脱炭酸
Ang P Ang C
Cu
II/
アスコルビン酸
ACE, angiotensin converting enzyme;
ACE-2, angiotensin converting enzyme 2;
CAP, carboxy-peptidase;
NEP, neutral endopeptidase;
ONE, 4-oxo-2(E)-nonenal
Fig. 16 アンジオテンシン類変換経路
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結語
今回、MALDI-TOF/MS によりリガンドを直接測定する事で、放射性同位元 素標識や蛍光標識を用いない新規レセプターアッセイ法を開発した。また、
MALDI-TOF/MSによる定量法は、安定同位元素標識したISを用いる事により、
Z’値は0.6高い信頼性をえる事が出来た。また既知のAng類やARBの報告され ている値と矛盾が無く、本法の妥当性が示された。更に、未修飾 Ang II の Kd
及びBmaxを明らかにすると共に、新規Ang類であるAng C, Ang PのKiを明ら かにした。またAng C, Ang Pの結果から、Ang IIのN末端修飾がAT1レセプ タ ー へ の 結 合 能 を 大 き く 低 下 さ せ る こ と も 明 ら か に し た 。 今 回 の
MALDI-TOF/MSによるレセプターアッセイ法の試みは、RASの他のレセプタ
ーにも応用可能であり、本法が創薬における各種レセプターのアゴニストやア ンタゴニスト探索等に応用されることが期待される。
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謝辞
本研究を推進するにあたり、終始御懇篤な御指導御鞭撻を賜りました東北大 学大学院薬学研究科臨床分析化学分野教授 大江知行先生に謹んで感謝申し上 げます。
本論文に対し、有益な御助言を賜りました東北大学大学院薬学研究科がん化 学療法薬学分野教授 富岡佳久先生に深くお礼申し上げます。
また、本研究に際し御指導御協力を賜りました東北大学大学院薬学研究科臨 床分析化学分野講師 後藤貴章先生、同助教 李宣和先生に深く感謝申し上げま す。
さらに、MALDI-TOF/MS による分析に際し、御協力を賜りました東北大学 医学系研究科医学研究支援センター共通機器管理室の皆様に厚くお礼申し上げ ます。
最後に、終始支えていただきました東北大学大学院薬学研究科 臨床分析化学 分野の同窓の皆様に、心からの感謝とお礼を申し上げます。
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実験の部
実験材料 試薬
ヒトAT1レセプターはAT1レセプターを高発現させたCHO-K1細胞を使用し、
PerkinElmer (Waltham, MA, USA)より購入した。ヒトAng II (DRVYIHPF)、
Ang I (DRVYIHPFHL)、Ang (1-7) (DRVYIHP)、Ang III (RVYIHPF)、Ang IV (VYIHPF)はペプチド研究所 (大阪、日本)より購入した。[13C5, 15N1-Pro7]-Ang II はスクラム (東京、日本)より購入した。DHB と losartan は東京化成工業より 購入した (東京、日本)。メタノール、塩化マグネシウム六水和物、リン酸はナ カライテスク(京都、日本)より購入した。水は、Millipore Co. (Billerica, MA, USA）の Milli-Q Integral Water Purification System で精製したものを用い た。LCグレードのアセトニトリルは関東化学 (東京、日本)より購入した。CHCA、
TFA、Tris-HClは和光純薬工業 (大阪、日本)より購入した。
装置
μFocus MALDI plateはHUDSON Surface Technology, Inc. (Fort Lee, NJ, USA) よ り 購 入 し た 。MALDI-TOF/MS 装 置 は 、 Applied Biosystems (Framingham, MA, USA)社製のVoyager DE-STR を用い、データ処理は、同 社製の Data Explorer (Ver. 4.0)により行った。MultiScreen-HTS vacuum manifoldとMultiScreen=HTS FC opaque filtration Plate (1.2 μm glass fiber type C filtration plates)と96-well collection plateとZipTip C18はMillipore Co.
