第1節 緒言
アレノレギ一反応が引き起こされるとき、 一部の食品添加物がその発症に重要 な役割を演じることが知られているが、 その作用機構についてはほとんど明ら かにされていない。 日常の食生活に注目すると、 多くの食品添加物や化学物質 に固まれていることに気がつく。 食品添加物は着色、 保存、 着香など、 われわ れの利益になるように使用されているが、 それらに対する多くの副作用も報告 されている。 例えば、 亜硫酸晦は端息を、 タートラジンはじんましんをそれぞ れ引き起こし(Tarlo et al.， 1993; Weber， 1993; Wuhrich， 1993)、 アナト一色素 はアナフィラキシ一反応を引き起こすことが報告されている(Nish et al.
1991)。
香辛料は食品に風味を付与するほかに腐敗や細菌の繁殖を防ぐ働きがあり
(Adegoke et al.， 1994)、 様々な保存食に利用されてきた。 しかし、 香辛料の 免疫調節機能についてはほとんど明らかにされていなし、。 そこで、 本章におい ては食品中の微量成分として香辛料を選び、 それらが抗体産生に及ぼす影響に ついて検討した。 香辛料が生体に及ぼす影響についてはここ数十年間に数多 くが報告されてきた。 香辛料の薬理作用としては、 クロープおよびガラムマサ ラの抗腫場作用(Zheng et aJ.， 1992; Rao et a人1995)、 黒胡淑およびCapsicum annumの抗変異原性作用(Higashimoto et aJ.， 1993; Azizan， et aJ.， 1995)などが 報告され、 反対に副作用としては、 香辛料の摂食によるアレノレギー症状の惹起 や(Sastreet al.， 1996)、 赤とうがらしの摂取による皮膚炎の発症(Cooper et
al.， 1996; Kanerva et aJ.， 1996)および、aniseedによる端息の発症(Fraj et al.，
1996)などが報告されている。 一方、 生体の免疫機構に及ぼす影響については、
ヨーロッパにおける「セロリ ・ニンジン ・ ヨモギ・香辛料症候群Jにおいてニ ンジン特異的IgEの産生に香辛料が関与することが報告されたり(Helbling et
a人1993)、 また香辛料中のアレルゲンが花粉や野菜中のアレルゲンと交差反
応するという報告(Niinimaki et aJ.， 1995)はあるが、 抗体産生に及ぼす影響に ついてはほとんど報告されていなし、。 そこで、 マウス牌臓リンパ球の抗体産メ に及ぼす種々の香辛料の影響について検討した。
食品および環境アレノレゲンに対するアレルギーは主として I型アレルギ一反 応により引き起こされるが、 この反応においてはアレルゲン特異的IgEの誘導 が重要な役割を演じる(Metcalfe， 1991)。 一方、 アレルゲン特異的IgAはアレ ノレゲンの腸管吸収を阻害することによりアレルギーの発症を抑制するo また、
アレノレゲン特異的IgGはIgEとの競合により I型アレルギーを抑制する。 そこで、
本研究ではマウス牌臓リンパ球およびWEHI-279細胞の各種の抗体産生に及ぼ す香辛料の影響について検討した。
第2節 実験方法
第1 r頁細胞調製および細胞培養
マウス牌臓リンパ球は、 8週齢雄のBalb/cマウス(セアック吉富、 吉富)より 採取した。 リンパ球を得るために、 マウスをエーテル麻酔下で屠殺し、 牌臓を 摘出した。 RPMI-1640(日水製薬、 東京)培地中で牌臓をすりつぶしてリンパ 球を渉出させ、 Lympholyte-Mouse (Cedarlane社， Hornby， Canada)を用いて密度 勾配分離法によりリンパ球画分を得た。 牌臓より分離したリンパ球は、 10%ウ シ胎児血清(Intergen社， Purchase， NY)存在下でRPMI-1640培地(日水製薬) を用いて細胞数を2x 106 cells/mlに調整し、 5%C02インキュベータで72時間培 養した。 樹立細胞株として、 九州大学医学部付属生体防御医学研究所から提供
