糖鎖コンジュゲートへの応用
Through the research in carbohydrate field, various biological functions of oligosaccharides have been elucidated in life phenomena such as infection, cell-cell recognition, information transmission, fertilization and cell division. The materials containing sugar chains are expected as new functional bioengineering materials which can be applied to medical materials, for example biosensors which specifically bind to toxins or pathogens, composite materials used for surface plasmon resonance (SPR) or crystal oscillator (QCM), or affinity chromatography for the purification of various biopolymers.
Sugar chains having a thiol group, carboxyl group, amino group or azido group at the reducing terminal can be applied to immobilization onto resin beads and gold substrates, introduction of fluorescent groups or biotin, or the use of click chemistry as shown below.
Sugar-conjugates are expected as important tools for new bioengineering building materials.
· Biotin
· Surface Plasmon Resonance (SPR)
Sugar derivatives applied to sugar-conjugates.
· Beads / Resins
· Click Chemistry
· Fluorecent Groups
R= NH2 (G0402) / N3 (G0403)
R= NH2 (N0949) / /
G0422
D4217
R= NHTFAc (A2631) / NH2
近年の糖鎖機能解明に向けた研究により，感染，細胞間認 識，情報伝達，受精，細胞分裂に関わる役割など，生命現象に おける糖鎖の新たな機能が解明されてきています。このような 糖鎖を効果的に利用することで，新しい機能を持たせた生命工 学材料が構築できると期待されています。
例えば，病原体や毒素に特異的に結合する機能性糖鎖をビー ズやナノ粒子等の固相担体に固定化することによりバイオセン サーなど医療材料への応用が可能と考えられます。固定化担体 に金基板，金粒子を用いれば表面プラズモン共鳴（SPR），水 晶発振子（QCM）を利用することができるなど，生体認識性 を持った複合材料とすることができます。また，機能性糖鎖を クロマトグラフィー担体に固定化することでアフィニティクロ マトグラフィーとして様々な生体高分子の分離・精製に応用す ることも可能となります。その他，DDSや蛍光分析などにも 利用可能と考えられます。
還元末端にチオール基，カルボキシル基，アミノ基やアジド 基を有する糖鎖は，その官能基の性質を利用して金基板や樹 脂・ビーズへの固定化，ビオチンや蛍光基の導入，クリックケ ミストリーの利用など，以下のような応用が可能な新たな生命 工学材料構築のツールとして期待されます。
Applications for Sugar-conjugates
O OH OHO
OH O O
OH O HO
OH O HO HO HO
OH
R O
HO HO OH O HO OH
AcHN HO
O O OHOH
O O O O O R
O HO OH O
OH AcHN O
HO HO OHHOOC
HO OHO
HO AcHN
O O R
SH O
HN C
O HN
CH
O C17H35 O
OH HN
C13H27 OH O O
HO OH O
OH O OH HO OH AcHN O
HO HO OHHOOC
HO
O N3 O
AcHNHO HO OH
HO COOH
O O HO HO HO
OHO HOAcHN
O O
HO O HOHO
OHO HOAcHN
O OHO
HOAcHN O O
HOOO HO HO O HO
HO OHO HOAcHN
O O
O HO AcHN HO OH
HO COOH
O O HO HO HO
New
An enzyme that adds whole sugar chains without breaking down products 糖鎖を丸ごと付加し，生成物を分解しない酵素
―Endo-M-N175Q―
G0365 Glycosynthase (Endo-M-N175Q) is an enzyme developed by Yamamoto, Umekawa, et al. through site-directed mutation of areas around the active center of A1651 Endo-M1) which is already marketed. Since the feature of Glycosynthase is efficient transglycosylation activity by using oxazoline derivatives as glycosyl donors while suppressing sugar hydrolysis activity, the resulting glycosylated products are obtained in high yield with less digestion of the products by the enzyme. Due to this feature Glycosynthase is expected to be applied as useful tool in glycotechnology.
Umekawa and her colleagues caused transglycosylation reactions at the GlcNAc site of sperm antigen CD52 using oxazoline derivatives of the high-mannose type sugar chains or the complex type sugar chains as glycosyl donors2). They succeeded in obtaining glycosylated products in high yield of 84% and 76%, respectively.
Moreover, they also achieved transglycosylation reactions using two biologically active blood-pressure-lowing peptides, PAMP12 and Substance P, as glycosyl acceptors and the oxazoline derivative of a complex type sugar chain containing sialic acids as a glycosyl donor in 95% and 98% yield, respectively3). The articles in 2009 describe the advantages of this glycosylation method using sugar-oxazoline derivatives4-5).
