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図3:サ ンプ リ ングす る 時刻 の違 い が安 静 時 ラ ッ ト海 馬 のMMP9、MMP2 酵 素 活 性.お よびTIMP‑1タ ンパ ク発 現 に及 ぼ す影 響
各測 定 結 果 は 、9時 群 の 値 を100%と した 相 対 値 で 示 した 。(A)実 験 デ ザ イ ン。 カ ッ コ内 の数 字 は 、 各 ポ イ ン トにお け る ラ ッ トの 個 体 数 を示 す 。 (B)MMP‑9酵 素 活 性 、(C)MMP‑2酵 素活 性 、(D)P‑1タ ンパ ク発 現 量,Mea批S.E
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図41一 過i生 ト レ ッ ド ミ ル 走 運 動 がMMP9酵 素 活 性 に 及 ぼ す 影 響 MMP‑9の 酵 素 活 性 の 変 化 は 、 コ ン ト ロ ー ル 群(Q/min)の 値 をzoo%
と し た 相 対 値 で 示 し た 。(A)運 動 終 了 直 後 、(B)運 動 終 了 か ら6時 間 後 、 (c)運 動 終 了 か ら12時 間 後 、(D)運 動 終 了 か ら24時 間 後 、Mean±S.E;
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図5ニ ー一過 性 ト レ ッ ド ミ ル 走 運 動 がMMP‑2酵 素 活 性 に 及 ぼ す 影 響 MMP‑2の 酵 素 活 性 の 変 化 は 、 コ ン ト ロ ー ル 群(a/灘iゆ の 値 をloa%
と し た 相 対 値 で 示 し た 。(A)運 動 終 了 直 後 、(B)運 動 終 了 か ら6時 間 後 、 (C)運 動 終 了 か ら12時 間 後 、(D)運 動 終 了 か ら24時 間 後 、Mea継S.E
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図61一 過 性 ト レ ッ ド ミ ル 走 運 動 がTIMP‑1タ ン パ ク 発 現 量 に 及 ぼ す 影 響
̀1̀IP 一 タ ン パ ク 発 現 量 は
、 コ ン ト ロ0ル 群(o塒 旗i爵 の 値 をgoo%と し た 相 対 値 で 示 し た 。(A)運 動 終 了 直 後 、(B)運 動 終 了 か ら6時 間 後e
(C)運 動 終 了 か ら12時 間 後 、(D)運 動 終 了 か ら24時 間 後 、Me&批S.E
研 究 課題2一 過 性 運 動 に対 す る海 馬IGF‑1シ グ ナル 伝 達 の 活 性 応 答
!.目 的
神 経 活 動 の 活 性 化 に よ っ て 血 液 中 夏GF‑1が 脳 内 に 移 行 し て 作 用 す る こ と (Nishili艶aetaL,2010)や 、 海 馬 でIGF‑1の 下 流 に 存 在 す るAktリ ン 酸 化 とE汰1/2リ ン 酸 化 が 増 加 す る こ と が 報 告 さ れ て い る(Sh説kaeta豆
2007;C罫e8p◎‑BieletaL,2007)。 そ こ で 研 究 課 題2で は 、 一 過 性 運 動 が 海 馬 のAktリ ン 酸 化 、E盛1/2リ ン 酸 化 を 増 加 さ せ る と 仮 説 を 立 て 、 検 証 す る 。
2.方 法
(1)試 料
研 究 課 題1と 同 様 の タ ン パ ク 上 清 を 用 い た 。
(2)Akt.リ ン 酸 化Akt、E虚 、 リ ン 酸 化 翫k発 現 の 定 量(Weste膿blo￡) Akt、 リ ン 酸 化Akも 、Erk、 リ ン 酸 化 臨kの 発 現 量 はWeste膿blotに よ り検 出 ・定 量 し た 。 タ ン パ ク 上 清 とLysisb"f鋤 な ら び にSa搬pleb"艶r
(2.5難MT暫is、16%k、10%SDS、0.8mMB罫 ◎憩ophe簸01blue) を 混 合 し て 溶 液 中 の タ ン パ ク 質 量 が 約22pgと な る よ う に 調 整 し た も の を 沸 騰 し た お 湯 に 浸 し て5分 間 加 熱 し た 。SDS‑PAGEに は8%ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲ ル を 使 用 し 、 ナ イ ア ガ ラ 電 気 泳 動 装 置(日 本 エ イ ドー)を 用 い て ゲ ル1枚 に 対 し て40狐Aで2時 間 の 電 気 泳 動 を 行 っ た 。 分 子 量 マ ー カ ー に は プ レ ス テ イ ン ドタ ン パ ク 質 マ ー カ ー(ナ カ ラ イ テ ス ク)を 使 用 し た 。
