38
本研究では、環境化学物質の早期暴露による生体への影響を明らかにするため、環 境中で想定される暴露条件をふまえ、モデル化学物質としてペルメトリンを用いて、
マウスに低用量で飲水投与することにより、その早期からの慢性暴露による成熟後の 雄マウスへの影響について検討した。そして、環境中で想定されるレベルの濃度での 化学物質の早期慢性暴露によって、成熟後に生じる新規の生体影響を発見した。
ピレスロイド系殺虫剤への発生-発達期での暴露は、行動、神経化学的および分子レ ベルでの広範な影響（脳血管形成への影響、長期的な酸化ストレスレベルの増加、コ リン作動性神経の機能阻害、シナプス形成への影響、発達中の海馬の厚さの変化、自 発運動量の減少、成熟期での学習・記憶異常など）と関連していることが知られてい る（Vester et al. 2016; Abreu-Villaça et al. 2017）。加えて、ピレスロイド系殺虫剤への長 期にわたる低用量での暴露は、パーキンソン病やアルツハイマー病などの神経変性疾
患の発症に関連する環境因子であると疑われている（Baltazar et al. 2014）。第 2 章で は、早期におけるペルメトリンの暴露は、低用量（ADIレベル）でさえ、個体の成熟
後の行動に悪影響を及ぼすことを示した。第3章では、行動影響を示したペルメトリ ン暴露群において、今回の行動影響に関連した神経回路基盤の形成にも影響が生じて いることを示した。
第4章では、低用量のペルメトリン早期慢性暴露は、本来のターゲットである中枢 神経系のみならず、個体の成熟後に哺乳類の生殖内分泌系にも悪影響を及ぼすことを
39
示した。仮説として、ペルメトリン暴露による神経シグナルのかく乱によって、中枢 神経系からの性腺刺激ホルモンのシグナル異常が精巣での性ホルモンのシグナル異 常を引き起こし、生殖系へ影響を与え、さらに、精巣でのシグナルかく乱で分泌され た性ホルモンが脳に移行して、中枢神経系へ影響を与えたことが考えられる。もしく は、ペルメトリンが直接、脳組織（海馬）、生殖組織（精巣）に、エストロジェンレセ プターを介して作用することで、海馬、精巣それぞれで性ホルモンのシグナル異常が 生じ、中枢・生殖系へ影響を与えたことが考えられる。しかし実際には、これら間接 的、直接的な影響が複合して生じた可能性もある。現段階では中枢神経系への影響と 生殖内分泌系への影響の相関を示す結果には至らず、今後より詳細な解析が必要では あるが、本研究は、個体の早期における化学物質の低用量慢性暴露に関して、生体を 構築する機能単位の枠組みを越えた影響解析の重要性を示した。
また、本研究では雄個体について解析したが、動物生産領域においては、特に家畜 は目的に応じて性別によりそれぞれ重要な役割をもつ。化学物質の代謝には雌雄差が あるため（Legato(Eds.) 2004）、雌雄で化学物質に対する影響の受け方も異なる可能性 がある。そのため、環境化学物質の影響評価をするうえで、今後はその影響の雌雄差 にも着目することが重要になってくると考えられる。
本研究の結果より、環境中を想定した低用量の化学物質早期暴露は、成熟後の哺乳 類の脳機能および生殖機能に影響を与えることで、家畜の生産性（気質や繁殖成績）、
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そして野生動物に悪影響を及ぼす恐れがあると考えられた。ペルメトリンに関しては、
成熟動物への長期暴露では影響はみられない濃度であっても、発生-発達期において は生体への悪影響が考えられるため、現在の規制値とは区別して、より低い濃度での 発生-発達期に対する規制値の設定が必要であると考えられる。そのため、飼養時、ま たは土壌を介して暴露されることで、哺乳類へ悪影響を及ぼす可能性のある環境化学 物質についての再評価が重要であるとともに、特に、胎生期、生後発達期の影響評価 に関しては、成熟動物よりも慎重に規制値を検討する必要がある。
41
図表
42
図1. 実験スケジュールの概要
43
図2. 各行動試験の概要
44 図3. 産仔の体重変化
A) 実験期間中の産仔（2~9週齢）の体重変化
B) 行動試験前後（10週齢および12週齢）における産仔の体重 Student’s t-test, mean ± S.D. *p < 0.05 vs Control. n = 12.
45 図4. オープンフィールド試験の結果
A) 総移動距離、B) 中央滞在時間、C) 平均移動速度、D) 移動回数 Student’s t-test, mean ± S.E. *p < 0.05 vs Control. n = 12.
46 図5. 明暗往来試験の結果
A) 明室移動距離、B) 明室滞在時間、C) 転室回数、D) 暗室待機時間（明室へ初めて入る までにかかった時間）
Student’s or Welch’s t-test, mean ± S.E. *p < 0.05 vs Control. n = 12.