Practical realization of efficient transglycosylation reactions would also be useful for expansion into glycoprotein synthesis, such as the area of biosimilars, and creation of new functional sugar complexes can be expected.
References 1) K. Yamamoto, S. Kadowaki, J. Watanabe, H. Kumagai, Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994, 203, 244.
2) M. Umekawa, C. Li, T. Higashiyama, W. Huang, H. Ashida, K. Yamamoto, L-X. Wang, J. Biol. Chem. 2010, 285, 511.
3) M. Umekawa, T. Higashiyama, T. Tanaka, M. Noguchi, A. Kobayashi, S. Shoda, W. Huang, L-X. Wang, H. Ashida, K. Yamamoto, Biochimica et Biophysica Acta 2010, 1800, 1203.
G0365 グライコシンターゼ（Endo-M-N175Q）は 山本・梅川らによって開発され，弊社で先に販売している
A1651 Endo-M1）の活性中心付近を部位特異的に変異させ た酵素です。この酵素は糖供与体としてオキサゾリン体を用 いることによって糖鎖を効率よく付加転移させる一方で，糖 加水分解活性が抑制されている特長を持っています。このた め糖転移生成物は酵素によって分解されにくく，生成物を高 収率で得ることができます。この特長によって本酵素は糖鎖 工学の有用なツールとして応用が期待されています。
梅川らは精子抗原CD52のGlcNAc部分に高マンノース型 糖鎖のオキサゾリン体または複合型糖鎖のオキサゾリン体を 糖供与体として糖転移反応を行い，それぞれ84％，76％と 高い転移率で糖転移生成物を得ることに成功しました
2）。ま た血圧降下作用を持つ２つの生理活性ペプチドPAMP12と Substance Pを受容体とし，シアロ複合糖鎖のオキサゾリ ン体を糖供与体とした糖転移反応においてもそれぞれ95％，
98％の高い転移率を示しています（Fig. 2）
3)。2009年の 論文ではこの糖−オキサゾリン体を用いた糖鎖合成反応の優 位性が報告されています
4-5)。
効率の良い糖転移反応の実用化はバイオシミラーなどの糖 タンパク質合成への展開にも有効であり，新しい機能性糖鎖 複合体の創製が期待されます。
New
Glycosynthase (Endo-M-N175Q)- ①
A s e t o f t h e t r a n s g l y c o s y l a t i o n d a t a us i n g a glycosynthase (Endo-M-N175Q) is shown below (Fig. 3).
The oxazoline derivative of a complex type sugar as a glycosyl donor was transglycosylated with GlcNAc-β-pNP as a glycosyl acceptor, and the glycosylated product was afforded in a high yield of 95% after 24 hours.
T h e sus t a i n e d a n d e f fe c t i ve p r o duc t i o n o f t h e glycosylated compound was identifi ed from HPLC profi les and MALDI-TOF MS as shown below (Fig. 4 and 5).
G0365 グライコシンターゼ(Endo-M-N175Q)の糖転移反 応の例をご紹介します。シアロ複合型糖鎖オキサゾリン体を 糖供与体，N0866 GlcNAc-β-
pNPを受容体とした糖転移 反応を行ったところ，24時間後に95%という高い転移率で 生成物が確認されています。以下その反応スキーム(Fig. 3)と HPLCによる反応追跡，生成物のMALDI-TOF-MSをお示しし ます(Fig. 4,5)。これらの結果をみるとオキサゾリン体から持 続的かつ効率的に糖転移反応物が得られていることがわかりま す。
Fig. 4 HPLC profi les of transglycosylation reaction. HPLC: ODS, CH3CN / H2O, UV 260nm : GlcNAc-β-pNP : glycosylated product
2345.940
Mass/Charge
1000 1500 2000 2500 3000
Fig. 3 Transglycosylation of oxazoline derivative and GlcNAc-β-pNP
O O
HO AcHN HO OH
HO
COONa O
O HO HO HO
O OH HOAcHN
O O
HO O HO
HO
OHO HOAcHN
O OHO
HOAcHN O O
HOOO HO HO O HO
HO OHO HOAcHN
O O
O HO AcHN HO OH
HO
COONa O
O HO HO HO
NO2 O
HO AcHN HO OH
HO
COONa O
O HO HO HO
O OH HOAcHN
O O
HO O HO
HO
OHO OHO O O HOO HO
HO O HO
HO OHO HOAcHN
O O
O HO AcHN HO OH
HO
COONa O
O HO HO HO
O N
O O OH HO
AcHN
HO NO2
Endo-M-N175Q (G0365) GlcNAc-β-pNP (N0866)
oxazoline derivative of a complex type sugar glycosylated product