∠lG＝ρ9h（5−1）
∠G 重力
h 溶液の高さ
P 密度
g 重力加速度
Fig．5−2テンプレート作製用マスク
ガラス基板上にSU・8を滴下し、穴を空けたテフロン板を上から被せた。バキュー ムクランプを用いてテフロン板とガラス基板を固定し、ライトボックスを用いて紫外
光を約45分間照射し、SU・8を光硬化させた。SU・8はネガ型フォトレジストである
ため、紫外光が照射されたウェルの部分のみが硬化する。テフロン板の穴以外の硬化し たSU・8を除去した。さらに、PDMSウェルを作製する際に、CP上に着ける断面に凹凸を 形成させないために、テンプレートの凸部以外を削り取ってガラスにした。こうして、凸部はSU・8で、それ以外がガラス基板であるPDMSウェル型テンプレートを完成させた
（Fi35−3）。
Fig．5−3PDMSウェル作製用テンプレート
5・2・2テンプレートを鋳型としてのPDMS製ウェル型マイクロチップの作製
5−2−1で作製したテンプレートはマイクロチップのウェルとなる部分に約1．38mmの凸部 がある。ここにシリコン樹脂であるPDMSを流し込み硬化させ、テンプレート上に存在する ウェルの凸形部分が鋳型となり、PDMSに転写され微細ウェルを持ったマイクロチップとな る。PDMSは主剤と硬化剤の混合比を変化させることで、自己吸着性を変化させることがで きる。CP上にPDMSウェルのみで接合させるために、混合比・硬化倒斐・硬化時間を最適
化したPDMSウェルを以下の手順で作製した。
＜PDMSウェルの作製＞
①PDMSプレポリマーの調製
主剤と硬化剤を重量比25対1で混合し、十分に撹拝した。この際、PDMSには多 量の気泡が含まれるので、真空ポンプで30分間プレポリマーを減圧脱気した。
②テンプレート上ヘプレポリマーの塗布
プレポリマーを5・2・1で作製したテンプレート上に流し込み、流し込む際に生じる 気泡が抜けるまで放置した。
③加熱重合
80℃のオーブンで1時間加熱することでポリマーを硬化させた。
硬化後、型枠からPDMSを取り出し、CPの大きさに切り取った（Fi35・4）。テンプレート側 をCP上に接着することで新規浸透システムを構築した。
Fig．5−4PDMSウェル 5・3．CP上PDMSウェル中PSビーズ（CP・PS）の作製
CPの穴径10μm以上の粒径のPSビーズを用いて、溶媒のみを下部からキャピラ
リーフォースを用いて除去することにより、新規浸透集積を行った。5・3・1．実験
まず、PSヒース懸濁液の濃度の調製を行った。ここで使用したPSビーズ懸濁液
（Duke Scien舶。製、直径：21．0μm、濃度：1％）は、分散媒として界面活1性剤を 含んでいる。3・2・1と同様な理由から洗浄して使用することとした。21．0μmPSビ
一ズ懸濁液1．5mLをマイクロチューブに入れ、ビーズが沈殿するまで遠心分離し
た（6200卵m，10分）。上澄み溶液を1．3mL取り除き、純水を1．3mL加えて分散させる。10分遠心分離を行し＼上澄み液を1．3mL取り除き、純水を1．3mL加えて分
散させる操作を2回繰り返し行った。調製した試料と5・2−2で作製した基板を用い、溶媒のみを下部から除去することによ るPSビーズの新規浸透集積を行った。
5−3・2．結果及び考察
鐙川鰯蟻 燃・」」鰯 嚢
脇萎 瑚 鍛身： 」 麗
、髪嚢 簸茸一
麟螂 鰯：鰯麗 脇一旺 墨一鶴駿萎 一曲 一 ・脇
護 幸薫 一
Fig．5−5CP上PSビーズのSRM画像
CP上にPSビーズを集積化することができた。また、このビーズは試料を加える度に分 散するので、タンパク質などの拡散係数の小さい分子でも吸着時間を短縮できるものと考
えられる。ビーズの占める表面積は21mm2，PDMSウェルの容積は11mm2より、ビーズ
の存在により約3倍の表面積の増大を果たした。5−4．CP上PDMSウェル中PSビーズ（CP−PS）を反応場として用いたELISA
