control! BICD2 #1 siRNA!
BICD2 #2
図22 蛍光抗体法を用いたBICD2ノックダウンHeLa細胞の解析
（A）HeLa細胞に、scramble siRNA（control）あるいはBICD2に対するsiRNA（BICD2 #1、
BICD2 #2）をトランスフェクションした。72時間後、細胞を固定し、抗Rab6抗体および抗p230
抗体を用いて二重染色を行った。破線は細胞の輪郭を示している。Mergeは、Rab6の画像とp230 の画像の重ね合わせ画像を示す。スケールバーは20 µm。
（B）（A）のゴルジ体領域におけるRab6量の定量。LSM510共焦点レーザー顕微鏡を用いて、ゴ ルジ体領域のRab6の蛍光強度を測定した（ゴルジ体以外の細胞質領域における蛍光強度をバック グラウンドとした）。蛍光強度のデータは、3回の実験の平均 標準偏差で示した（1回の実験で1 条件あたり20-22個の細胞を解析）。各実験のcontrol条件の蛍光強度を平均し、その値を1として 正規化した。***は、control条件と比較してP値が0.001未満であることを示す（Dunnett's test）。
A !
control!BICD2 #1 BICD2 #2
siRNA
Rab6! p230! Merge!
B !
0.0 0.5 1.0 1.5
fluorescence intensity at the Golgi
control! BICD2 #1 siRNA!
***! ***!
BICD2 #2
図23 細胞分画法を用いたBICD2ノックダウンHeLa細胞の生化学的解析
（A）HeLa細胞に、scramble siRNA（control）あるいはBICD2に対するsiRNA（BICD2 #1、
BICD2 #2）をトランスフェクションした。72時間後、細胞を回収し、破砕と遠心を行って細胞質
画分（cyt）と膜画分（mb）に分離した（詳細は4.13の項を参照）。各画分はSDS-PAGEを用い て分離し、抗Rab6抗体、抗Calnexin抗体、および抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロッテ ィングに供した。Calnexinは膜画分のマーカー、GAPDHは細胞質画分のマーカーとして用いた。
図は5回の実験の代表的な結果を示す。
（B）（A）の各画分に存在するRab6量の定量。Rab6のバンド強度を、Multi Gauge Ver 3.2を用 いて測定した。次に、条件ごとに、細胞質画分と膜画分のバンド強度の和を算出した。この和を100%
とし、和に対する各画分の割合を求めた。続いて、BICD2ノックダウン細胞（BICD2 #1 siRNA 条件あるいはBICD2 #2 siRNA条件）における細胞質画分の割合を、コントロール細胞（control 条件）の細胞質画分の割合で正規化した（コントロール細胞における割合を1とした）。同様に、
BICD2 ノックダウン細胞における膜画分の割合を、コントロール細胞の膜画分の割合で正規化し
た。データは、5回の実験の平均 標準偏差で示した。*は、control条件と比較してP 値が0.05 未満であることを示す（the sign test）。
A !
cyt: cytosol fraction mb: membrane fraction!
Rab6 control! BICD2 #1 BICD2 #2
siRNA!
cyt mb! cyt mb! cyt mb!
Calnexin GAPDH!
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Rab6 band intensities
cyt/total mb/total
BICD2 #1 siRNA !
control! BICD2 #2
siRNA !
*!
*!
*!
*!
B !
図24 BICD1/BICD2ダブルノックダウンHeLa細胞の生化学的解析
（A）HeLa細胞に、scramble siRNA（control）、あるいはBICD1に対するsiRNAおよびBICD2 に対するsiRNAを混合したもの（BICD1 #2 siRNAおよび BICD2 #2 siRNA; BICD1+2）をトラ ンスフェクションした。72時間後、図23Aの場合と同様の方法により、細胞質画分（cyt）と膜画 分（mb）に分離した。各画分は、SDS-PAGEを用いて分離し、抗Rab6抗体、抗Calnexin抗体、
および抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。図は6回の実験の代表的な
結果を示す。
（B）（A）の各画分に存在するRab6量の定量。図23Bの場合と同様の方法により定量を行った。
データは、6回の実験の平均 標準偏差で示した。*は、control条件と比較してP値が0.05未満 であることを示す（the sign test）。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.）
B
!A !
Rab6 control! BICD1+2!
siRNA!
cyt mb! cyt mb!
