考 察

本 研 究 で は ， 発 達 期 小 脳 白 質 の 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア で 発 現 量 が 増 加 す る PLD4 の 機 能 を 明 ら か に す る た め に ，PLD4 欠 損 マ ウ ス を 用 い ，そ の 発 達 期 小 脳 の 変 化 を 免 疫 組 織 染 色 法 で 解 析 し た ． そ の 結 果 ， 野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス で は ， 小 脳 の ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 状 態 が 異 な る こ と を 見 出 し た ．小 脳 白 質 の ミ エ リ ン 形 成 が PLD4 欠 損 マ ウ ス で 少 し 遅 れ る こ と か ら ， 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア に 発 現 す る PLD4 が ミ エ リ ン 形 成 に 関 与 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た ．さ ら に ，ク プ リ ゾ ン 投 与 に よ る 脱 髄 モ デ ル を 野 生 型 お よ び PLD4 欠 損 マ ウ ス で 作 製 し ， そ れ ら 組 織 染 色 標 本 を 比 較 し た ．そ の 結 果 ， ク プ リ ゾ ン 投 与 5 週 間 目 の PLD4 欠 損 マ ウ ス で は 野 生 型 に 比 べ て 脱 髄 の 程 度 が 低 く ，か つ ミ ク ロ グ リ ア の 形 態 も 異 な る こ と が 示 さ れ た ．

発 達 過 程 の 脳 で ，ミ ク ロ グ リ ア が 一 時 的 に 活 性 化 状 態 に あ る こ と は よ く 知 ら れ て い る 4 2 , 4 3 , 4 4 )． こ の 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア に 注 目 し て ， 多 く の 研 究 が 行 わ れ て い る も の の ，こ れ ら は 主 に ニ ュ ー ロ ン 新 生 ，軸 索 伸 長 ，シ ナ プ ス の ス パ イ ン お よ び 軸 索 の 刈 り 込 み な ど ， ニ ュ ー ロ ン に 対 す る 作 用 の 解 析 で あ っ た ^{1 2 )}． 今 回 ， 本 研 究 で の PLD4 欠 損 マ ウ ス を 用 い た 解 析 に よ り 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア が ミ エ リ ン 形 成 に 関 与 す る こ と が 示 唆 さ れ た ．特 に ，ミ エ リ ン 形 成 直 前 の 白 質 部 分 で ミ ク ロ グ リ ア が ，ア メ ボ イ ド 状 に 活 性 化 さ れ て い る こ と か ら ，ミ エ リ ン 形 成 の 最 終 段 階 で PLD4 の 関 与 が 考 え ら れ る ．ミ エ リ ン の 形 成 過 程 は ，軸 索 の 電 気 活 動 お よ び 他 の グ リ ア 細 胞 か ら の 様 々 な 刺 激 に よ り 厳 密 に 制 御 さ れ て い る 4 2 , 4 3 , 4 5 )． 現 時 点 で は PLD4 の 欠 損 状 態 に あ る ミ ク ロ グ リ ア の ミ エ リ ン 形 成 へ の 影 響 の 機 序 に つ い て は 未 だ に 明 ら か に は さ れ て い な い ． し か し な が ら ，PLD4 特 異 的 な siRNA に よ り PLD4 の 発 現 が 抑 制 さ れ た ミ ク ロ グ リ ア で は ， そ の 貪 食 能 が 低 下 す る こ と か

ら ^{2 6 )}， ミ ク ロ グ リ ア に よ る 不 要 な 軸 索 あ る い は ア ポ ト ー シ ス を 起 こ し た 細 胞 な

ど の 貪 食 が ミ エ リ ン 形 成 の 引 き 金 と し て 重 要 で あ り ，PLD4 欠 損 に よ る 貪 食 能 の 低 下 が ミ エ リ ン 形 成 に 影 響 し た と 考 え ら れ た ．一 方 ，活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア は ，ニ ュ ー ロ ン と の 接 触 あ る い は ミ エ リ ン 形 成 促 進 因 子 を 分 泌 す る こ と で 直 接 形 成 開 始 の 合 図 を 出 す こ と も 考 え ら れ る ． こ れ ら の こ と を 勘 案 す る と 今 後 PLD4 欠 損 ミ ク ロ グ リ ア の 形 態 お よ び 分 泌 因 子 な ど の 解 析 も 重 要 と 考 え ら れ る ．

