LNCaP 細胞の神経内分泌様分化に伴った T-currents 増大や神経様突起伸長に
おける N 型糖鎖修飾の関与について明らかにするため、3 種の異なるグルコー ス濃度の培地で播種したLNCaP細胞に対して、分化誘導刺激前にN型糖鎖生合 成阻害薬tunicamycinを添加し、db-cAMP 誘起T-currents増大及び神経様突起伸 長を評価した。その結果、標準グルコース条件下（Standard condition、11 mM、
200 mg/dL）の LNCaP 細胞において db-cAMP＋IBMX 処置により誘起される T-currents増大は、tunicamycinの前処置により完全に抑制された（Fig. 30A）。ま た、tunicamycinは、低グルコース条件下におけるdb-cAMP誘起 T-currents 増大 を抑制しなかったが、高グルコース条件下では有意に抑制した（Fig. 30B）。一 方、いずれのグルコース濃度条件下においてもdb-cAMP処置により誘起される 神経様突起伸長は、tunicamycinにより影響を受けなかった（Fig. 30C、D）。
Pre-treatment with Tuni
40 30 20 10 0 50
Tuni V
V db-cAMP + IBMX
Tuni V
Standard Tuni V Tuni V
V db-cAMP + IBMX
Tuni V Tuni V
Standard n.s.
** n.s.
Proportion of cells with neurites(%)
(C)
n.s.
** n.s.
n.s.
** n.s.
(D)
Tuni V
V db-cAMP + IBMX
Tuni V
Low-glc Tuni V Tuni V
V db-cAMP + IBMX
Tuni V Tuni V
Low-glc
Tuni V
V db-cAMP + IBMX
Tuni V
High-glc Tuni V Tuni V
V db-cAMP + IBMX
Tuni V Tuni V
High-glc -1.2
-0.6 0.0 -1.8
T-currents (pA/pF)
n.s.
* *
(A) (B)
Tuni V Tuni V
V db-cAMP + IBMX
Tuni V Tuni V
Standard
n.s.
* **
Low-glc db-cAMP + IBMX
Tuni V
High-glc db-cAMP + IBMX
Tuni V db-cAMP + IBMX
Tuni V
Fig. 30. Effects of inhibition of N-glycosylation on the increased T-currents and neuritogenesis in neuroendocrine-like differentiated LNCaP cells by db-cAMP plus IBMX in the medium containing distinct concentrations of glucose. (A, B) The preventive effects of pre-treatment with tunicamycin (Tuni), an inhibitor of N-glycosylation, at 0.05 µg/mL on T-currents in LNCaP cells treated with db-cAMP at 1 mM plus IBMX at 100 µM for 4-5 days in the standard medium (A) and in the low-glucose (Low-glc) or high-glucose (High-glc) medium (B).
(C, D) Lack of effect of tunicamycin on the increased neuritogenesis induced by stimulation with db-cAMP/IBMX for 2 days in LNCaP cells in the standard medium (C) and in the Low-glc or High-glc medium (D). Tunicamycin was applied to the medium 30 min before stimulation with db-cAMP/IBMX (A-D). Data show the mean ± S.E.M. for
3) LNCaP細胞におけるdb-cAMP誘起T-currents増大に対する脱Nグリコシル 化酵素PNGaseFの効果
Fig. 30において、LNCaP細胞の神経内分泌様分化に伴ったT-currentsの増大に N 型糖鎖修飾が関与する可能性が示唆された。そこで、続いて神経内分泌様分
化した LNCaP 細胞に対し、細胞外の N型糖鎖を切断する脱 N グリコシル化酵
素PNGaseFを作用させた後のT-currentsを測定した。その結果、標準グルコース
条件下で 4-5 日間の db-cAMP＋IBMX 処置により神経内分泌様分化させた
LNCaP細胞のT-currentsは、測定開始30分前にPNGaseFを作用させることによ り有意に抑制された（Fig. 31A）。一方、PNGaseFは未分化細胞のT-currentsに対 して抑制傾向を示したが、有意な抑制効果ではなかった（Fig. 31A）。さらに、
PNGaseFは、低グルコース条件下で神経内分泌様分化させたLNCaP細胞におけ
るT-currentsを抑制しなかったが、高グルコース条件下で神経内分泌様分化させ
たLNCaP細胞のT-currentsを有意に抑制した（Fig. 31B）。またN型糖鎖生合成 阻害薬tunicamycinは、分化誘導刺激前に処置するとdb-cAMP誘起T-currents増 大を抑制したが（Fig. 30A、B）、T-currentsの測定開始30分前に添加した場合は 抑制しなかった（Fig. 31C）。
PNGaseF
V db-cAMP + IBMX
V
Standard
PNGaseF
Standard db-cAMP + IBMX
Tuni V db-cAMP + IBMX
Tuni V
db-cAMP + IBMX
V
Low-glc
PNGaseF
db-cAMP + IBMX
V
High-glc
PNGaseF
T-currents (pA/pF)
V n.s.
** ** n.s.
(A)
n.s.
* **
(B) (C)
-1.5 -1.0 -0.5 0.0 -2.0
Post-treatment with PNGaseF or Tuni
Fig. 31. Effects of enzymatic cleavage of surface N-glycans on the increased T-currents in the neuroendocrine-like differentiated LNCaP cells by db-cAMP plus IBMX in the medium containing distinct concentrations of glucose. (A, B) Reversal of the increased T-currents by post-treatment with peptide-N-glycosidase F (PNGaseF) at 20000 unit/mL capable of cleaving surface N-glycans from membrane glycoproteins in LNCaP cells treated with db-cAMP at 1 mM in combination with IBMX at 100 µM for 4-5 days in the standard medium (A) and in the low-glucose (Low-glc) or high-glucose (High-glc) medium (B). (C) Lack of effect of post-treatment with tunicamycin, an inhibitor of N-glycosylation, at 0.05 µg/mL on the T-currents after treatment with db-cAMP/IBMX for 4-5 days in the standard medium. PNGaseF or tunicamycin was applied 30 min before stimulation with db-cAMP (A-C). Data show the mean ± S.E.M. for 9-12 (A), 37-47 (B) and 13 (C) different experiments. * p < 0.05, ** p <
0.01. V, vehicle; n.s., not significant.
4) db-cAMP誘起神経内分泌様分化LNCaP細胞におけるCav3.2 T型Ca2+チャネ