(Billerica, MA, USA)より購入した。μFocus MALDI plateはHUDSON Surface Technology, Inc. (Fort Lee, NJ, USA)より購入した。
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実験方法
CHCA及びDHBの検出限界の検討
マトリクスとして飽和CHCA溶液 (水/アセトニトリル/TFA=50:50:0.1、v/v/v) または 150 mM DHB溶液 (水/アセトニトリル/リン酸=50:50:1、v/v/v)0.5 μL と、各濃度 (0.5-500 fmol/μL)のAng IIを0.5 μLとをステンレスプレート上で 混合し、デシケーター中で乾燥させた。これを MALDI-TOF/MS に付し、S/N を比較した。
μFocus plateの検出限界の検討
15 mM DHB溶液 (水/アセトニトリル/リン酸=50:50:1、v/v/v) 0.5 μLと各濃 度 (0.05-50 fmol/μL)のAng IIを0.5 μLとをμFocus plate上で混合し、デシケ ーター中で乾燥させた。これをMALDI-TOF/MSに付し、S/Nを比較した。
MALDI-TOF/MSによる測定
測定は正イオンモードで行い、リフレクターモードで accelerating voltage, 20 kV; grid voltage, 64%; extraction delay time, 100 nsec; low mass gate, 500 Da ; mass range, m/z 500-1500, ショット数100回に設定した。Calibrationは、
標準物質としてAng IV (m/z 775.37, [M+H]+)、 Ang III (m/z 931.52, [M+H]+), Ang I (m/z 1296.68, [M+H]+)を外部標準に行った。
Ang IIと[13C5, 15N1-Pro7]-Ang IIピークの確認
[13C5, 15N1-Pro7]-Ang II溶液 (500 nM、水/アセトニトリル=95:5、v/v)、及 びAng II、[13C5, 15N1-Pro7]-Ang II混液 (各500 nM、水/アセトニトリル=95:5、
v/v)を調製しMALDI-TOF/MSに付した。
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検量線の作成
各濃度のAng II溶液 (1.0-40 nM、水/アセトニトリル=95:5、v/v)を調製し、
この溶液 10 μL に 25 nM [13C5, 15N1-Pro7]-Ang II 溶液 (水/アセトニトリル
=95:5、v/v)を10 μL加えた。これをZipTip C18による脱塩後、MALDI-TOF/MS に付した。Ang IIと[13C5, 15N1-Pro7]-Ang IIとのピークエリア比をAng II濃度 に対してプロットし、最小二乗法により検量線を作成した。原点は含めず、重 み付けは1/X2で行った。
洗浄液中に含まれるAng II量の検討
Multiscreen-HTS FC filtration plate を 氷冷し た wash buffer (50 mM Tris-HCl, pH 7.4)200 µLで2回洗浄した。5.6 μg/150 μLのAT1レセプター懸 濁液 (assay buffer: 50 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl2 pH 7.4) 150 μLと50 μL の最終濃度12.5, 25 nM Ang II 溶液 (assay buffer)を27℃で1時間1インキ ュベーションし、これを吸引した。氷冷したwash buffer 200 μLで洗浄し、
10回目までの洗浄液にそれぞれ25 nMの[13C5, 15N1-Pro7]-Ang II溶液 (水/ア セトニトリル=95:5、v/v)を10 μL加え、窒素により蒸発させ、20 μLの水アセ トニトリル混液 (水/アセトニトリル=95:5、v/v)で再溶解後、ZipTip C18により 脱塩し、MALDI-TOF/MSに付しAng IIを定量した。
レセプターアッセイのバリデーション
Multiscreen-HTS FC filtration plateを氷冷したwash bufferで200 µL で2 回洗浄した。最終濃度0.78, 25 nMのAng II溶液 (assay buffer)25 μLと5.6 μg protein/150 μLのAT1レセプター懸濁液 (assay buffer)150 μL とを27℃で1 時間インキュベーションし、これを吸引した。氷冷したwash bufferで10回洗 浄し、水/メタノール混液 (水：メタノール 50:50 v/v) 200 μLを加え、27℃で
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1.5時間インキュベーションし、吸引した。50 nMの[13C5, 15N1-Pro7]-Ang II溶 液 (水/アセトニトリル=95:5、v/v)を10 μL加え、窒素により蒸発させ、20 μL の水アセトニトリル混液 (水/アセトニトリル=95:5、v/v)で再溶解後、ZipTip C18
により脱塩し、MALDI-TOF/MSに付し、Ang IIを定量した。
飽和法によるKd及びBmaxの測定
Multiscreen-HTS FC filtration plateを氷冷したwash buffer 200 µLで2回 洗浄した。最終濃度0-25 nM のAng II溶液 (assay buffer) 25 μLと5.6 μg protein/150 μLのAT1レセプター懸濁液 (assay buffer) 150 μLとを27℃で1 時間インキュベーションし、これを吸引した。氷冷したwash buffer 200 μLで 10回洗浄し、水/メタノール混液 (水：メタノール=50:50、 v/v) 200 μLを加え、