されたWEHI-279細胞を用いた。 WEHI-279細胞は10%ウシ胎児血清(FBS;
GIBCOBRL社， Grand Island， NY)を合むRPMI-1640培地(日水製薬)を用い て細胞数を1X 105 cells/mlに調整し、 5%C02環境下において継代培養した。 マ
ウス抗体の定量には、 固相抗体には抗IgG抗体はヤギ抗マウスIgG(Zymed社，
San Francisco， CA)を、 抗IgE抗体はラット抗マウスIgE(EIU社， Brussels，
Belgium)を、 抗IgM抗体はウサギ抗マウスIgM F(ab')2断片(Zymed社)を、
抗19A抗体はウサギ抗マウスIgA(Zymed社)を用いた。 酵素標識抗体にはベル オキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗マウスIgG F(ab')2 断片(Z抑ned社)、 HRP 標識ウサギ抗マウスIgM F(ab')2断片(Zymed社)およびHRP標識ウサギ抗マウ スIgA(Zymed社)を用いた。 またIgE定量においてはビオチン標識ラット抗マ ウスIgE(EIU社)、 およびHRP標識ストレプトアビジン(Prozyme社， San Lean dro， CA)を用いた。
第21頁 香辛料のエタノール抽出液の調製
オールスパイスパウダー、 オニオンパウダ一、 ニンニク、 カレーパウダ一、
グロープ、 黒胡板、 白胡板、 内洋わさび、 シナモン、 ショウガ、 セージ、 タイ ム、 チリパウダ一、 赤とうがらし、 ナツメグ、 パプリカは福岡市内のスーパー マーケットで調味料として販売されている物を購入した。 各香辛料19をホモジ ナイザーで挽き、 これにエタノール10mlを加えてエタノール可溶成分を30分間 抽出した。 このときの濃度を10 g/mlとして計算して、 最大濃度(添加後の終濃 度として)を100μg/mlになるように調整した。 これを0.001μg/mlまで希釈し、
Do se-respon se曲線を作製した。
第3項 酵素抗体法
培養上清中の免疫グロプリン濃度は酵素抗体法を用いて定量した(Yama da
et aJ.， 1993) 0 IgGおよびIgMの定量には直接法を用い、 IgEの定量にはアビジ ンービオチン法を用いた。 まず、 96穴イムノプレートに固相抗体を加えて370Cに て1時間保温し、 TPBSで 3回洗浄した。 次に、 ブロッキング液を加え、 370Cに て1時間保温もしくは40Cにて一晩放置した後、 洗浄した。 これ以後の洗浄操 作ではアビジンービオチン法で各4回、 直接法で各3回行った。 次に、 一次抗体 (サンプノレ上清)を加えて370Cで1時間保温し、 洗浄した。 IgE定量ではさらに
次抗体を加えて370Cにて1時間保温し、 洗浄した。 最後に、 酵素標識抗体を 加えて370Cで 1 時間保温して、 洗浄液で洗浄後、 基質溶液を加えて370Cで15 分 間反応後、 反応停止液を加えて415nmで吸光度を測定した。
第3節 結果
第1 !頁 マウス牌臓リンパ球の抗体産生に及ぼす香辛料抽出液の影響
まず、 マウス牌臓リンパ球の抗体産生に及ぼす香辛料抽出液の影響について 検討した。 Table 4-1に示したように、 IgM濃度に及ぼす影響については、 各サ ンプノレは終濃度10μg/ml以下の濃度では、 抗体濃度に影響を及ぼさないことが 明らかとなった。
Table 4-1. Do se-dependen t Effect of Ethan ol Extracts of Spices on
IgM Production by Mouse Spleen Lymph ocytes.
