49
考察
4-1 ジクマロールの阻害方法について
非複製エピソームDNAを評価するためのアッセイ法を確立した。このアッセ イ法は、すべての HBV の遺伝子型に共通する cccDNA の環状という構造に着 目した実験系であり、既存のHBVのスクリーニング系とは大きく異なっている [18][35]。このアッセイ法を使用して、我々は薬剤ライブラリーをスクリーニン グし、ジクマロールをLeDNAの阻害剤として同定し、ジクマロールが実際に核 内に存在する環状DNAを減少させることを実証した（図13 C）。また、このレ ンチウイルスのアッセイは HBV の遺伝子を含んでいないが、ジクマロールは HBV の複製を阻害した（図 14-27）。 HBV 生活環の各段階の遮断は HBV
cccDNAを減少させる可能性があるので、HBV生活環のどの段階がジクマロー
ルの影響を受けるかを同定する必要がある。ジクマロールは、HBV感染細胞の 細胞内HBV RNA、DNA、上清HBV DNA 、HBe、およびHBsの転写、タン パク質発現を有意に阻害した（図16-18）。しかし、1.3倍長のHBVゲノムから HBV を安定発現する細胞では、細胞内 HBc 発現はほとんど影響を受けなかっ た（図 26）。一方、cccDNA 発現は著しく減少した（図 23-25）。これらの結果 は、ジクマロールが宿主RNAポリメラーゼを介したHBV転写に影響を及ぼさ ないが、cccDNAレベルを特異的に阻害することを示唆した。 LeDNAとHBV cccDNAはどちらも核内に環状dsDNAとして存在し、複製起点はない。よって、
ジクマロールの潜在的な標的は、それらの形成または安定性の過程である可能 性がある。 LeDNA の場合、最初のレンチウイルス感染後に産生されるが、複 製起点が無いので、再合成されない。一方、HBV cccDNAの減少はジクマロー ルによって強く誘導された（図 25）。 HBV cccDNA は薬剤除去後に残存する と、HBV 複製サイクルを開始するので[36][37]、ジクマロール処理が感染細胞 中のHBV cccDNAを完全に除去できるかどうかは興味深い問題である。さらに、
ジクマロール処理は、HBV直鎖状DNA、rcDNA、およびcccDNAの減少を誘 導した（図 23-25）。ジクマロールが HBV cccDNA だけでなくすべての HBV DNA 形態をも阻害する可能性がある。これらの問題は、HBV 感染を伴う長期 間のインビトロおよびインビボ試験によって解決されるべきである。
4-2 ジクマロール類似体での抗 HBV 活性評価
ジクマロール関連化合物、クマリン、ワルファリン、および7－ヒドロキシ－
4－メチルクマリンはHBVのレプリケーションを阻害しなかったことから（図
31）、ジクマロールが VKOR 阻害によって HBV のレプリケーションを阻害し
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ているわけではないことが分かった。よって、他のシグナル経路を阻害する可能 性が示唆された。また、ジクマロールの抗 HBVの活性中心が未だ不明なので、
さらなるジクマロール類似体の抗HBV効果の検証が必要である。
ジクマロール類似体のさらなる評価によって、抗HBV活性に中心的な官能基が 発見できれば、ジクマロールよりも低濃度で抗HBV活性を示す化合物を発見す ることができると考えられる。
また、将来的な臨床での利用を考慮すると、EC50の濃度は、nMの濃度であ る必要がある。実際、臨床で使われている3TCのEC50が100 nMであるのに 対して[38]、ジクマロールのEC50は40 μMである（図15）。よって、ジクマ ロールの抗 HBV薬剤としての臨床利用には投与方法などの改良が必要である。
最後に、溶解性の問題がある。ジクマロールは難水溶性の化合物であり、
DMSM、ピリジン、水酸化ナトリウムに対して溶解性を示す[39]。しかし、それ らの溶媒は毒性を示す。よって、毒性の低い溶媒の選択と溶解性についてを考慮 した創薬が必要である。
4-3 ジクマロールのインビボ試験での抗 HBV 活性評価
BALBマウスと、Scid マウスを使ったジクマロールのインビボでの毒性評価 の実験より、ジクマロールは大きな毒性を示さないことが分かった（図29, 30）。 この結果より、HBVに感染させたヒト化キメラマウスへの抗HBV 効果を調べ るためのインビボ実験が可能であると考えられる。
ヒト化キメラマウスの実験では、血清中のHBs 抗原の ELISA による測定と、
血清中のHBV DNAをqPCRによって測定することでジクマロールの抗HBV
効果を経時的に評価できると考えられる。破砕した肝臓組織のHIRT抽出産物 をサザンブロッティングで調べることで、ジクマロールのHBV cccDNA の減 少の誘導を確認することができると推定される[22]。
3TC もしくはインターフェロンとの併用療法も行うことで、インビボの実験か
らHBV cccDNAの減少方法についての更なる考察が可能であると考えられる。
4-4 今後の展望
本研究で開発されたLeDNAの評価系は、エピソームDNA阻害剤を同定する のに効果的である。我々のスクリーニングはまだ進行中であり、そしてさらなる 阻害剤の同定は、核内エピソームDNAを除去する宿主メカニズムへの洞察を提 供することが可能であると考えられる。これにより、核内エピソームDNAの形 成により潜伏感染の発生が懸念されているHIVやヘルペスウイルスなどのウイ ルスにも[40]、研究の前進を手助けできると考えられる。複製起点を有するウイ ルスDNAがこの機構によって制御されているかも、今後の研究課題である。
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