製した。調製方法を以下に
示す。なお、水はすべて日本ミリポア製Direc廿QTMにより精製した超純水を使用した。。0．05mo1几炭酸緩衝液（pH9．6）
NaHC03（関東化学製，特級）1，0499を水に溶解し250mLとした。同様に、Na2C03
（関東化学製，特級）1，0609を水に溶解し200mLとした。そして、Na睾C03水溶液を少 しずつ加えて、PHメーター（東亜ディーケーケー製，HM−25G）を用いpH9．6に調製
した。最後にメンブランフィルター（日本ミリポア製，JHWP04700，孔径：0．45μ
m）を用いでる過をした。。O．1moVLリン酸緩衝夜（グリセリン30wt％，pH7．4）
Na2HP04（関東化学）2，8429をグリセリン30wt％水溶液に溶解し、200mLとした。
Na昼2P04（関東化学）五。2009をグリセリン3C械％水溶液に溶解し、及OOmLとした。
NaH2P04水溶液を少しずつ加えてpH7．4に調製し、メンブランフィルターでろ過を
した。
・洗浄用緩衝液（0．05mo皿皿is，O．14mo1／LNac1緩衝液，pH8．O）
2−Amino・2・hydroxymethy1・1，3−propan砒。1（T㎡s，和光純薬製，特級）3，0409，NaC1
（和光純薬製特級）4，0999を水に溶解し、約450mLとした。水溶液にHC1（和光純
薬製，試薬特級）を加え、pH8．0とした後、水で全容を500mLとした。最後に、水溶 液をメンブランフィルターでろ過した。。希釈用緩衝液（0．05mo1／LThs，O．14moVLNac1緩衝液，0．05％BSA，pH8．0）
BSA（CALBIO CHEM製）0，0079を上のTris・NaC1緩衝液（グリセリン30wt％）
13．50gで溶解し、シリンジフィルター（関東化学製，HCL−D2SK13水系＆溶媒系，孔 径：0．45μm）でろ過した。
．・
z着用抗h−IgA溶液
1mg／mL抗h・IgA（Bethy1製）を炭酸緩衝液で1／100に希釈した。
・ブロッキング溶液（0．05Mhis，O．14MNac1緩衝液，1％BSA，pH8．O）
BSA O．1439を上の is−NaC1緩衝液（グリセリン30wt％）14．19gで溶解し、シリ ンジフィルターでろ過した。
・h−IgA溶液
1．2mg／mL h・IgA（Bethy1裂，ELISA ht（h・IgA））を希釈用緩衝液を用いて1000 早g／mLとなるように希釈した。
・1万倍希釈HRP標識化抗h−IgA溶液
1mg／mLHRP標識化抗h・IgA（Bethy1裂）を希釈用緩衝液で1／10000倍希釈した。
・基質溶液（50μmo1／LAmp1ex⑯胎d）
①ストック周5mo1／LAmp1ex⑯Red溶液の調製
Amp1ex⑯賄d（Mo1ecu1ar Probes製）5mgをDMS03−89mLに溶解し、最終濃 度5moVLとした。
②20mmoVLH202溶液の調製
30％H202（和光純薬製，試薬特級）を20mmo1／LとなるようにO．1mo1／Lリン 酸緩衝液で希釈した。
③50mmoVLAmp1ex⑯賄d溶液の調製
5mol／L Amp1ex⑯Red溶液10μLを20mmol／L H202溶液50μLとO．1 moVLリン酸緩衝液940μLと混合した。
Amp1ex⑱肋d（基質）はHRP（酵素）存在下で当量のH202と反応し、蛍光物質である Resominを生成する（Fig．4・1）。
削江ヴ
。人。。、
蛍光
冊H202σ ﾐ汐。
A㎜plex⑱Red Resomfin Fig，4−1Amp1ex⑮RedとHRPの．反応式
4−2・1・2．実験方法
①第一抗体の吸着
吸着用抗h・IgA溶液をプラスチックケースに満たし、そこにPS・3DOSを浸し1
時間静置した。その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄して、濾紙仏DWNTEC製）
でPS・3DOS内部の溶液を除去した。
②ブロッキング
PS・3DOS上にブロッキング溶液をインクジェットで300滴（約180nL）吐出し、
K2S04飽和塩溶液の保湿箱（湿度97．3％±O．5％）中で30分静置した。吐出液滴は 僅かに少なくなっていた。内部に浸透しているものと考えられる。その後、洗
浄用緩衝液で3回洗浄して、濾紙でPS・3DOS内部の溶液を除去した。
③抗原の結合
PS・3DOS上にh・IgA溶液（濃度1000ng／mL）と希釈用緩衝液をインクジェット で、計200滴（約150nL）で濃度0，10，25，50，100，250，500．1000ng／mLとなるよう 吐出し、K2S04飽和塩溶液の保湿箱（湿度97．3％士O．5％）中で30分静置した。そ の後、洗浄用緩衝液で3回洗浄して、濾紙でPS・3DOS内部の溶液を除去した。
④酵素標識化第二抗体の結合
PS・3DOS上に1万倍希釈HRP標識化抗h・IgA溶液をインクジェットで200
滴㈱150nL）吐出し、K2S04飽和塩溶液の保湿箱（湿度97．3％却．5％）中で30分静置した。その後、洗浄用緩衝液で5回洗浄して、濾紙でPS・3DOS内部の溶
液を除去した。⑤酵素基質反応および蛍光強度の測定
ウェルに基質溶液をインクジェットで200滴（約150nL）ずつ入れた。その後、
生成したResor血nの蛍光強度を蛍光検出システムを用いて検出した。
以上のインクジェットで形成した微小液滴ELISAを以下に示す（Fi＆4・2）。
ウシ腹溝アルブミン〈BSA）リンー酸緩衝液抗原（MgA）
鮒」 一燃多 鰍ダ