今 回, PLD4 が 欠 損 し た P5 お よ びP7 で の 発 達 期 小 脳 白 質 に 存 在 す る ア メ ボ イ ド 状 の 形 状 で か つ Iba1 陽 性 の 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア で は CD68 の 発 現 量 が 少 な い こ と を 見 出 し た ．CD68 は マ ク ロ フ ァ ー ジ ，単 球 お よ び 好 中 球 な ど の 骨 髄 系 細 胞 の 細 胞 表 面 あ る い は リ ソ ソ ー ム の 膜 上 に あ る 分 子 量 110 kDa の 糖 タ ン パ ク 質 で

4 6 , 4 7 )， 通 常 は 活 性 化 状 態 に あ る ミ ク ロ グ リ ア の マ ー カ ー と し て 用 い ら れ て い る

4 8 , 4 9 )． PLD4 欠 損 の CD68 発 現 レ ベ ル 低 下 へ の 直 接 関 与 の 有 無 に つ い て は 不 明

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で あ る が ，PLD4 は 細 胞 内 お よ び フ ァ ゴ ソ ー ム に 存 在 す る こ と か ら CD68 と PLD4 の 関 連 性 に 関 し て も 検 討 す る 必 要 が あ る ．

ミ ク ロ グ リ ア は 脳 の 損 傷 時 ，周 囲 の 状 況 に よ り 主 に 抗 炎 症 因 子 を 放 出 す る 場 合 と 主 に 炎 症 促 進 因 子 を 放 出 す る 場 合 が あ り ，い わ ゆ る 諸 刃 の 刃 と し て 作 用 す る こ と が 知 ら れ て い る ^{3 9 )}．現 在 ，炎 症 促 進 性 因 子 (神 経 傷 害 因 子) を 放 出 す る M1 ミ ク ロ グ リ ア と 抗 炎 症 因 子 (神 経 保 護 因 子) を 放 出 す る M2 ミ ク ロ グ リ ア に 分 類 さ れ て い る 5 0 , 5 1 )． 多 発 性 硬 化 症 モ デ ル マ ウ ス の 脱 髄 病 態 に お い て ， 病 態 の 憎 悪 が 見 ら れ る 時 に は M1 ミ ク ロ グ リ ア 数 が 増 加 す る ． こ れ ら M1 ミ ク ロ グ リ ア か ら M2 ミ ク ロ グ リ ア へ の 転 換 が オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト 前 駆 細 胞 の 分 化 を 促 進 さ せ ，神 経 組 織 の 修 復 ，す な わ ち 再 ミ エ リ ン 化 を 進 行 さ せ る と 報 告 さ れ て い る 5 1 , 5 2 ,

5 3 )．し か し な が ら ，発 達 期 の 脳 に 存 在 す る ミ ク ロ グ リ ア の フ ェ ノ タ イ プ は 未 だ 明

ら か に さ れ て い な い ．本 研 究 で は ，発 達 期 の 小 脳 に 存 在 す る 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア は ，少 な く と も arginase 1 陽 性 の 典 型 的 な M2 ミ ク ロ グ リ ア で は な い こ と が 示 さ れ た ．生 後 初 期 の 脳 室 下 帯 で は ， IL-1β，IL-6，TNFα お よ び IFNγ な ど の 炎 症 促 進 性 サ イ ト カ イ ン が 神 経 細 胞 お よ び オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 新 生 に 促 進 的 に 働 く こ と が 報 告 さ れ て い る ^{4 4 )}．そ の 一 方 で ，P3 マ ウ ス 脳 か ら 分 離 し た ミ ク ロ グ リ ア で は iNOS, TNFα お よ び arginase 1 の 発 現 量 が 高 い 状 態 に あ り ， 単 純 に M1 あ る い は M2 の フ ェ ノ タ イ プ だ け で は 言 い 表 せ な い こ と も 示 唆 さ れ て い る ^{3 7 )}． 今 後 ，発 達 段 階 の 白 質 に 存 在 す る 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア の フ ェ ノ タ イ プ を 各 種 マ ー カ ー の 免 疫 染 色 に よ り 詳 細 に 解 析 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る ．