27℃で 1.5 時間インキュベーションし、吸引した。これに 25 nM の[13C5,
15N1-Pro7]-Ang IIを10 μL (水/アセトニトリル=95:5、v/v)加え、窒素により蒸 発させ、20 μLの水アセトニトリル混液 (水/アセトニトリル=95:5、v/v)で再溶 解後、ZipTip C18により脱塩し、MALDI-TOF/MSに付し、Ang IIを定量した。
レセプターアッセイの結合能解析は、GraphPad Prism Ver. 5.04 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)により行った。
競合法によるKiの測定
Multiscreen-HTS FC filtration plateを氷冷したwash buffer 200 µLで2回 洗浄した。最終濃度 6.25 nMのAng II 溶液 (assay buffer) 25 μLと5.6 μg protein/150 μLのAT1レセプター懸濁液 (assay buffer) 150 μLと1.0×10-12 - 1.0×10-5 M の各種リガンド溶液 (assay buffer) 25 μLとを27℃で1時間インキ ュベーションし、これを吸引した。その後、氷冷した wash buffer 200μL で 10回洗浄した。水/メタノール混液 (水/メタノール=50:50、v/v) 200 μLを加え、
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27℃で1.5時間インキュベーション後、これを吸引した。これに25 nMの[13C5,
15N1-Pro7]-Ang II溶液 (水/アセトニトリル=95:5、v/v) を10 μL加え、窒素に より蒸発させ、20 μLの水アセトニトリル混液 (水/アセトニトリル=95:5、v/v) で再溶解後、ZipTip C18により脱塩し、MALDI-TOF/MSに付し、Ang IIを定 量した。レセプターアッセイの結合能解析は、GraphPad Prism Ver. 5.04によ り行った。
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引用文献
1. E.G. Krause, R.R. Sakai, Richter and sodium appetite: from adrenalectomy to molecular biology, Appetite 49 353-367 (2007).
2. M. de Gasparo, K.J. Catt, T. Inagami, J.W. Wright, T. Unger, International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors, Pharmacol. Rev. 52 415-472 (2000).
3. M.J. Peach, Renin-angiotensin system: biochemistry and mechanisms of action, Physiol. Rev. 57 313-370 (1977).
4. J.L. Guy, R.M. Jackson, K.R. Acharya, E.D. Sturrock, N.M. Hooper, A.J. Turner, Angiotensin-converting enzyme-2 (ACE2): comparative modeling of the active site, specificity requirements, and chloride dependence. Biochemistry 42 13185-13192 (2003).
5. D.J. Campbell, Circulating and tissue angiotensin systems, J. Clin.
Invest. 79 1–6 (1987).
6. J. Culman, J. Baulmann, A. Blume, T. Unger, The renin-angiotensin system in the brain: an update, J. Renin Angiotensin Aldosterone Syst.
2 96-102 (2001).
7. M. Burnier, H.R. Brunner, Angiotensin II receptor antagonists, Lancet 355 96-102 (2000).
8. S. Higuchi, H. Ohtsu, H. Suzuki, H. Shirai, G.D. Frank, S. Eguchi, Angiotensin II signal transduction through the AT1 receptor: novel insights into mechanisms and pathophysiology, Clin. Sci. (Lond) 112 417-428 (2007).
- 39 -
9. K.J. Catt, F.A. Mendelsohn, M.A. Millan, G. Aguilera, The role of angiotensin II receptors in vascular regulation, J. Cardiovasc.
Pharmacol. 6 (Suppl 4) S575-S586 (1984).
10. W.W. Batenburg, I.M. Garrelds, C. Bernasconi, L. Juillerat-Jeanneret, J.P. van Kats, P.R. Saxena, A.H. Danser, Angiotensin II type 2 receptor-mediated vasodilation in human coronary microarteries, Circulation 109 2296–2301 (2004).