Relative IgM content
Spice 10-3 10-2 10-1 100 101 102μg/ml
Allspice powder 1.0 0.89 0.75 1.03 1.03 0.96 Onion powder 1.06 1.03 0.91 0.91 0.91 0.86
Garlic 1.07 0.85 0.86 0.85 0.79 0.68
Cur巧/ 1.4 1.1 1.0 1.07 1.0 0.81
Clove powder 1.2 0.91 0.82 0.88 0.89 1.05 Pepper， black 1.2 0.75 0.88 0.89 0.86 0.88 Pepper， white 1.2 0.92 1.07 0.95 0.84 0.95 Horseradish 1.1 0.91 0.95 0.93 0.79 0.91 Cinnamon 1.2 1.09 1.05 1.09 0.97 0.18 Ginger 0.94 0.88 0.90 0.79 0.68 0.32 Sage powder 1.2 0.87 0.90 0.97 0.75 0.08 Thyme powder 1.05 1.02 1.05 0.94 0.98 0.39 Chili powder 1.2 0.93 0.96 0.98 0.83 1.3 Red pepper 1.1 1.4 1.01 1.5 0.86 0.97 Nutmeg 1.1 0.86 0.86 1.01 0.85 0.47 Paprika powder 0.96 1.6 0.95 1.4 3.2 1.05 IgM concentration of the control culture was 1.3 mg/ml.
100μg/mlにおいては、 オールスパイスパウダ一、 オニオンパウダ一、 カレー パウダ一、 クロープ、 黒胡搬、 白胡淑、 西洋わさび、 赤とうがらし、 パプリカ は、 抗体濃度には影響を及ぼさなかったが、 ニンニクは抗体濃度をやや低下さ せ、 シナモン、 ショウガ、 セージ、 タイム、 ナツメグは強い低下作用を示した。
しかし、 シナモン、 セージ、 タイムについては、 細胞の生存率が70%以下であっ たことを考慮すると、 この低下作用は細胞毒性によるものと考えられる。 一方、
チリパウダーは100μg/mlにおいて抗体濃度を上昇させる効果が認められた。
IgG産生に及ぼす影響については、 Table 4-2に示したようにオーノレスパイス パウダ一、 オニオンパウダ一、 ニンニク、 カレーパウダ一、 グロープ、 黒胡板、
胡淑、 西洋わさびは終濃度10μg/ml以下の濃度では、 抗体濃度を上昇させる 傾向が認められた。 特に、 0.001μg/mlにおいてやや強い上昇効果を示した。
方、 シナモン、 ショウガ、 セージ、 タイム、 チリパウダ一、 赤とうがらし、 ナ ツメグ、 パプリカは抗体濃度に影響を及ぼさないことが認められた。
IgA産生に及ぼす影響においては、 Table 4-3に示したようにオーノレスパイス パウダ一、 オニオンパウダ一、 ニンニクにおいて1μg/ml以上の濃度で抗体濃度 を上昇させるやや強い効果が認められた。 それ以外の香辛料には抗体濃度には 影響しなかった。 ここで、 シナモン、 ショウガ、 セージ、 タイムに見られた IgA濃度低下作用はIgMのときと同様に細胞毒性が原因と思われる。
Table 4-2. Do se-depen dent E f fect of Ethan ol Extract s of Spic es on IgG Product ion by Mou se Sp leen Lym phocytes.
Relative IgG content
Spice 10-3 10-2 10・1 100 101 102μg/ml
Allspice powder 1.7 1.2 1.3 1.2 1.4 1.5 Onion powder 1.5 1.5 1.2 1.3 1.02 1.3
Garlic 1.6 1.2 1.3 1.0 1.0 1.0
Curη/ 1.6 1.4 1.4 1.3 1.2 1.3
Clove powder 1.8 1.09 1.2 1.08 1.1 1.5 Pepper， black 1.6 1.09 1.04 0.94 1.1 1.02 Pepper， white 1.6 1.08 1.2 1.2 1.08 1.3 Horseradish 1.6 1.0 0.94 1.1 1.0 1.3 Cinnamon 1.2 1.1 1.09 1.06 0.98 0.22
Ginger 1.1 1.06 1.0 0.95 0.91 0.50
Sage powder 1.2 1.05 1.0 1.05 0.88 0.07 Thyme powder 1.2 1.04 1.01 1.0 1.03 0.56 Chili powder 1.2 0.96 1.02 0.97 1.02 1.04 Red pepper 1.1 0.97 0.91 0.97 0.94 1.02 Nutmeg 1.07 0.97 0.88 0.95 0.94 0.63 Paprika powder 1.08 1.02 0.91 。 1.2 1.06 IgG con centratio n of the control c u lture wa s 2.2 ng/ml.