47 図6. 恐怖条件づけ学習記憶試験の結果
A) 条件づけ時のフリージング率の経時的変化 A’) 条件づけ時のフリージング率の比較
B) 空間-連想記憶試験時のフリージング率の経時的変化 B’) 空間-連想記憶試験時のフリージング率の比較 C) 音-連想記憶試験時のフリージング率の経時的変化
C’) 音-連想記憶試験時のフリージング率（初期反応）の比較 Student’s t-test, mean ± S.E. *p < 0.05 vs Control. n = 12.
48
図 7．行動試験におけるコントロール群とペルメトリン暴露群との各試験結果の平均値の比較
（コントロール群の平均値を100%としたときのペルメトリン暴露群の平均値）
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図8. マウス脳組織（海馬歯状回）の免疫組織化学による各細胞の計測 矢状断面で薄切した脳組織は、180µmの範囲のものを用いた。
ML:分子層、GCL:顆粒細胞層、SGZ:顆粒細胞下層、Hilus:歯状回門
50 図9. マウス（12週齢）海馬のHE染色像
C, F: CA1領域、D,G: CA3領域、E, H: 歯状回
コントロール群: A, C–E、ペルメトリン暴露群: B, F–H.
Scale bars, 500 µm (A, B), 100 µm (C–H).
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図10. 新生ニューロンマーカー（doublecortin; DCX）による免疫組織化学
A) マウス（12週齢）海馬歯状回におけるDCXの発現、B) 各群におけるDCX陽性 細胞数の比較
コントロール群: a–c, g–i, m–o、ペルメトリン暴露群: d–f, j–l, p–r
Scale bars, 300 µm (a, d, g, j, m, p), 200 µm (b, e, h, k, n, q), 20µm (c, f, i, l, o, r).
Student’s t-test, mean ± S.D. *p < 0.05 vs Control. n = 3.
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図11. 成熟ニューロンマーカー（NeuN）および神経幹細胞マーカー（SOX2）による免疫組織化学 A) マウス（12週齢）海馬歯状回におけるNeuNおよびSOX2の発現、B, C) 各群におけるNeuN およびSOX2陽性細胞数の比較
コントロール群: a, b, e, f, i, j, m, n、ペルメトリン暴露群: c, d, g, h, k, l, o, p Scale bars, 200 µm (a, c, e, g, i, k, m, o), 20 µm (b, d, f, h, j, l, n, p).
Student’s t-test, mean ± S.D. *p < 0.05 vs Control. n = 3.
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図12. アストロサイトマーカー（GFAP）によるマウス（12週齢）海馬歯状回の免疫組織化学 コントロール群: A–C, a–c’、ペルメトリン暴露群: D–F, d–f’
Scale bars, 50 µm (A–F), 10 µm (a–f’).
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図13. オリゴデンドロサイトマーカー（MAG）によるマウス（12週齢）海馬歯状回の免疫組織化 学
コントロール群: A, B, E, F, I, J、ペルメトリン暴露群: C, D, G, H, K, L Scale bars, 200 µm (A, C, E, G, I, K), 100 µm (B, D, F, H, J, L).
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図14. マウス（12週齢）精巣における精細管横断面のHE染色像 コントロール群: A, B、ペルメトリン暴露群: C, D
Scale bars, 100 μm (A, C), 50 μm (B, D).
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図15. マウス（12週齢）精巣における精細管横断面のメチルグリーン・ピロニン染色像
*: RNAの蓄積と考えられる染色像が確認された精細管横断面
Scale bars, 100 μm
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図16. RNase A処理による核酸の蛍光染色
白い矢頭: PIシグナルの消失
Scale bars, 50 μm (A, B, C, G, H, I), 20 μm (D, E, F, J, K, L).
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図17. メチルグリーン・ピロニン染色による、RNAの蓄積がみられる精細管横断面の割合 箱ひげ図について、箱内の垂直線は中央値を表す。箱は25-75パーセンタイルを表す。ひ げの上端と下端はそれぞれ最大値と最小値を表す。箱ひげ図の上の数値は、観察した精細 管横断面数に対し、RNAの蓄積が観察された精細管横断面数を表す。
Welch’s t-test, *p < 0.01 vs Control. n = 6.
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図18. セルトリ細胞マーカー（SOX9）による免疫組織化学
A) マウス（12 週齢）精巣におけるセルトリ細胞マーカー（SOX9）を用いた免疫組織化学、
B) 各群におけるSOX9陽性細胞数の比較
コントロール群: A-H、ペルメトリン暴露群: I-P、白い矢頭: セルトリ細胞 Scale bars, 100 μm (A-D, I-L), 50 μm (E-H, M-P).
Student’s t-test, mean ± S.D. *p < 0.05 vs Control. n = 6.
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