ト ラ ン ス プ ロ ッ ト⑧ セ ル(BIO‑RAD)を 用 い て220mAで6時 間(ま た は 440憩Aで3時 間)通 電 し 、 ポ リ ア ク リ ル ア ミ ドゲ ル か ら タ ン パ ク 質 を PVDF膜(孔 径0.45鱒 、fillip●re)上 に 転 写 し た 。 転 写 終 了 後 のPVDF 膜 をTBSに1分 間 振 盤 し た 。ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液(3%BSA、0.1%Twee簸 一20 i鷺TBS)にPDVF膜 を30〜60分 間 反 応 さ せ た 。 っ つ い て 、3%BSAを 含 むTBS‑T(0.1%Tween‑20i聡TBS)に 一 次 抗 体(抗Akも 抗 体.1:000、
Cellsig鰍li簸g;抗 リ ン 酸 化AktSe雌73抗 体 、1:1000、Cellsigmli鷺g;
抗 醗M/2抗 体 、1:1000、(ts;抗 リ ン 酸 化E痙1/2抗 体 、1:1000、
Cell.,;抗6・actin抗 体 、1:20000、Sigma‑Aldrich)を 加 え 、4℃
で 一 晩 反 応 さ せ た 。6‑acti強 は 内 部 標 準 と し て 検 出 し た 。反 応 終 了 後 、TBS‑T で1時 間 洗 浄 し た 。 つ づ い て 、0.2%ス キ ム ミ ル ク を 含 むTBS‑Tに2次 抗 体(HRP結 合 抗 ウ サ ギlgG抗 体 、1:12500,GEHealthcare;HRP結 合 抗 マ ウ スIgG抗 体 、1:,i、GEHealthcare)を 加 え 、 室 温 で!時 間 反 応 さ せ た 。 反 応 終 了 後 、TBS‑Tで1時 間 洗 浄 し た 。 洗 浄 終 了 後 、PVDF膜
を 検 出 試 薬 で あ るWestemLigh加i丑g⑪PLUSECL(P鯉kinEhneの に 玉 分 間 浸 し た 。 余 分 な 検 出 試 薬 を 取 り 除 き 、PVDF膜 をX線 フ ィ ル ム(富 士 フ イ ル ム)に1秒 か ら1時 間 感 光 さ せ た 。 感 光 後 にX線 フ ィ ル ム を 現 像 液 と 定 着 液 に 各 々1分 間 ず つ 浸 す こ と で 現 像 し た 。Westemblotで 検 出 さ れ た バ ン ド の 光 学 的 密 度 は 、r・ を 用 い て 検 出 し た 。 各 々 の タ ン パ ク 発 現 を 示 し た バ ン ド の 光 学 的 密 度 を 求 め た 。 ま た 必 要 に 応 じ て 、{
を 行 っ た 。 バ ン ド検 出 後 のPVNF膜 をS循ppi貧gb駕 夏f鞭(lMGlyciぬe、
2.5MNac1、pH2.8)に10分 間 振 撮 す る こ と で 、PVNF膜 か ら 抗 体 を 剥 が し た 。 そ の 後 は ブ ロ ッ キ ン グ 溶 液 に 反 応 さ せ る 作 業 か ら 上 記 と 同 様 の 工
程 を 行 っ た 。
(3)統 計解 析
E意1/2とAktの リン酸 化 は総Erbl/2(Akt)発 現 量 に対 す る リ ン酸化 E癒1/2(Akt>発 現 量 を求 め た 後 、 一 過 性 トレ ッ ドミル 走 運 動 終 了 直後 に お け る コ ン トロー ル 群(0拠/憩 加.)の 値 をgoo%と した 相 対 値 で 示 し、結 果 は全 て 平 均± 標 準 誤差 で 示 した 。 運 動 強度 と時 間 を独 立 変 数 とす る二 要 因 分 散 分 析 を行 い 、有 意 性 が 認 め られ た 場 合 は 、 多 重 比 較(Tukey)を 行 っ た 。統 計 的有 意 水準 は 全 て5%以 下 と した 。
3。 結 果
一 過 性 トレ ッ ドミル 運 動 後 のAktリ ン酸 化 の変 化
図7に.一 過 性 ト レ ッ ド ミ ル 運 動 がAktリ ン 酸 化 に 及 ぼ す 影 響 を 示 し た 。 海 馬AktSe盤73部 位 の リ ン 酸 化 に 運 動 強 度 要 因[F(2,88)篇0.1748,