Tab le 4-3. Dose-dependent E ffect of Ethanol Ext r act s of Spic es o n IgA Produc tion by Mouse Sp leen Lymphocytes.
Relative IgA content
Spice 10-3 10-2 10-1 100 101 102μg/ml
Allspice powder 1.7 1.7 1.3 1.7 1.5 1.9 Onion powder 1.3 1.3 0.96 1.9 1.6 1.6
Garlic 1.7 1.3 0.83 1.7 1.2 1.5
Curry 1.2 1.5 0.57 1.6 1.2 1.09
Clove powder 1.3 1.09 0.7 1.3 1.2 1.09 Pepper， black 0.96 1.09 0.32 1.2 0.96 0.96 Pepper， white 1.09 0.83 0.44 1.3 0.83 0.96 Horseradish 1.3 1.2 0.44 1.09 1.09 0.96 Cinnamon 0.96 1.2 0.86 1.4 1.2 0.61
Ginger 1.2 1.3 1.0 1.2 1.01 0.77
Sage powder 0.94 1.2 1.1 1.3 1.3 0.52 Thyme powder 1.06 0.97 1.2 1.1 0.98 0.63 Chili powder 1.2 1.04 1.02 1.3 1.2 1.06 Red pepper 1.1 1.1 0.94 0.91 0.96 1.2 Nutmeg 0.91 0.98 0.97 1.01 0.97 0.59 Paprika powder 1.09 1.05 1.01 1.09 1.2 1.3
IgA concentration of the control culture was 1.1 ng/ml.
第21頁 WEH卜279細胞の抗体産生に及ぼす香辛料抽出液の影響
つぎに、 B細胞の抗体産生に及ぼす香辛料抽出液の影響を直接検討するため に、 マウスBリンパ腫WEHI-279細胞を用いて牌臓リンパ球の時と同様の実験を 行った。 WEHI-279細胞を培養したときの培養上清中におけるIgMおよび、IgG抗 体濃度を測定した。 その結果、 Table 4-4に示したように上清中のIgM濃度にお
いては、 オールスパイスパウダーが低濃度領域においてやや上昇させる結果が 得られたが、 それ以外の香辛料には抗体濃度の調節効果は認められなかった。
Table 4-4. Dose-dep endent Eff ect of Ethan ol Ext r a cts of Spic es o n IgM Production by WEHI-279 Cells.
Relative IgM content
Spice 10-3 10-2 10-1 100 101 102μg/ml
Allspice powder 1.3 1.3 1.2 1.3 1.2 1.2 Onion powder 1.3 1.2 1.2 1.2 1.2 1.1
Garlic 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2 1.2
Cur巧/ 1.2 1.2 1.1 1.2 1.06 1.09
Clove powder 1.2 1.1 1.1 1.2 1.1 1.1 Pepper， black 1.2 1.1 1.07 1.1 1.03 1.05 Pepper， white 1.2 1.2 1.08 1.1 1.03 0.96 Horseradish 1.07 1.08 1.02 1.06 0.95 1.0 Cinnamon 1.1 1.06 1.07 1.07 1.06 1.0
Ginger 1.04 1.1 1.02 1.04 0.98 0.95
Sage powder 1.06 1.05 1.01 1.08 1.0 1.0 Thyme powder 1.07 1.09 1.02 1.05 1.08 0.86 Chili powder 1.01 1.02 1.05 1.2 1.01 1.01 Red pepper 1.01 1.09 1.02 1.05 1.0 1.0 Nutmeg 1.06 1.1 1.05 1.08 1.0 0.92 Paprika powder 1.02 1.04 0.98 1.06 1.0 0.94 IgM concentration of the control culture was 5.4 mg/ml.