まず、CP・PSを反応場として用い、HumanImmunoG1obu1inA（トIgA）の検量線を ELISAで作成した。
5・4・1．実験
まず、一連のELISAの手順の中で必要となる試薬を調製した。調製方法を以下に示す。
なお、水はすべて日本ミリポア製Direct−QTMにより精製した超純水を使用した。
。0．2mo肌ほう酸緩衝液（pH8．5）
ほう酸（関東化学，試薬特級）6，1839を水に溶解し500mLとした。水溶液に1moVL NaOHを加え、pH8．5とした。
。0．1mo1／Lリン酸緩衝液（pH7．4）
Na2HP04（関東化学）2，8429を水に溶解し200mLとした。NaH2P04（関東化学）
1，2009を水に溶解し100mLとした。NaH2P04水溶液を少しずつ加えてpH7．4に調
製し、メンブランフィルターでろ過をした。・洗浄用緩衝液（0．05mo肌皿is，0．14mo1／LNac亙緩衝液，O．05％Tween20，pH8．O）
2・Amino−2−hydroxymethy1−1，3−propan砒。1（皿is，和光純薬製，特級）3，0369，NaC1
（和光純薬製，特級）4，0979，Twe㎝20（関東化学製）O．2909を水に溶解し、約450mL とした。水溶液にHG1（和光純薬製，試薬特級〉を加え、pH8．Oとした後、水で全容を 500㎜Lとした。最後に、水溶液をメンブランフィルタ」でろ過した。
苗希釈用緩衝液（O．05血。汎搬s，O。亙4皿。糺N納緩衝液，O．05％BSA，邊H8．O）
4・2・1と同様の方法で調整した。
・吸着用抗h・IgA溶液
1mg／mL抗h・IgA（Bethy1製）をぼう酸緩衝液で1／100に希釈した。
・ブロッキング溶液（0．2mol／Lほう酸緩衝液，1％BSA，pH8．5）
BSA0．10039を上のほう酸緩種液10mLに溶解した。
・h−IgA溶液
1．2mg／mL h・IgA（Bethy1裂，ELISA kit（h・IgA））を希釈用緩衝液を用いて 500ng／mLとなるように希釈した。
・1万倍希釈HRP標識化抗h−IgA溶液
4−2・1と同様の方法で調整した。
。基質溶液（50μmo1／LAmp1ex⑯Red）
4・2−1と同様の方法で調整した。
5−4｛一2．実験方法
①第一抗体の吸着
ウェルに吸着用抗h−IgA溶液をピペットで7μLずつ入れ、K2S04飽和塩溶液
の保湿箱（湿度97．3％土O．5％）中で1時間静置した。その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄した。
②ブロッキング
ウェルにブロッキング溶液をピペットで7μLずつ入れ、K2S04飽和塩溶液の
保湿箱（湿度97．3％±O．5％）中で30分静置した。その後、洗浄用緩衝液で3回洗 冷した。③抗原の結合
ウェルにh・IgA溶液（濃度O，10，25，50，100，250，500．1000ng／mL）をピペットで7 μLずつ入れ、K2S04飽和塩溶液の保湿箱（湿度97．3％土0．5％）中で30分静置し た。その後、洗浄用緩衝液で3回洗浄した。
④酵素標識化第二抗体の結合
ウェルに1万倍希釈HRP標識化抗H蛤溶液をピペットで7μLずっいれ、
K2S04飽和塩溶液の保湿箱（湿度97．3％±O．δ％）中で30分静置した。その後、洗
浄用跳鎧rで5回洗浄した。
⑤酵素基質反応および蛍光強度の測定
ウェルに基質溶液をピペットで7μLずつ入れた。その後、生成したResoru五n
の蛍光強度を蛍光検出システムを用いて検出した。また、同様の条件でCP上PDMSウェル中でのELISAも行い結果を比較した。
5 4−2．結果及び考察
O〜100ng／mLの範囲で測定が可能であった。100ng／mL以上では一定となった。詳
しくは5・5−2に他の結果とともに記載する。5−5．タンパク質の化学的固定