ク プ リ ゾ ン モ デ ル マ ウ ス は ，多 発 性 硬 化 症 の 疾 患 モ デ ル と し て 汎 用 さ れ て お り ， ク プ リ ゾ ン の 経 口 投 与 後 数 週 間 で 脱 髄 が 誘 発 さ れ ，特 に ，脳 梁 部 に お い て 顕 著 な 脱 髄 が 観 察 さ れ る 3 3 , 3 5 )． こ の モ デ ル マ ウ ス で は ， オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 細 胞 死 に よ る 脱 髄 の 過 程 で ミ ク ロ グ リ ア が 集 積 し 活 性 化 す る と 考 え ら れ て い る 3 4 , 3 6 )．

こ れ ま で の 報 告 か ら ， ク プ リ ゾ ン 投 与 4 週 か ら 5 週 後 の 脳 梁 で は 脱 髄 が 最 も 進 行 し て お り ， か つ ミ ク ロ グ リ ア も 活 性 化 状 態 に あ る 3 4 , 5 4 )． そ の 一 方 で ，6 週 目 で は ，再 ミ エ リ ン 化 が 進 行 す る た め 脱 髄 の 程 度 が 軽 減 さ れ て お り ，そ の 際 ミ ク ロ グ リ ア の 細 胞 数 は 減 少 す る と 報 告 さ れ て い る ^{3 4 )}．投 与 5 週 後 の PLD4 欠 損 マ ウ ス で は ，野 生 型 と 比 較 し て ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 が 生 じ て い た が 脱 髄 の 程 度 は 減 弱 し て い た こ と か ら ，ク プ リ ゾ ン に よ る 脱 髄 の 誘 導 が 遅 延 し て い る か ，あ る い は 既 に 再 ミ エ リ ン 化 が 開 始 し て い る か の 2 つ の 可 能 性 が 考 え ら れ た ．

本 研 究 で は ，PLD4 欠 損 が ， ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 状 態 を 変 化 さ せ ， ミ エ リ ン 形 成 の 遅 延 を 引 き 起 こ す こ と を 示 し た ．加 え て ，ク プ リ ゾ ン の 5 週 間 投 与 に よ る 脳 梁 で の 脱 髄 の 程 度 が ，野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス で 異 な る こ と を 見 出 し た ．今 後 は PLD4 欠 損 マ ウ ス 由 来 の ミ ク ロ グ リ ア の 貪 食 能 や 分 泌 因 子 の 変 化 を 調 べ る こ と で ，ミ ク ロ グ リ ア が ミ エ リ ン 形 成 に 及 ぼ す 影 響 を 解 析 し て い く こ と が 可 能 に な る と 考 え ら れ る ．ま た ，ク プ リ ゾ ン を 3～4 週 間 な ど 短 期 間 投 与 し た 場 合 や ，6

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週 間 以 上 に 長 期 間 投 与 し た 場 合 の PLD4 欠 損 マ ウ ス に お け る 変 化 を 調 べ る こ と で ， ミ ク ロ グ リ ア で の PLD4 の 役 割 と 脱 髄 と の 関 係 が 明 ら か と な る こ と も 考 え ら れ る ．

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総 括

本 研 究 は ，PLD4 の ミ ク ロ グ リ ア で の 機 能 を 明 ら か に す る た め に 計 画 さ れ た ． 実 験 に は PLD4 欠 損 マ ウ ス を 用 い ， 脳 の 生 後 発 達 段 階 お よ び 脱 髄 病 態 時 に お け る 変 化 に つ い て 解 析 を 行 っ た ．

