5‐1 1,10-フェナントロリンポリアミン複合体によるプラスミドDNAの切断
低分子化合物からなる人工制限酵素の DNA 切断ドメインの開発を目的とし て、生理的条件で DNAを切断する1,10-フェナントロリン－ポリアミン複合体 について研究を行った。トリス（2-アミノエチル）アミンに1,10-フェナントロ リンを2つ結合した複合体1、及び、3つ結合した複合体2はいずれも生理的条 件、還元剤及び多価金属非存在下でプラスミドDNAを切断した。また、それら
のCu(II)錯体も生理的条件、還元剤非存在下でプラスミドDNAを切断した。こ
れらの化合物は、加水分解的に DNA を切断していることが分かった。これは、
天然の酵素と同様に塩基を欠損させることなく、DNAを切断することを意味し ているので、遺伝子工学的な組換えが可能となることを示す。さらに複合体 2 は、そのDNA切断活性が非常に高いことがわかった。このことは、人工制限酵 素開発をまた一歩進め、その実現性を高めたといえる。
5‐2 3′-末端に種々の修飾ヌクレオシドを含む RNA の化学的および酵素的合
成
siRNAの3′-末端に種々の機能性基を有するピリミジンヌクレオシドを導入す
るために、RNAの化学的および酵素的合成方法について研究を行った。化学的 合成方法では、DNA合成装置を用いた固相合成が適用可能なことから、必要量 を容易に得ることができた。しかしながら、修飾ヌクレオシドを固定した固相 担体を修飾ヌクレオシドごとに準備する必要がある。そのため、この手法は効
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果的な修飾基やRNA配列が、判明している場合に有効である。一方、酵素的合 成方法では、標的とする配列に対応したRNA 19-merを用意するだけで、修飾
DNA 2-merとのライゲーションによって、3′-末端に種々の修飾ヌクレオシドを
含むRNAを簡便に合成することができた。この手法は、修飾基のRNAiに及ぼ す影響の調査や標的配列との組み合わせの探索に有効である。
5‐3 3′-オーバーハング領域にC5-ポリアミン修飾ヌクレオシドを含むsiRNA
のRNAi活性の検討
3′-オーバーハング領域にC5-ポリアミン置換ピリミジンヌクレオシドを有す るsiRNAのRNAi活性について検討した結果、siRNAの3′-オーバーハング領域へ の1つの修飾がRNAi活性を著しく向上させることがわかった。これは主に、3′-末端の修飾がRNAにヌクレアーゼ耐性を付与したためであった。3′-オーバーハ ング領域に修飾ヌクレオシドを2つ含むsiRNAが、1つを含むものに比べてRNAi 活性が低い原因は、その高い立体障害がRISC形成を阻害しているためと推測さ れた。安価な原料から合成できるC5-ポリアミン置換ピリミジンヌクレオシドを 3′-末端に1つ導入するだけで、RNAi活性の向上が見られたことから、本方法は 利用価値の高い修飾方法となると考えられる。
5‐4 今後の展望
低分子 DNA 切断分子として、1,10-フェナントロリン－ポリアミン複合体を 利用できることを示した。今後、DNA配列を識別するドメインと結合すること により、細胞内や生体内で染色体を切断する人工制限酵素への応用が期待でき
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る。この技術は将来、ノックアウトマウスの製作を効率的にする技術となるか もしれない。
本研究で開発・利用した修飾RNAの合成方法は、その目的に合わせて使い分 けることで、3′-末端に修飾ヌクレオシドを含む修飾RNAをより効率的に取得す る技術となる。特に、酵素的合成方法は、siRNAの3′-オーバーハング領域にお ける最適な機能性基の探索を助けると期待できる。
3′-オーバーハング領域に C5 ポリアミン修飾ピリミジンヌクレオシドを含む
siRNAは、高いRNAi活性を示すことがわかった。さらに詳細に検討した結果、
3′-オーバーハング領域における修飾ヌクレオシドの数によってその活性が変わ っていることが明らかになった。これは、RISCへの取り込みやすさに依存する と考えられる。これを利用すると標的配列の熱力学的安定性に依存せずに、
siRNAを設計することが可能となる。
これら、遺伝子発現を制御するためのツールの開発は、まだ機能が解明され ていないヒトゲノムの解析を加速させるのみならず、遺伝子治療のための医薬 品への応用も期待できる。
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謝辞
本研究を行なうにあたり、熱心な御指導をいただきました尾崎広明先生に深 く感謝いたします。研究を行うにあたって様々な良きアドバイスをくださった 桒原正靖先生、ならびに、澤井宏明名誉教授に深く感謝いたします。RNAi活性 の検討において実験機器の操作や実験手法について御指導してくださった井上 裕介先生、並びに卒業生の土田雄一君に深く感謝いたします。研究室生活を有 意義にしてくださいました研究室の皆様に深く感謝いたします。最後に、私を 支えてくださいました全ての皆様に心から感謝いたします。