11. T. Jing, H. Wang, K.S. Srivenugopal, G. He, J. Liu, L. Miao, Y. He, Conditional expression of type 2 angiotensin II receptor in rat vascular smooth muscle cells reveals the interplay of the angiotensin system in matrix metalloproteinase 2 expression and vascular remodeling, Int. J. Mol. Med. 24 103–110 (2009).
12. F. Rompe, M. Artuc, A. Hallberg, M. Alterman, K. Ströder, C.
Thöne-Reineke, A. Reichenbach, J. Schacherl, B. Dahlöf, M. Bader, N.
Alenina, M. Schwaninger, T. Zuberbier, H. Funke-Kaiser, C. Schmidt, W.H. Schunck, T. Unger, U.M. Steckelings, Direct angiotensin II type 2 receptor stimulation acts anti-inflammatory through epoxyeicosatrienoic acid and inhibition of nuclear factor kappaB, Hypertension 55 924–931 (2010).
13. T. Chabrashvili, C. Kitiyakara, J. Blau, A. Karber, S. Aslam, W.J.
Welch, C.S. Wilcox, Effects of ANG II type 1 and 2 receptors on oxidative stress, renal NADPH oxidase, and SOD expression, Am. J.
Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 285 R117-R124 (2003).
- 40 -
14. E.S. Jones, A. Vinh, C.A. McCarthy, T.A. Gaspari, R.E. Widdop, AT2 receptors: functional relevance in cardiovascular disease, Pharmacol.
Ther. 120 292-316 (2008).
15. G.K. Aulakh, R.K. Sodhi, M. Singh, An update on non-peptide angiotensin receptor antagonists and related RAAS modulators, Life Sci. 81 615–639 (2007).
16. R.A. Santos, M.J. Campagnole-Santos, S.P. Andrade, Angiotensin-(1-7): an update, Regul. Pept. 91 45–62 (2000).
17. V. Jankowski, R. Vanholder, M. van der Giet, M. Tölle, S. Karadogan, J. Gobom, J. Furkert, A. Oksche, E. Krause, T.N. Tran, M. Tepel, M.
Schuchardt, H. Schlüter, A. Wiedon, M. Beyermann, M. Bader, M.
Todiras, W. Zidek, J. Jankowski, Mass spectrometric identification of a novel angiotensin peptide in human plasma, Arterioscler. Thromb.
Vasc. Biol. 27 297–302 (2007).
18. R. Yang, I. Smolders, P. Vanderheyden, H. Demaegdt, A. Van Eeckhaut, G. Vauquelin, A. Lukaszukd. Tourwé, S.Y. Chai, A.L.
Albiston, C. Nahmias, T. Walther, A.G. Dupont, Pressor and renal hemodynamic effects of the novel angiotensin A peptide are angiotensin II type 1A receptor dependent, Hypertension 57 956-964 (2011).
19. V.T. Karamyan, R. Gadepalli, J.M. Rimoldi, R.C. Speth, Brain AT1
angiotensin receptor subtype binding: importance of peptidase inhibition for identification of angiotensin II as its endogenous ligand, J. Pharmacol. Exp. Ther. 331 170-177 (2009).
- 41 -
20. S. Bosnyak, E.S. Jones, A. Christopoulos, M.I. Aguilar, W.G. Thomas, R.E. Widdop, Relative affinity of angiotensin peptides and novel ligands at AT1 and AT2 receptors, Clin.Sci. (Lond) 121 297-303 (2011).
21. P.C. Wong, S.D. Hart, A.T. Chiu, W.F. Herblin, D.J. Carini, R.D.
Smith, R.R. Wexler, P.B. Timmermans, Pharmacology of DuP 532, a selective and noncompetitive AT1 receptor antagonist, J. Pharmacol.
Exp. Ther. 259 861-870 (1991).
22. J.M. Herbert, C. Delisée, F. Dol, P. Schaeffer, C. Cazaubon, D. Nisato, P. Chatelain, Effect of SR 47436, a novel angiotensin II AT1 receptor antagonist, on human vascular smooth muscle cells in vitro, Eur. J.
Pharmacol. 251 143-150 (1994).
23. L.A. de Jong, D.R. Uges, J.P. Franke, R. Bischoff, Receptor-ligand binding assays: technologies and applications, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 829 1-25 (2005).
