→ Quantitative Nuclease Protection Assay（qNPA™）は選択した 遺伝子を同時に解析することが可能
→ お客様の研究目的に応じてカスタマイズ
→ 正確かつ有用な解釈を行うための独自のインフォマティクスソ フトウェア
化合物がヒトの肝機能にどのような影響を及ぼすか研究する際に は、肝細胞を基盤とするInvitrogenの遺伝子発現サービスをご利用 ください。弊社は、チトクロムP450、第II相代謝、内在性代謝、肝 トランスポーターをはじめとする毒性学的および薬理学的に重要な 14種類のターゲット遺伝子のmRNAレベルを同時にモニターして、
さまざまな濃度または時点で化合物が初代培養肝細胞の代謝、細胞 シグナリング、輸送、細胞へのストレスに、及ぼす影響を測定しま す（図22）。
図22―qNPA™技術のマルチプレックスなアプローチにより、ヒト肝細胞の複
雑な遺伝子調節を測定できます。化学的用量反応曲線は、ケノデオキシコール 酸（CDCA）がABCB11（BSEP）とUGT1A1を 誘 導 し、SLCO1B1とHMGCS2の 発現量を減少させることを示しています。肝細胞は胆汁酸の濃度上昇を感知 すると、その濃度上昇に応じて自身の潜在的な排出能と抱合能を亢進させ、取 り込み能とコレステロール産生を低下させます。
トランスポーター細胞系分析サービス
→ 単独のトランスポーターをトランスフェクトした細胞系
→ 主要な肝および腎トランスポーターを過剰発現したヒト細胞系
Invitrogenでは、取り込みトランスポーターOATP1B1、OATP1B3、 OATP2B1、OCT2、OAT1またはOAT3を過剰発現した個々の細胞系 を用いるトランスポーター細胞系分析のサービスを間もなく開始す る予定です。このサービスによって、化合物が主要な取り込みトラ ンスポーターに及ぼす影響を評価することができます。
mRNAの相対量
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薬物代謝と安全性を試験するための
Invitrogen の製品とサービス
→ 代謝安定性に関する重要な情報を取得
→ 薬物代謝酵素との重要な相互作用を発見
→ リード化合物の安全性プロファイルを決定
新たな化学製剤および生物製剤候補の薬理学的、毒性学的、代謝的、薬物動態学的特性に関する情報を得ることは、
創薬および製剤開発の初期段階において重要です。弊社は、精製酵素、P450ミクロソーム、様々なアッセイ用ツール などのバリデーション済みツールやサービスを多数提供しており、リード化合物の代謝安定性、薬物代謝酵素との 相互作用、安全性プロファイルについて必要な情報を得るためのお手伝いをいたします。
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薬物代謝酵素（DME）は主に肝臓に局在する様々な酵素群です。薬 剤、環境汚染物質、ステロイドやプロスタグランジンなどの内因性 化合物などの広範な生体異物の代謝を担っています。薬物代謝酵素 およびその基質の構造-活性相関は、薬理学、毒性学、基礎酵素学に 関係する重要な研究分野となっています。薬剤開発が臨床段階で失 敗する主な原因は薬物動態が悪いことであるため、創薬プロセスの 早い段階から代謝研究を取り入れようという試みが多くなされてい ます。Invitrogenは、このような取り組みを促進するために組換え 薬物代謝酵素およびアッセイ系を提供しています。これらを使用す れば、代謝プロファイルについて様々な化合物のスクリーニング行 なうことが可能です。
ハイスループットスクリーニング系に適した P450 酵素
P450 BACULOSOMES®試薬は、ヒト肝臓ミクロソーム（HLM）より も優れています。その理由として、1種類のP450だけを発現するた め、他のP450（または別のクラスのDME）による代謝を回避して、
単一のアイソザイムを解析することが挙げられます。チトクロム P450 BACULOSOMES®試薬は、ヒトP450アイソザイムのcDNAと これを補足するウサギNADPH-P450還元酵素の遺伝子を導入した 組換えバキュロウイルスに感染させた昆虫細胞から調製したミクロ ソームです。
大部分の化合物において、P450 BACULOSOMES®試薬で得られた代 謝および阻害プロファイルに基づく化合物の順位は、HLMで得られ た順位ときわめて類似しています。しかし、P450 BACULOSOMES®
試薬の大部分の基質に対する活性や代謝速度は、HLMで調製した場 合よりも顕著に高くなります。これは、P450 BACULOSOMES®試薬 を使用したアッセイでは、ダイナミックレンジが広く感度が高いた めです。大部分のプローブ基質との反応において酵素活性と再現性 が高いことから、P450 BACULOSOMES®試薬は、ハイスループット
