84:29 20
8 1 27 。
57 5
CHNOS 60-2-2/CHNOS 59-9-1 。
4000
0:1 0:57
49 8
。
。
。
5 。
5
b -J 10 11."1 IJ;げ1:と病JJ�性の判定の基とした病斑型の境界を示す。
でイLむ;ぷなし、 ** 1%で有志差なし。
CHNOS 59-3-3/CHNOS 59-9-1 4013
)
*
と病原性が1:1に分離した。 これはK59に対する非病原性に1因子の遺伝子が作用していることを示す。
交配番号2129では病原性菌系が多く非病原性と病原性が1:1には適合しなかった。 これは， F，菌系の 発芽がK59に対する非病原性に連鎖している可能性が与えられる。 残りの交配3組合せ(交配醤号
3984， 3988， 4000)は， 非病原性と病原性がいず、れも3:1に分離した。 これは， 菌系CHNOS60-2-2及 びCHNOS60-2-3が片方の交配親として使用されている場合にみられ， K59に対する非病原性に2因子 の遺伝子が作用していることを示す。 病原性菌系問の交配2組合せ(交配番号3465， 4013)のF，菌系 群は， いすれもK59にすべて病原性であった。
(13) いもち病菌の交配により同定された非病原性遺伝子とその連鎖分析
12のイネ判別品種に噴霧接種した結果， 非病原性と病原性菌系が1:1に分離した場合， 1因子によ
る非病原性遺伝子が想定される。 接種したF，菌系数が30以上で， χ2検定により1:1の分離比に適合し た判別品種とF，菌系群について関与する非病原性遺伝子を表III-23に示した。 12判別品種のうち新2 号， 愛知旭， 石狩白毛， クサブエ， ツユアケ， ヤシロモチ， K60およびK59に対する非病原性遺伝子 が同定された。 表皿・23では， 交配親菌系が異なる場合は同じイネ品種に対する非病原性遺伝子であっ ても区別して表した。
表皿-23で同定された非病原性遺伝子問の連鎖をχ2検定した結果， 新2号/クサブエ(交配番号
3919) ， 新2号/ヤシロモチ(交配番号3919)， 石狩白毛/ヤシロモチ(交配番号3984， 3986， 3988 ) ， クサブエ/ヤシロモチ(交配番号3472)， クサブエ/K60(交配番号3919)及びヤシロモチ/
K60 (交配番号3919)の各々の判別品種に対する非病原性遺伝子に連鎖関係がみられた(表III-24)。
交配番号3936においても新2号/クサブエ及び新2号/ヤシロモチの各々に対する非病原性遺伝子に 連鎖関係がみられたが， との組合せのF，菌群では， 交配型の分離が異常であったため除外して考察し た。
考察
互いに特異的に対応するほ抗性遺伝子と(非)病原性遺伝子が相互作用して抵抗性反応を生ず るという考え方は「遺伝子対遺伝子J説と呼ばれ， アマとアマのさび病菌の問の特異性を遺伝学的に 研究した結果から提唱された九イネ品種のいもち病真性抵抗性遺伝子の解析は， 体系的に行われ，
これまで. 圏内では， 8つの遺伝子座に14の抵抗性遺伝子が同定されている。 したがって抵抗性遺伝 子と非病原性遺伝子が1 : 1に対応するとする「遺伝子対遺伝子」説に基づけば， イネいもち病菌に は14の非病原性遺伝子が存在することになる。 しかし イネいもち病菌問の交雑が困難であったた め. 病原菌側の特異的病原性因子(非病原性遺伝子)の解析は遅れていた。
研究では， レースの異なるイネいもち病菌の交配により新2号， 愛知旭， 石狩白毛， クサブエ，
ツユアケ， ヤシロモチ， K60， K59に対する品種特異的病原性に関わる非病原性遺伝子を同定した(表 ill-23)。 いもち病菌を4葉期のイネ苗に接種したとき， イネ葉身に現れる抵抗性病斑はいもち病真
-103-表皿-23 イネいもち病菌相互交配によるF，菌系群を判別品種に接種して同定された非病原性遺伝子
交配番号 交配組合せ 判別品種 非病原性遺伝子
3919 CHNOS 37-1-1/CHNOS 32-2-4 新2号 Aν-Shin2-1
3936 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-2-6 新2号 Av-Shin2-2
4000 CHNOS 60-2-2/CHNOS59-9-1 愛知旭 Av-Aichiasahi-1
4013 CHNOS 59-3-3/CHNOS59-9-1 愛知旭 Av-Aichiαsahi-2
3984 CHNOS 60-2-3/214 5-R-11 石狩白毛 Av-Ishikarishirokε-1
3986 CHNOS 60-2-3/2145-R-57 石狩白毛 AlノーIshikarishiroke-2
3988 CHNOS 60・2-3/3465-AR-15 石狩白毛 A\ノ-Ishikarishiroke-3
4000 CHNOS 60・2-2/CHNOS 59-9-1 石狩白毛 A\ノ-Ishikarishiroke-4
2151 CHNOS37・1-1/CHNOS 32-2-4 クサブ工 Av-Kusabue-1