Calnexin GAPDH!
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
Rab6 band intensities
cyt/total mb/total
*!
*!
BICD1+2 siRNA ! control!
図25 BICD1ノックダウンHeLa細胞の生化学的解析
（A）HeLa細胞に、scramble siRNA（control）あるいはBICD1に対する2つの異なるsiRNA
（BICD1 #1、BICD1 #2）をトランスフェクションした。72時間後、図23Aの場合と同様の方法 により、細胞質画分（cyt）と膜画分（mb）に分離した。各画分は、SDS-PAGEを用いて分離し、
抗Rab6抗体、抗Calnexin抗体、および抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロッティングに供
した。図は6回の実験の代表的な結果を示す。
（B）（A）の各画分に存在するRab6量の定量。図23Bの場合と同様の方法により定量を行った。
データは6回の実験の平均 標準偏差で示した。N.S.は、control条件と比較してP値が0.05より 大きいことを示す（the sign test）。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.）
B ! A !
Rab6!
control! BICD1 #1 BICD1 #2! siRNA!
cyt mb! cyt mb! cyt mb!
GAPDH! Calnexin!
BICD1 #1 siRNA!
BICD1 #2 siRNA! 0.0
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
Rab6 band intensities
cyt/total mb/total
control!
N.S.!N.S.! N.S.!N.S.!
図26 ウエスタンブロッティングを用いたBICD1あるいはBICD2のノックダウン効率 およびRab6発現量に対する影響の解析
（A）HeLa細胞に、scramble siRNA（control）、あるいはBICD1に対するsiRNAおよびBICD2 に対するsiRNAを混合したもの（BICD1 #2 siRNAおよび BICD2 #2 siRNA; BICD1+2）をトラ ンスフェクションした。72時間後、細胞を溶解し、抗Rab6抗体、抗BICD1抗体、抗BICD2抗 体、および抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。図は3回の実験の代表 的な結果を示す。
（B）HeLa細胞に、scramble siRNA（control）あるいはBICD1に対するsiRNA（BICD1 #1、
BICD1 #2）をトランスフェクションした。72時間後、細胞を溶解し、抗Rab6抗体、抗BICD1
抗体、および抗GAPDH抗体を用いたウエスタンブロッティングに供した。図は3回の実験の代 表的な結果を示す。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.） control! BICD1+2!
siRNA!
BICD2 Rab6!
BICD1
GAPDH!
A !
BICD1!
control! BICD1 #1!
siRNA!
BICD1#2!
Rab6!
GAPDH!
B !
図27 抗BICD2抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング
抗BICD2抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング量の定量。セミインタク
トHeLa細胞に、GST–Rab6A、ATP再生系、glucose、GTP、3 mg/mlのHeLa S3細胞質、およ び2-5 µgの抗BICD2抗体（BICD2）（あるいはコントロールとしてnormal rabbit IgG（IgG）） を加え、32℃で30分間インキュベートした（Cytosol（−）条件は、図8AのCytosol（−）と同様 の条件）。インキュベート後、細胞をゴルジ体ターゲティングアッセイに供した。蛍光強度のデー タは、3回の実験の平均 標準偏差で示した（1回の実験で1条件あたり27-34個の細胞を解析）。 各実験のCytosol（−）条件の蛍光強度を平均し、その値を1として正規化した。***P < 0.001、**P
< 0.01（Tukey–Kramer test）。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.） 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
fluorescence intensity at the Golgi
**! ***!
Cytosol (!) IgG! BICD2! IgG! BICD2!
2 µg! 5 µg
***! ***!
図28 抗BICD1抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング
抗BICD1抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング量の定量。セミインタク
トHeLa細胞に、GST–Rab6A、ATP再生系、glucose、GTP、3 mg/mlのHeLa S3細胞質、およ び1-2 µgの抗BICD1抗体（BICD1）（あるいはコントロールとしてnormal rabbit IgG（IgG）） を加え、32℃で30分間インキュベートした（Cytosol（−）条件は、図8AのCytosol（−）と同様 の条件）。インキュベート後、細胞をゴルジ体ターゲティングアッセイに供した。蛍光強度のデー タは、3回の実験の平均 標準偏差で示した（1回の実験で1条件あたり15-31個の細胞を解析）。 各実験のCytosol（−）条件の蛍光強度を平均し、その値を1として正規化した。***P < 0.001、N.S.P
> 0.05（Tukey–Kramer test）。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.） 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
fluorescence intensity at the Golgi Cytosol (!) IgG! BICD1! IgG! BICD1!