P450 BACULOSOMES® 試薬の詳細は www.invitrogen.com/baculosomeをご覧ください。
薬物代謝酵素とアッセイ系
スクリーニングフォーマットに最適です。CP450 BACULOSOMES®
試薬をVivid®ハイスループットアッセイ系に用いて得られたデータ
はLC-UV系のデータとよく相関することが、YP3A4アイソザイムを 用いた試験で示されています（図23）。
図23―BACULOSOMES®試薬を用いたCYP3A4のVivid®アッセイとLC-UV系アッ セイとの高い相関性。4種類の異なるVivid®基質を用いて12種類の既知のCYP3A4 阻害薬に対するIC50値を得たのち、CYP3A4 BACULOSOMES®試薬による伝統的な テストステロン6βヒドロキシル化LC-UVアッセイを用いて得られた値と比較し ました。Vivid®アッセイは、LC-UVアッセイの結果を十分に予測することができま した。
Substrate BOMCC BOMFC DBOMF BOMR
R2 0.93 0.89 0.77 0.77
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
log IC50 for Vivid® assay
log IC50 for LC-UV assay
一致性を示す直線
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新規リード化合物の選定を迅速化
Vivid®CYP450 Screening Kitは、創 薬 プ ロ セ ス の 初 期 にP450-薬 物相互作用について化合物を迅速にスクリーニングし、構造活性 相関（SAR）予測モデリング用のデータを得ることができます。
Vivid®CYP450 Screening Kitは、創薬における新規化合物の迅速な 選定に必要な高いパフォーマンス、スループット、信頼性を提供し ます。これらのアッセイ系の特徴は、以下のとおりです。
→ 簡単かつ均質―3ステップの「mix-and-read」フォーマットで、
反応停止試薬が不要です
→ 迅速かつ柔軟―キネティックモードとエンドポイントモードが あり、室温でも37℃でもアッセイ可能です
→ 高精度―シグナル-バックグラウンド比が高く、Z -factorが優 れています
→ 小規模化可能―アッセイは、96、384、1536ウェルプレートの いずれを用いても実施できます
Vivid® 基質はブロックされた色素であり、酸化的開裂が起こるまで
ほとんど蛍光を発しません（図24A）。2つの開裂可能部位のどちら かで切断されると、強い蛍光を発する代謝産物が生じます。P450阻 害物質は、蛍光代謝産物の産生阻害能により同定することができま す。3ステップのVivid®スクリーニングアッセイ（図24B）は、簡単 な「mix-and-read」プロトコルであり、キネティックモードでの反 応には反応停止試薬を必要としません。
Vivid®キ ッ ト と そ の 基 質 は、様 々 なP450ア イ ソ ザ イ ム に 対 応 し て い ま す（表16）。各 キ ッ ト に は、ア イ ソ ザ イ ム 特 異 的 なP450 BACULOSOMES®試薬、Vivid®基質、NADPH再生システムが含まれ ています。切断したVivid® 基質の励起および蛍光波長は可視領域で
あり、NADPHまたは大部分の試験化合物からの蛍光干渉はほとん
どありません。
Vivid®キットとその基質の詳細は、www.invitrogen.com/vividをご覧ください。
図24―Vivid®スクリーニングアッセイ。A. Vivid®基質は、P450酵素活性により開 裂すると蛍光を発します。B. 簡単な3ステッププロトコルを用いて、P450活性阻 害能について試験化合物を試験します。試験化合物をP450とVivid®基質を含有す る反応液に添加し、得られた蛍光の強さからP450活性阻害の程度がわかります。
)
R1 R2 R1' R2'
A
B
ブロックされた色素
（蛍光なし）
ステップ1 試験化合物を ウェルに添加
ステップ2 P450、NADPH、
再生システム を添加
ステップ3 NADP＋、Vivid®
基質を添加 蛍光シグナル 読み取り
阻害なし
（強い蛍光）
阻害あり
（蛍光なし）
遊離した色素
（強い蛍光）
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