3465 2145-R-10/2145-R-11 クサブエ Av-Kusabue-2
3472 CHNOS 37-1-3/2145-R-57 クサブエ Av-Kusαbue-3
3475 CHNOS37・1-1/2145・R-11 クサブエ Av-Kusabue-4
3919 CHNOS 37-1-1/CHNOS 32-2-4 クサブエ Av-Kusαbue-5
3936 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-3-6 クサブエ Av-Kusabue-6
2151 CHNOS 37-1-l/CHNOS 32-2-4 ツユアケ Av-Tsuyuake-1
3926 CI骨�OS 37-1-3/CHNOS 32-3-4 ツユアケ Av-Tsuyuake-2
3936 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-2-6 ツユアケ Av-Tsuyuake-3
2129 CHNOS 37-1-3/CHNOS 5-1-5 ヤシロモチ Aν-Yashiromochi-l
2151 CHNOS 37-1-l/CHNOS 32-2-4 ヤシロモチ Av- Yashiromochi-2
3465 2145-R-10/2145-R-11 ヤシロモチ Av-}'jαshiromochi-3
3472 CI骨�OS 37-1帽3/2145-R-57 ヤシロモチ Av-Yashiromochi-4
3475 CHNOS 37-1-1/2145-R-11 ヤシロモチ Av-Yashiromochi-5
3919 C回吋OS 37-1-l/CHNOS 32-2-4 ヤシロモチ Av- Yashiromochi-6
3926 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-3-4 ヤシロモチ Av-}'jαshiromochi-7
3936 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-2-6 ヤシロモチ Aν-Yashiromochi-8
3984 CHNOS 60-2-3/2145-R-11 ヤシロモチ Av-Yashiromochi-9
3986 CHNOS 60-2-3/2145-R-57 ヤシロモチ Av-Yashiromochi-1 0
3988 CHNOS 60-2-3/3465-AR-15 ヤシロモチ Av-Yashiromochi-11
3919 CHNOS37・1-1/CHNOS 32-2-4 K60 Av-K60-1
3960 2151-R-55/3472-R-58 K60 Av-K60-2
2145 CHNOS 37-1-1/CJ:骨�OS 12-2-1 K59 Av-K59-1
2151 CHNOS 37-1-1/CHNOS 32-2-4 K59 Aν-K59-2
2196 CHNOS 37-1-5/CHNOS 5-1-5 K59 Av-K59-3
3514 CHNOS37・1-3/FR10 K59 Av-K59-4
3919 CHNOS3?・1・1/CID吋OS 32-2-4 K59 Av-K59-5
3926 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-3-4 K59 Av-K59-6
3936 CHNOS 37-1-3/CI卦�OS 32-2-6 K59 Av-K59-7
交配組合せのうち斜体の菌系は判別品種に非病原性を示す。
-1 04
-表皿-24 イネいもち病菌非病原性遺伝子聞の連鎖
遺伝子対 交配番号 交配組合せ 両親型:組換型χ2(1:1) P Av-Kusabue-l/Av-Tsuyuake-l
Av・Kusαbue-l/Av-Yashiromochi-2 Av-Kusαbue-l/Av-K59-2
Av-Tsuyuake-l /Av-Yashiromochi-2 Av-Tsuyuake・1/Av-K59-2
Av-Yashiromochi-2/Av-K59-2 Av-Kusabue-2/A v-Yashiromochi-3 Av-Kusabue-3 /Av-Yasトziromochi-4 Av・Kusαbue-4/Av-Yashiromochi-5 Av-Shin2-1 /Av-Kusαbue-5 Av-Shin2-1/Av-Yashiromochi-6 Av-Shin2-1/Av-K60-1
Av-Shin2-1/Av-K59-5
Av・Kusabue-5/A v-Yashiromochi-6 Av・Kusabue-5/Av-K60-1
Av-Kusαbue-5/Av-K59-5
Av-}'jαshiromochi-6/Av-K60-1 Av-Yashiromochi-6/Av-K59-5 Av-K60-1/Av-K59-5
Av-Tsuyuake-2/Av-}'jαshiromochi-7 Av-Tsuyuake-2/Av-K59-6