1 µg 2 µg
N.S.! N.S.!
*** ! *** !
図29 ウエスタンブロッティングを用いたGSTプルダウンアッセイビーズ画分の解析 GSTプルダウンアッセイ（図16を参照）により得られた、GST–Rab6Aビーズ画分あるいはGST ビーズ画分から溶出されたタンパク質を、SDS-PAGEを用いて分離し、抗Rabkinesin-6抗体ある いは抗ZW10抗体を用いたウエスタンブロッティングにより解析した。図は3回の実験の代表的な 結果を示す。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.）
Rabkinesin-6!
GST! GST–Rab6A!
bead fraction
ZW10!
図30 抗Rabkinesin-6抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング
抗Rabkinesin-6抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング量の定量。セミイ
ンタクトHeLa細胞に、GST–Rab6A、ATP再生系、glucose、GTP、3 mg/mlのHeLa S3細胞質、
および1-2 µgの抗Rabkinesin-6抗体（Rabkinesin）（あるいはコントロールとしてnormal rabbit IgG（IgG））を加え、32℃で30分間インキュベートした（Cytosol（−）条件は、図8AのCytosol
（−）と同様の条件）。インキュベート後、細胞をゴルジ体ターゲティングアッセイに供した。蛍光 強度のデータは、3回の実験の平均 標準偏差で示した（1回の実験で1条件あたり20-23個の細 胞を解析）。各実験のCytosol（−）条件の蛍光強度を平均し、その値を1として正規化した。***P
< 0.001、N.S.P > 0.05（Tukey–Kramer test）。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.） 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
fluorescence intensity at the Golgi Cytosol (!) IgG!Rabkinesin!IgG!Rabkinesin!
1 µg 2 µg
N.S.! N.S.!
***! ***!
図31 抗ZW10抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング
抗ZW10抗体添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング量の定量。セミインタク トHeLa細胞に、GST–Rab6A、ATP再生系、glucose、GTP、3 mg/mlのHeLa S3細胞質、およ び2-5 µgの抗ZW10抗体（ZW10）（あるいはコントロールとしてnormal rabbit IgG（IgG））を 加え、32℃で30分間インキュベートした（Cytosol（−）条件は、図8AのCytosol（−）と同様の 条件）。インキュベート後、細胞をゴルジ体ターゲティングアッセイに供した。蛍光強度のデータ は、3回の実験の平均 標準偏差で示した（1回の実験で1条件あたり26-34個の細胞を解析）。各 実験のCytosol（−）条件の蛍光強度を平均し、その値を1として正規化した。**P < 0.01、***P <
0.001、N.S.P > 0.05（Tukey–Kramer test）。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.） 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
fluorescence intensity at the Golgi Cytosol (!) IgG! ZW10! IgG! ZW10!
2 µg 5 µg
N.S.! N.S.!
**! *** !
図32 （インターネット公表に対する共著者全員の同意が得られていないため未掲載）
図33 His-mBICD2添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング
His-mBICD2添加条件におけるGST–Rab6Aのゴルジ体ターゲティング量の定量。セミインタク
トHeLa細胞に、GST–Rab6A、ATP再生系、glucose、GTPおよびCytosol（−RBP）を加え、
10 µgのHis-mBICD2の存在下（Cytosol（−RBP）+BICD2）あるいは非存在下（Cytosol（−RBP）） で、32℃で30分間インキュベートした（Cytosol（+）条件は、図8AのCytosol（+）と同様の条 件）。インキュベート後、細胞をゴルジ体ターゲティングアッセイに供した。蛍光強度のデータは、
3回の実験の平均 標準偏差で示した（1回の実験で1条件あたり26-32個の細胞を解析）。各実験 のCytosol（−RBP）の蛍光強度を平均し、その値を1として正規化した。*P < 0.05、**P < 0.01
（Dunnett's test）。
（出典元：Matsuto et al. (2015) Biochim. Biophys. Acta. 1853 (10), 2592-2609.） 0.0
0.5 1.0 1.5 2.0
fluorescence intensity at the Golgi Cytosol (!RBP)
Cytosol (+) Cytosol
(!RBP)
+BICD2!