P⇒8399}と タ イ ム ポ イ ン ト要 因[F(3,88b1.262,PO.29231の 主 効 果 は 認 め ら れ ず0交 互 作 用 も 認 め ら れ な か っ た[F(6,88)=0.03413,P瓢0.99981。
一 過 性 トレッ ドミル 運 動 後 のrk .1リ ン酸化 の 変 化
図8に 、 一 過 性 ト レ ッ ド ミ ル 運 動 が 翫k1リ ン 酸 化 に 及 ぼ す 影 響 を 示 し た 。 二 要 因 の 分 散 分 析 を 行 っ た 結 果 、 タ イ ム ポ イ ン ト要 因 に の み 主 効 果 が 認 め ら れ た[F(3,87)=1.76,P<o.0001。 多 重 比 較 検 定 を 行 っ た 結 果 、 運 動 終 了 直 後 に 比 べ 、6時 間 後 で は コ ン ト ロ ー ル 群(p<0.05)、 低 強 度 群
(p<oz)、 高 強 度 群(p<0.05)で 有 意 に 低 い 値 を 示 し た 。12時 間 後 に お い て は 、低 強 度 群(p<0.01)で 運 動 終 了 直 後 と 比 べ 有 意 に 低 い 値 を 示 し た 。 24時 間 後 に お い て は 、 コ ン ト ロ ー ル 群(pく0.05)、 低 強 度 群(pく0.001) で 運 動 終 了 直 後 と 比 べ 有 意 に 低 い 値 を 示 し た 。
一 過 性 トレ ッ ドミル 運 動 後 のErk2リ ン酸 化 の変 化
図9にb一 過 性 ト レ ッ ド ミ ル 運 動 がE痩2リ ン 酸 化 に 及 ぼ す 影 響 を 示 し た 。 二 要 因 の 分 散 分 析 を 行 っ た 結 果 、 タ イ ム ポ イ ン ト要 因 に の み 主 効 果 が 認 め ら れ た[F(3,88)=̀.G.71,P<!iii。 多 重 比 較 検 定 を 行 っ た 結 果 、 運 動 終 了 直 後 に 比 べ 、6時 間 後 で は コ ン ト ロ ー ル 群(pく0.0001)、 低 強 度 群
(p<0.Ol)、 高 強 度 群(p<0.05>で 有 意 に 低 い 値 を 示 し た 。12時 間 後 に お い て は 、 コ ン ト ロ ー ル 群(p<0.001)、 低 強 度 群(p<0.Ol)で 運 動 終 了 直 後 と 比 べ 有 意 に 低 い 値 を 示 し た 。24時 間 後 に お い て は 、 コ ン ト ロ ー ル 群
(p<0.0001>、 低 強 度 群(p<0.01)で 運 動 終 了 直 後 と 比 べ 有 意 に 低 い 値 を 示 し た 。
4.考 察
研 究acで は 各 タ イ ム ポ イ ン トで 運 動 強 度 を独 立 変 数 とす る一 要 因 分 散 分 析 に よ り解 析 を行 った た め 、 時 問 の 要 因 を あわ せ て検 討 す る こ とが で きな か った 。 これ は 、研 究 課 題1で は 、 同 一 ゲル に10サ ン プル しか 泳 動 す る こ とが で き な か った た め で あ る 。 そ こで研 究課 題2で は 、運 動 強度 と 時 間 の 二 要 因 を合 わせ て検 討す るた め に、 多 量 の サ ン プル(30サ ン プル) を 同 一 ゲル で解 析 で き る ナイ ア ガ ラ電 気 泳 動 装置 を用 い て ウ ェ ス タ ン ・ブ
ロ ッテ ィ ン グ を行 った 。 これ に よ り、 一解 析 に用 い るゲ ル 数 を軽 減 で きた た め 、研 究 課 題2で は 二 要 因 分 散 分析(運 動 強度 ×時 間)に よ り統 計解 析
を行 った 。
E旗1/2で は 低 強度 、 高強 度 の 一 過性 運 動 直後 にErtl/2の リ ン酸 化 が 増 加 し、 そ の 増 加 量 は低 強度 群 で わ ず か に大 き い傾 向 が み られ た 。 しか し、
同サ ン プ リン グポ イ ン トで トレッ ドミル に乗 せ た だ けの コ ン トロー ル 群 で もE慮1/2の リン酸 化 が 増 加 した 。 この 結 果 は 、 ラ ッ トを トレ ッ ドミル に 乗 せ る と い う実 験 操 作 自体 がE丞 の リン酸化 を引 き起 こす 刺 激 にな って し