Av-Yashiromochi-7/Av-K59-6 Av-Shin2-2/Av-Kusabue-6 Av-Shin2-2/Av-Yashiromochi-8 Av-Shin2-2/Av-K59・7
Av-Shin2-2/Av-Tsuyuake-3 Av-Kusαbue-6/Av-Yashiromochi-8 Av-Kusabue・6/Av-K59-7
Av-Kusabue-6/Av-Tsuyuake・3 Av-Yashiromochi-8/Av-K59-7 Av-Yashiromochi-8/Av-Tsuyuαke-3 Av・K59・7/Av-Tsuyuake-3
A斗ウムウ』司、dcd O N H C ，FF' TaA 噌I守/司3
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司ノ-司ノ-司ノ
-今ι 勺ι 今ム
31:32 37:26 29:34 39:24 27:36 29:34 3465 2145-R-10/2145-R-11 61:47 3472 CHNOS 37-1-3/2145-R-57 45:15 3475 CHNOS 37-1-1/2145-R-11 33:24 3919 CHNOS 37-1-l/CHNOS 32-2-4 32:10
3919 " 31:11
3919 " 29:13
3919 3919 3919 3919 3919 3919
"
"
"
"
"
"
3919 "
3926 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-3-4
3926 "
3926 "
3936 CHNOS 37-1-3/CHNOS 32-2・6
3936 "
3936 "
3936 3936 3936 3936 3936 3936 3936
"
"
"
"
"
"
"
Av-Ishikarishiroke-l/Av-Yashiromochi-9 3984 CHNOS 60-2-3/2145-R-11 Aν-Ishikarishiroke-2/Av-Yashiromochi-l0 3986 CHNOS 60-2-3/2145-R-57
0.02 1.92 0.40 3.57 1.29 0.40
0.90 0.17 0.53 0.06 0.26 0.53 1.81 0.18 15.00** 0.00 1.42 0.23 11.52川 0.00
9.52** 0.00 6.10* 0.01 18:24 0.86 0.35 27:15 3.43 0.06 33:9 13.71 * * 0.00 20:22 0.10 0.76 32:10 11.52村 0.00 23:19 0.38 0.54 21:21
16:21 16:21 21:16 50:18 48:20 48:20
0.00 0.68 0.68
1 0.41 0.41 0.68 0.41 15.06** 0.00 11.53村 0.00 11.53 * * 0.00
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Av-Ishikarishiroke-3 /A �ノーYashiromochi-ll 3988 CHNOS 60-2-3/3465-AR-15 47:11 22.34“ O.∞
Av-Aichiasahi・l/Aν-lshikarishiroke-4 4000 CHNOS 60-2-2/CHNOS59-9-11 18:19 0.03 0.87
* 5%で有意差なし、 村 1%で有意差なし。
-105恒
性抵抗性の種類により異なっている。 すなわち， とりで1号では肉眼でまったく病斑がみられないの に対し， 愛知胞や石狩白毛では多数の褐点病斑がみられる。 また， ヤシロモチでは， 一次支脈を越え る大きさになることもある。 真性抵抗性遺伝子pi shは ほ抗性反応であっても， 発病時の温度など によってはさらに拡大した病斑を形成する。 本実験においてイネいもち病菌の交配により得られたF1
菌系群を判別品種に噴霧接種したとき非病原性と病原性の菌系数は， 期待される比率にあわない場合 がみられた。 この現象は， とくに判別品種新2号やクサブエなどにみられた。 pi shなど病斑のある 程度拡大する真性低抗性遺伝子が関与したため非病原性と病原性の境が明瞭でなかったことが原因と
して考えられる。 そのなかでもイネいもち病菌CHNOS37-1-1X CHNOS32-2-4 (交配番号3919)にお いて， 程度がやや低かったが， 新2号 クサブエ ヤシロモチ K60の4品種の各々に対する非病原 性遺伝子の聞に連鎖関係がみられた。 これらの4品種の中で新2号， クサブエ及びK60は， 共通の丙 性抵抗性遺伝子Pishを持っていることから非病原性遺伝子Av-Shin2・1， Aν-Kusabue・5， Aν-K60-1は同ー である可能性がある。 一方， 愛知旭などに対する病斑型の判定は容易で分離比は期待された比率に適 合した。 本研究で同定可能と考えられる非病原性遺伝子は， Shin2， Aichiasahi，