ま ず ， 発 達 期 の 野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス を 用 い 各 種 組 織 染 色 に よ る 比 較 を 行 っ た ．HE 染 色 で は 脳 全 体 の 構 造 ， 大 き さ お よ び 小 脳 皮 質 の 層 構 造 に は PLD4 欠 損 に よ る 影 響 が 見 ら れ な い こ と が 確 認 さ れ た ． 抗 Iba1 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 の 結 果 ， 野 生 型 で は 生 後 5 日 目 に は 数 多 く 見 ら れ て い た ア メ ボ イ ド 状 の ミ ク ロ グ リ ア が 7 日 目 の 深 部 白 質 で は 少 な く な っ た ． 一 方 ，PLD4 欠 損 マ ウ ス で は 多 数 の ア メ ボ イ ド 状 ミ ク ロ グ リ ア が 依 然 と し て 観 察 さ れ る こ と か ら PLD4 の 欠 損 に よ り 活 性 化 状 態 が 続 く こ と を 明 ら か に し た ．ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 タ イ プ を 抗 CD68 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 で 解 析 し た と こ ろ ，こ の 時 期 の 正 常 な 小 脳 白 質 に 存 在 す る ミ ク ロ グ リ ア は CD68 の 発 現 が 高 い の に 対 し ，PLD4 欠 損 ミ ク ロ グ リ ア で は そ の 発 現 量 が 減 少 し た こ と か ら ，ミ ク ロ グ リ ア の フ ェ ノ タ イ プ が 異 な る 可 能 性 を 見 出 し た ． さ ら に ，arginase 1 抗 体 を 用 い た 染 色 の 結 果 か ら 発 生 過 程 の 小 脳 白 質 に 存 在 す る ア メ ボ イ ド 活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア は 典 型 的 な M2 タ イ プ と は 異 な る こ と を 明 ら か に し た ．抗 MBP 抗 体 を 用 い た 染 色 で は ，生 後 5 日 目 の 深 部 白 質 お よ び 生 後 7 日 目 の 小 葉 部 に お い て PLD4 欠 損 マ ウ ス で は ミ エ リ ン 形 成 前 の 未 成 熟 な オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト が 多 く 観 察 さ れ ，ミ エ リ ン 形 成 が 遅 延 し て い る こ と を 示 し た ．加 え て ，PLD4 欠 損 マ ウ ス で は オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト 系 譜 細 胞 の 総 数 や 幼 若 オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 数 に は 大 き な 違 い は 無 く ， ミ ク ロ グ リ ア で の PLD4 欠 損 は ， オ リ ゴ デ ン ド ロ サ イ ト の 成 熟 を 遅 ら せ た 可 能 性 が 示 さ れ た ．

次 に ， 多 発 性 硬 化 症 の 病 態 モ デ ル を 成 熟 マ ウ ス の 野 生 型 と PLD4 欠 損 マ ウ ス で 作 製 し ，脱 髄 時 に お け る PLD4 の 役 割 を 検 討 し た ．脱 髄 モ デ ル に お い て ，PLD4 欠 損 マ ウ ス で は 脱 髄 の 遅 延 あ る い は 再 ミ エ リ ン 化 が 起 き て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た ．さ ら に ，脱 髄 病 巣 で 観 察 さ れ た ミ ク ロ グ リ ア に 形 状 の 違 い が あ る こ と か ら ， PLD4 欠 損 に よ る ミ ク ロ グ リ ア の 変 化 が 脱 髄 状 態 の 違 い に 関 わ る こ と も 示 さ れ た ．

以 上 ， 本 研 究 の 結 果 か ら PLD4 の 欠 損 は プ ル キ ン エ 細 胞 や ア ス ト ロ サ イ ト に は 明 ら か な 影 響 は 与 え な い が ，ミ ク ロ グ リ ア の 活 性 化 状 態 に 影 響 し ，ミ エ リ ン 形 成 や 脱 髄 に 変 化 が 生 じ る こ と が 示 さ れ た ．発 達 期 に お い て ，活 性 化 ミ ク ロ グ リ ア は ミ エ リ ン 形 成 時 期 と 密 接 に 関 連 し ， 少 な く と も そ の 役 割 の 一 部 を PLD4 が 担 う こ と を 明 ら か に し た ．PLD4 コ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ ト マ ウ ス は 様 々 な マ ウ ス と の か け 合 わ せ に よ っ て PLD4 の 発 現 量 や 発 現 時 期 を 変 え る こ と が で き る こ と か ら ， 今 後 の PLD4 の 機 能 解 析 に 有 用 で あ る と 期 待 さ れ る ．