評価方法

核数計数にはNucleoCounter^TM (Chemometic)、NucleoCasset^TM (Chemometic：941-0002)を用い た。サンプルカセット内部には、ヨウ化プロピディウム(PI)が封入されており、サンプルの 吸引と同時に細胞核の染色が行われる。装置内では、緑色励起光によりDNA内の PIが赤 色光を放出する。これをCCDカメラで測定する。

NucleoCounter^TMによる核数計数

胚様体培養では96穴マルチウェルプレートから胚様体を1個回収し、クライオチューブに 加えた。細胞処理試薬ReagentA (Chemometic)を100~300 μL加えピペッティングによって胚 様体を崩したのち、等量の細胞処理試薬ReagentB (Chemometic)を加えた。

中空糸培養では培養終了後の中空糸バンドルをハサミによって細断したのち、クエン酸溶 液(21 mg/mL)中で超音波ホモジナイザーによってホモジナイズし、細胞中より核を遊離させ た。その後クエン酸溶液と等量の細胞処理試薬 ReagentB (Chemometic)を加えた。それぞれ のサンプルをNucleoCassetで吸入し、NucleoCounterで測定を行った。

細胞には2核の細胞が存在するため、今回用いたマウスES 細胞では2 核の割合を1.07 と して、核数を細胞数に換算した。

造血幹細胞の定量評価

本実験ではセルファンクションアナライザー(Guava PCA;GE Healthcare)を使用した。Guava

PCAにはMicroLOCTMという独自のキャピラリー方式が採用されており、個々の細胞を迅

速に解析することができる。検出器は高感度レーザー方式である。目的の細胞を蛍光標識し たサンプルをキャピラリー内に通過させ、キャピラリーにレーザーを照射することで蛍光 標識がレーザー光により励起され、特定波長の蛍光を発する。

操作手順を以下に記す。

中空糸内部の細胞の回収

Guava PCA による評価手法を行うためには、中空糸内部に存在する細胞を回収する必要が

ある。回収方法、手順を以下に示す(Fig. 3.5)。分化誘導培地の入った60 mmディッシュから 細胞回収用の中空糸バンドルを取り出し、PBS(-)で培地を洗い流したのち、細胞を中空糸壁 面から剥離させるために0.25 % Trypsin/0.02 % EDTAが6 mL入った60 mm ディッシュに中 空糸バンドルを移し、10分間旋回しながらインキュベートした(45 rpm, 37 ºC, 5 % CO2)。

酵素処理後、分化誘導培地が6 mL入った60 mmディッシュに中空糸バンドルを移し酵素 反応を停止させた。酵素処理後の中空糸バンドルから栓を取り外して、2.5 mL シリンジを はめた。中空糸の先端部を培地につけ、はさみで先端部を切断してシリンジを軽く引き、培 地ごと吸引することで中空糸内部から細胞を回収し、空の15 mLチューブに押し出した。

第3章 マウスES細胞を用いた造血幹細胞取得のための培養プロセス構築に関する諸検討

Fig. 3.5 A schematic illustration of harvesting cell from hollow fiber bundle

c-kit, sca-1抗体処理

・PBS(-)にMouse serum(CEDARLANE : CL8000)を加え5 % Mouse serum/PBSを調整した。

これをmedium A とした。

・PBS(-)に10 % BSA Diluent/Brocking Solution (KPL : 50-61-01)を加え0.5 % BSA/PBS を調整した。これをmedium B とした。

前述した酵素処理によって回収した分散状態のマウス ES 細胞を細胞計数し、2.0×10⁵ cells

にmedium Aを10 μL加えたものを2本作製し、それぞれアイソタイプコントロールおよび

ポジティブコントロールサンプルとした。それぞれのサンプルへアイソタイプコントロー ル と し て PE Rat IgG2b Isotype Control (CLCR2B04) 、 PE-Cy5 Rat IgG2b Isotype Control(CLCR2B06)をそれぞれ2 µLずつ、ポジティブコントロールとして PE labeled Anti-Mouse Sca-1 Monoclonal Antibody (D052-5)を 16 µL、PE-Cy5 Anti Mouse CD117 Monoclonal

Antibody(CL8943TC)を0.5 µL添加した。その後暗所、室温で30分間インキュベートし抗体

処理を行った。処理後、medium Aを200 µL加え、遠心洗浄を3回行い、medium B 300 µL

～500 µLに再懸濁し、Guava PCAで解析を行った。