方、 IgG濃度においては、 Table 4-5に示したように各香辛料抽出液は低濃 度領域において上昇させる効果を有することが明らかとなった。 シナモン、 ショ
ウガ、 セージ、 タイムは0.001μg/mlにおいて特に強く上昇させることが確認さ れた。 しかし、 WEHI-279細胞の抗体産生に及ぼす香辛料の影響は、 マウス牌 臓リンパ球ほど強くは認められなかった。
Table 4-5. Dose-dep endent Eff ect of Ethan o l Extracts of Spic es on
IgG Production by W EHI-2 79 Cells.
Spice
Allspice powder Onion powder Garlic
Cur巧f
Clove powder Pepper， black Pepper， white Horseradish Cinnamon Ginger
Sage powder Thyme powder Chili powder Red pepper Nutmeg
Paprika powder
Relative IgG content
10-3 10-2 10-1 100 101 102はIml
1.3 1.2 1.2 1.2 0.97 1.1
1.3 1.2 1.2 1.1 1.08 1.01
1.3 1.2 1.1 1.1 1.07 1.02
1.2 1.2 1.1 1.1 1.05 1.01
1.2 1.1 1.09 1.08 1.04 1.0 1.2 1.1 1.06 1.05 0.97 0.94 1.2 1.09 1.02 1.03 1.0 0.81 1.2 1.1 1.09 1.05 1.01 1.04
1.4 1.4 1.4 1.4 1.5 1.3
1.4 1.4 1.3 1.3 1.3 1.2
1.5 1.4 1.3 1.3 1.2 1.0
1.4 1.3 1.1 1.2 0.97 0.71
1.4 1.2 1.2 1.2 1.1 1.2
1.3 1.1 1.1 1.02 1.04 1.08
1.2 1.2 1.0 1.0 1.04 1.0
1.02 1.04 0.98 1.06 1.0 0.94
IgG con cen tration of the control culture was 12.8 ng/ml.
第31;頁 マウス牌臓リンパ球の抗体産生に及ぼすオイゲノールの影響
多くの香辛料には脂溶性物質であるオイゲノールが合まれているo 本実験に おいて見出されたセージ、 タイムの抗体産生調節活性に対してオイゲノールが どのように関与しているかを検討した。 オイゲノールを10-5，，-， 103 �Mの濃度で、
マウス牌臓リンパ球に添加し、 10%FBS合有RPMI-1640培地で培養した。 72時 間培養後の上清中抗体濃度を酵素抗体法で測定した。 その結果、 Table 4-6にノハ
したように、 オイゲノールには抗体産生調節活性は認められなかった。 100μM 以上の濃度における各抗体濃度の低下作用は牌臓リンパ球の生存率が50%以下 であったことから、 細胞毒性によるものであると考えられた。
Table 4-6. Dose-dependen t Effect of Eugen ol on
lmmun oglobulin Production by Mo use Spleen Lymphocytes.
Sample Concentration Relative Ig content (μM)
IgM IgG IgA
Control 。 1.0 1.0 1.0
Eugenol 10-5 1.1 1.1 1.0
10-4 1.1 1.1 1.0
10-3 1.0 1.0 1.0
10-2 1.2 1.1 1.0
10-1 1.1 1.1 1.0
100 1.2 1.2 1.1
101 1.3 1.3 1.1
102 0.8 1.1 0.8
103 。 。 。
Ig concentrations of the control culture were 7.5 �g/ml for IgM， 164.5 ng/
ml for IgG and 91.7 ng/ml for IgA.
第41頁 WEH卜279細胞の抗体産生に及ぼすオイゲノールの影響
マウス牌臓リンパ球において、 オイゲノールは抗体産生に影響を及ぼさない ことが示された。 牌臓リンパ球はTおよびBリンパ球の混合細胞系であるので、