Av-Ishikarishiroke， Av-Kusabue， Av-Tsuyuake， A\ノーYashiromochi， Av-K60及ひ(Aν-K59である。
これまでに同定されたイネいもち病菌の非病原性遺伝子は， POS1 (品種51583に対する非病原性 遺伝子， 以下同様)， POS2 (Sha-tiao-tsao) ， POS3 (K59) ， POS4 (Kinandong) 41)， Avr1-C039 ( C039) 77)， Aνr1・CIC6 (CICA6) 62)など多数あるが， その多くが遺伝分析されていないイネ品種に対 して検出・同定されたものであり， また， 供試したイネいもち病菌が異なるため本研究で同定された 非病原性遺伝子との関連を直接検討することはできなかった。
第3節 非病原 性遺伝子のマッピング
非病原性遺伝子の単離のための基礎的知見を得るためRFLPマーカーによるイネいもち病菌非 病原性遺伝子のマッピングを行った。
材料および方法 (1)供試菌及び品種
ひとつのイネいもち病菌の交配後代系統を用いて， 多くの非病原性遺伝子を座乗させるにはでき るだけイネ品種に対する病原性のスペクトラムの異なる菌系を用いると効率が良い。 イネいもち病菌 の交配親菌系として交配型Mat1-1のCHNOS37・1-1及び交配型Mat1・2のCHNOS32・2-4を用いた。 両菌株 とも中国雲南省のイネから分離されたもので， 特にCHNOS37-1-1菌株は陸稲から分離されている。
供試イネ品種として従来の日本の判別体系9品種のうち関東日号をクサブエに代え， 清沢の判別品種 に使われているK60， BL1， K59を加えた12判別品種を用いた。 これらの判別品種に対する交配親菌
-106-系の病原性を表ill-25に示した。 半Ij別品種に対する反応を病斑型でタイプOからタイプ5の6段階に 分け， タイプOから2までを低抗性反応， タイプ3から5までを，寵病性反応とすると交配親株のレー スは， 菌系CHNOS37-1-1が126.0， 菌系CHNOS32-2-4が017.5になる。 対峠培養20日後に形成された-f のう殻を潰しランダムに単離した82子のう胞子分離菌系を供試し， 病原性， 交配型及びRFLPマーカー の分離を調査した。 病原性検定は第3章第1節に示した方法に従い， 子のう胞子菌株を培養し形成さ せた分生胞子懸濁液を判別品種に噴霧接種した。 交配型の検定は第2章第2節に示した方法によった。
(2)RFLPマーカー
イネいもち病菌菌系CHNOS37-1・1をCM液体培地で静置培養して得た菌糸を液体窒素で凍結後，
乳鉢で破砕しCTAB法によりより核DNAを抽出した。 制限酵素BamHIまたはPstIで、消化後， 0.5 "-' 4.0kb断片を分画し， フラスミドベクターブルースクリフトへ連結し大腸菌NM522で形質転換しライ ブラリーを構築した。 また， 交配親株菌糸DNAを6種類の制限酵素， Bam日， Eco悶， HindIII，
PstI， Sa江， XbaIで消化し， 2"-'3μgをアガロースゲル電気泳動により分画し， ナイロンフィルター (Hybond N)へ転写しuvで固定した。 ゲノムライブラリーの任意の200クローンから調製した挿入 DNAをプローブとして， ハイブリダイゼーションを行いバンドを化学発光標識(アマシャムECLシ ステム)により検出した。
(3)連鎖解析
灯LPの連鎖地図の作成は， 遺伝子地図作成プログラムMAPL CYer.2.3 ， 鵜飼 保雄， 東京大学)
を使用した。 MAPLでは原データの読み込み， 各R孔P の分離比の計算， R乱P座の全組合せの対につ いて2座の分離比の計算， 2座間の連鎖の有無の検定， 連鎖が有意な場合の組換価とその標準誤差の 推定， 組換価に基づいてRFLP座を連鎖群へ群別， RFLP群について群内の順序決定などを行い連鎖地 図を作成した。
実験結果
( 1)非病原性遺伝子の同定
抵抗性遺伝子pi k-mをもっイネ品種「ツユアケJに対して， 菌系CHNOS37-1・1は権病性， 菌系 CHNOS32-2-4は抵抗性反応を示した(表ill-25)。 第2節において実施したイネいもち病菌のイネ判 別品種に対する非病原性の遺伝子解析から82F1菌系のツユアケに対する反応は， 抵抗性反応と躍病性 反応が1:1に分離し， CHNOS32-2-4 菌株に1因子支配の非病原性遺伝子が同定された(表皿-15)。 同 様にして品種「新2号J， IクサブエJ， IヤシロモチJ， 1K59Jに非病原性遺伝子が同定された (表ill-9， 14， 17， 22)。 これらの非病原性遺伝子をAv-Kusabue-l， Aν-Tsuyuake-l， Av・均shiromochi掛 2， Av-K59・2， Alノ-Shin2と命名した(表皿-23， 26)。
(2)RFLPクローンの探索
RFLP地図を作成するためRFLPマーカーを作出した。 RFLP分析に用いる場合， 交配親菌系はでき