一般的なELISAでは、タンパク質を基板上に物理吸着で固定化するが、洗浄操作によ り一部のタンパク質は流れてしまうため固定化量が限られる。これに対して、架橋剤を用い ればタンパク質を三次元的により多く固定化できると考えられる。本研究では、カルボシイミ ドカップリング法を用いた。
5−5−1．実験
まず、カルボシイミドカップリングの手順の中で必要となる試薬を調製した。調製方法を 以下に示す。なお、水はすべて日本ミリポア製Dir㏄t・QT・により精製した超純水を使
用した。
。1≡mo1几 水酸化ナトリウム水溶液
水酸化ナトリウム（関東化学，特級）8．0gを水に溶解し200mLとした。
。0．1moVL炭酸緩衝液（pH9．6）
NaHC031，6809を水に溶解し200mLとした。同様に、Na2C031，0619を水に溶解 し100mLとした。そして、Na2G03水溶液を少しずつ加えて、PH9．6に調製し、メ
ンブランフィルターでろ過した。。O．1mo〃LMES緩衝液（pH6．O）
MES（Merck製）9，6159を水に溶解し450血Lとした。水溶液に1moVL NaOHを 加え、pH6．Oとした後、水で全容を500血Lとした。最後に、水溶液をメンブランフ
ィルターでろ過した。
。O．2mo1／Lほう酸緩衝液（pH8．5）
5−3・1と同様の方法で調整した。
。O．ユmo1／Lリン酸緩衝液（pH7．4）
5・3・1と同様の方法で調整した。
・洗浄用緩衝夜（0．05moVLTris，O．141moVLNac1緩衝液，O．05％Tween20，pH8．0）
5目3・1と同様の方法で調整した。
・ブロッキング溶液（O．2moVLほう酸緩衝液，1％BSA，pH8．5）
5−3・1と同様の方法で調整した。
・保存用緩衝液（0．1mo皿一リン酸緩衝液，1％BSA，pH7．4）
BSAO．043849を上のリン酸緩衝液4．38gに溶解した。
・2％Carbod−iimid−e（pH6．O）
1・（3−Di皿ethy1aminopropy1）一3−ethy1carbo砒imid−e hyd−roch1oride（EDC，SIGMA 製）0．02849を上のMES緩衝液1．38999に溶解した。
。0．25mo1／LEthano1amine（pH8．5）
Ethano1amine（2−aminoethano1）（関東化学製）0．099839を上のほう酸緩衝液10mL に溶解した。
以上の方法で調製した溶液を用い、PS・COOHにおけるカルボシイミドカップリングでの
第一抗体の固定化を行った［104］。
5−5−1−2．実験方法
①PS−COOHビーズ懸濁液（Po1ysciences製，直径：18．82±1．16μm，濃度：2．5％）
0．5mLとO．1mo1／L炭酸緩種液1．OmLをマイクロチューブに入れ、ビーズが沈 殿するまで遠心分離した（6200叩m，5分）。
②上澄み溶液を1．3mL取り除き、O．1moVL炭酸緩衝液を1．3mL力口えて、遠心分
離を5分行った。③②の操作を再度行し＼上澄み溶液を1．3mL取り除いた。
④O．1独。VLM鵬緩衝液をO．7mL加えて、遠心分離を5分行った。
⑤上澄み溶液をO．7mL取り除き、O．1mo几M鵬緩衝液をO．7mL加えて、遠心
分離を5分行った。⑥⑤の操作を2回繰り返し行い、上澄み液を0．7mL取り除いた。
⑦0．1mo〃LMES緩衝液O．625mLと2％CarbodiimideO．625mLを加えて、4時
間室温で撹拝した。
⑧遠心分離を5分行レ＼上澄み溶液を1．3mL取り除いた。
⑨0．1moVLMES緩衝夜を1．3mL加えて、遠心分離を5分行った。
⑩⑨の操作を2回繰り返し行い、0．2mo1几ほう酸緩衝液1，287mL加えた。
⑪1血g／mL抗h−IgA（Bethy1製）を0，013mL加えて、一晩室温で撹拝した。
⑫遠心分離を10分行し＼上澄み溶液を1．3mL取り除いた。
⑬0．2mo〃Lほう酸緩衝液1．2mLと0．25血。VLEthano1amineO．05mLを加えて、
30分室温で撹拝した。