24. M.M. Akhavan, S.A. Ebrahimi, M. Mahmoudian, A non-radioactive method for angiotensin II receptor binding studies using the rat liver, J. Pharmacol. Toxicol. Methods 53 206-214 (2006).
25. E. Chernet, L.J. Martin, D. Li, A.B. Need, V.N .Barth, K.S. Rash, L.A.
Phebus, Use of LC/MS to assess brain tracer distribution in preclinical, in vivo receptor occupancy studies: dopamine D2, serotonin 2A and NK-1 receptors as examples, Life Sci. 78 340-346 (2005).
26. L.A. de Jong, C.M. Jeronimus-Stratingh, T.I. Cremers, Development of a multiplex non-radioactive receptor assay: the benzodiazepine receptor, the serotonin transporter and the beta-adrenergic receptor, Rapid Commun. Mass Spectrom. 21 567-572 (2007).
- 42 -
27. S.C. Hopkins, J.B. Nofsinger, M.S. Allen, P. Koch, M.A. Varney, In vivo saturation binding of GABA-A receptor ligands to estimate receptor occupancy using liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Biopharm. Drug Dispos. 30 9-20 (2009).
28. K.M. Elased, D.R. Cool, M. Morris, Novel mass spectrometric methods for evaluation of plasma angiotensin converting enzyme 1 and renin activity, Hypertension 46 953-959 (2005).
29. K.M. Elased, T.S. Cunha, S.B. Gurley, T.M. Coffman, M. Morris, New mass spectrometric assay for angiotensin-converting enzyme 2 activity, Hypertension 47 1010-1017 (2006).
30. J.H. Zhang, T.D. Chung, K.R. Oldenburg, A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays, J. Biomol. Screen. 4 67-73 (1999).
31. H. Wang C.H. Wong, A. Chin, A, Taguchi, A, Taylor, S, Hanash, S, Sekiya, H. Takahashi, M. Murase, S. Kajihara, S. Iwamoto, K. Tanaka, Integrated mass spectrometry-based analysis of plasma glycoproteins and their glycan modifications, Nat. Protoc. 6 253-269 (2011).
32. B. Fuchs, J. Schiller, Recent developments of useful MALDI matrices for the mass spectrometric characterization of apolar compounds, Curr. Org. Chem,, 13 1664-1681 (2009).
33. T.J.P. Naven, D.J. Harvey, Cationic derivatization of oligosaccharides with Girard's T reagent for improved performance in matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 10 829-834 (1996).
- 43 -
34. E. Ciccimaro, I.A. Blair, Stable-isotope dilution LC–MS for quantitative biomarker analysis, Bioanalysis 2 311-341 (2010).
35. S.E. Ong, M. Mann, Mass spectrometry-based proteomics turns quantitative, Nat. Chem. Biol. 1 252-262 (2005).
36. S.S. Bansal, J.M. Halket, J. Fusova, A. Bomford, R.J. Simpson, N.
Vasavda, S.L. Thein, R.C. Hider, Quantification of hepcidin using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, Rapid Commun. Mass Spectrom. 23 1531-1542 (2009).
37. K. Sogawa, Y. Kodera, K. Noda, Y. Ishizuka, M. Yamada, H.
Umemura, K. Maruyama, T. Tomonaga, O. Yokosuka, F. Nomura, The measurement of a fibrinogen α C-chain 5.9 kDa fragment (FIC 5.9) using MALDI-TOF MS and a stable isotope-labeled peptide standard dilution, Clin. Chim. Acta. 412 1094-1099 (2011).
38. M. Canals, L. Jenkins, E. Kellett, G. Milligan, Up-regulation of the angiotensin II type 1 receptor by the MAS proto-oncogene is due to constitutive activation of Gq/G11 by MAS, J. Biol. Chem. 281 16757–
16767 (2006).
39. R.M. van der Hee, T Deurholt. C.C. Gerhardt, E.M. de Groene, Comparison of 3 AT1 receptor binding assays: filtration assay, ScreenReady™ Target, and WGA Flashplate®, J. Biomol. Screen.10 118-126 (2005)
40. K. Crane, D.T. Shih Development of a homogeneous binding assay for histamine receptors, Anal. Biochem. 335 42-49 (2004).