ま った 可 能 性 を示 唆 して お り、 そ れ に よ って 運 動 の 影 響 が 覆 い隠 され て し ま った か も しれ な い。 これ らの結 果 か ら、 運 動 の有 無 に よ るErk1/2リ ン 酸 化 に差 異 が み られ な か った が 、 実 験 デ ザ イ ン を工 夫 す る ことで 一 過 性 運 動 がrl/2の リン酸 化 に及 ぼ す 影 響 を検 討 で き る可 能 性 が 考 え られ る。
運 動 直 後 で コ ン トロー ル 群 のErk1/2リ ン酸化 を増 加 させ た 原 因 には 、 本 実 験 の運 動 トレー ニ ン グが 恐 怖 条 件 付 け刺 激 に似 て いた ことで 生 じた 可 能 性 が 考 え られ る。S躍a痴enesieta1.(2002)は 、 海 馬 の 神 経 活 動 を高 め
る こ とが 明 らか に な って い る恐 怖 条 件 付 け刺 激 に よ り海 馬 のErk1/2リ ン 酸 化 が 増 加 す る こ とを報 告 して い る。 そ の恐 怖 条 件 付 け とは、 一 度 、 刺 激 呈 示 箱 の 中 に入 れ られ 足 に電 気 シ ョ ック を受 けた 動 物 はそ の箱 が 危 険 で あ る こ とを覚 え るた め、そ の 後 に同 じ箱 に入 れ られ る恐怖 反応(す くみ な ど) を 引 き起 こす とい う特 性 を利 用 した、 海 馬 の学 習 ・記 憶 能 を評 価 す る行 動 実 験 で あ る 。 本 実 験 で は 、 全 て の ラ ッ トに 本 実 験 前 に ト レ ッ ド ミル 走 運 動 トレー ニ ング を行 わ せ て お り、 トレー ニ ング期 間 中 は電 気 シ ョ ック を与 え る こ とも あ る。 も しか した ら、 コ ン トロー ル 群 の ラ ッ トにお い て も、運 動
トレー ニ ン グ に よ り トレッ ドミル 装 置 が 危 険 で あ る こと を覚 え、 本 実 験 に お いて トレ ッ ドミル 装 置 に置 か れ た こ とで トレー ニ ン グ時 の電 気 シ ョッ ク の記 憶 を想 起 し、 そ の記 憶 想 起 の結 果 と してrk1/2リ ン酸 化 の 増 加 が 引 き起 こされ た 可 能 性 が 考 え られ る。 さ らに.S殿a鋤e璽esietal.(2002)
は 、そ の恐 怖 条 件 付 け刺 激 に よ る海 馬E虚 玉/2の リ ン酸 化 応 答 を検 討 し、
恐怖 条 件付 け刺 激 終 了 か ら30分 〜1時 間後 で海 馬Erk1/2リ ン酸 化 が 増 加 し.3時 間後 に は安 静 時 レベル に 戻 る こ と も報 告 して い る。 これ らの こ と か ら、運 動 終 了直 後 か ら6時 間 後 の 間 にE汰1/2リ ン酸化 が 増 加 し、6時 間 後 には 安 静 時 レベ ル まで 戻 って いた 可 能 性 が 高 い。
一 方 、一 過 性 運 動 に よ るAktリ ン酸 化 は み られ な か っ た 。 この 原 因 には
サ ンプ リ ングポ イ ン トと、解 析 したAktの リン酸 化 部 位 が 適 切 で な か った 可 能 性 が 考 え られ る。Iiietal.(2003)は 、恐 怖 条 件 付 け刺 激 終 了か ら 1〜2時 間 後 で 扁 桃 体 基 底 外 側核 のAktリ ン酸 化 が 上昇 し、2時 間半 後 に は 安 静 時 レベ ル に戻 る こ とを 明 らか に して いる 。 これ らの こ とか ら、E癒1/2
と同 様 に運 動 終 了 直後 か ら6時 間後 の 間 にAktリ ン酸化 が 増 加 し、そ して 安 静 時 レベ ル まで 戻 った 可 能 性 が 高 い。 また 。AktはSe雌73とTh娼08
の2つ の リン酸化 部 位 が 存 在 して お り、AktはTh608の リン酸 化 に よ り 活 性 化 され.Se盤73の リン酸 化 に よ り活 性 を高 め る ことや 特 異 性 を決 め る こ とが 示 唆 され て お り、Th608とSer473は 各 々独 立 の調 節 機 構 を有 して い る こ とが 明 らか に な っ て い る(Hersetal.,2011)。 した が ってOAkt活 性 応 答 を検 討 す る た め に はAktTh608とSe雌73の リ ン酸 化 を 検 討 す る
こ とが 必 要 で あ る。 本 実 験 で は 、AktSe雌73の リ ン酸 化 を解 析 した が 、2 週 間 の 自発 運 動 が 海 馬AktThr308の リ ン酸 化 を増 加 させ る が 、Akt