3‐1 序論
近年、分子生物学や医学において siRNAやmiRNA のような小分子RNAを 用いた研究が盛んにおこなわれている。これらの分野への利用には、効率的か つ一度に大量の RNA を合成する技術が必要となるため、RNA 合成に関する研 究が積極的に行われている。RNAを含む核酸の合成方法には、化学的合成方法 と酵素的合成方法がある。化学的合成方法は、主にホスホロアミダイト法が用 いられ、3′-末端のヌクレオシドを固定した固相担体にヌクレオシドのホスホロ アミダイト誘導体を順次反応させることで任意の配列を合成することができる
25)。また、修飾ヌクレオシドのホスホロアミダイト誘導体を用いることで任意 の位置に修飾ヌクレオシドを導入することが可能である。酵素的合成方法では、
DNA を鋳型としてヌクレオシド-5′-三リン酸を重合する RNA ポリメラーゼ 26)
や、RNAの3′-末端に5′-リン酸化されたオリゴヌクレオチドを結合するRNAリ
ガーゼを用いて合成を行う 27)。構造を大きく損なわない修飾を有するヌクレオ シドを用いることで修飾RNAの合成にも利用されている28),29)。T4 RNAリガ
ーゼは RNA の 3′-末端にヌクレオシドやその類似体を導入できることから、
tRNAのフルオレセインやビオチンなどによる標識化に用いられてきた30),31)。 これまでに、siRNAの様々な位置に修飾基を導入し、そのRNAi 活性に及ぼ す効果が検討されてきた。siRNAの構造は、Figure 13Aに示す。特にアンチセ
ンス鎖の 3′-オーバーハング領域とセンス鎖の両末端への導入が最も一般的に使
われてきた。アンチセンス鎖の3′-オーバーハング領域の2-ntは、RISCの重要
27
な構成要素であるArgonaute 2のPAZ（Piwi / Argonaute / Zwille）ドメインに 取り込まれる（Figure 14）。この際に、dsRNAの非対称性が識別され、二重鎖 の解離に関して 5′-末端が相対的に不安定な鎖がガイド鎖として RISC に組み込 まれる。RNA中に修飾基を結合することで二重鎖の熱的安定性が変わることか ら、3′-オーバーハング領域に修飾ヌクレオシドを導入することで二重鎖の熱力 学的安定性を調節できる。このように RISC への取り込みを制御することで RNAi活性を高め、オフターゲット効果を抑制できる（Figure 13C）。
A
B C
Figure 13. (A) Schematic representation of a siRNA molecule. siRNA has 2-nt 3′-overhang at each strands. (B) Recognition of thermodynamic asymmetry of siRNA by R2D2/Dicer-2 heterodimer. In thermodynamically asymmetric siRNA duplexes, the strand whose 5′-end lies at the less thermodynamically stable end of the helix is preferentially loaded onto Argonaute 2 as the guide strand. (C) Modulation of siRNA thermodynamic asymmetry by modified nucleosides in the 3′-overhang regions. Chemical modification of siRNA 3′-overhangs can be preferentially incorporated antisense strand during RISC loading by the modulation of the thermodynamic asymmetry of duplex.
28
Figure 14. Schematic representation of siRNA/Argonaute 2 complex.
Argonautes consist of four distinct domains: the N-terminal, PAZ, Mid and PIWI domains. The 3′-overhang region of the antisense strand of the siRNA is introduced into the PAZ domain.
本章では、C5位に機能性基を有するピリミジンヌクレオシドを3′-末端に導入 したRNAを化学的合成方法のみを用いた場合と、別途合成した修飾DNA 2-mer をT4 RNA リガーゼによってRNA 19-merの3′-末端に結合する方法の検討を行 った（Figure 15）。また、リガーゼ反応に及ぼす置換基の効果を調べた結果も 述べる。そのために、化学合成の出発原料となる修飾ヌクレオシドのホスホロ アミダイト化、ならびに固相担体への担持とそれらを用いた化学合成の結果、
T4 RNAリガーゼによる修飾DNA 2-merとRNA 19-merの結合反応結果を述 べる。
29
a)
b)
Figure 15. Chemical and enzymatic synthesis of modified RNA 21-mers containing modified nucleoside at the 3′-end. a) Chemical synthesis performed by solid-phase synthesis using phosphoramidite method. b) Enzymatic synthesis performed by ligation of RNA 19-mer with modified DNA 2-mer by T4 RNA ligase.
3‐2 実験
2-シアノエチルジイソプロピルクロロエチルアミン（和光純薬）、N,N-ジイソプ
ロピルエチルアミン（i-Pr2NEt）、4-ジメチルアミノピリジン（DMAP、和光純 薬）、無水コハク酸（関東化学）、4,4′-O-ジメトキシトリチルクロライド（DMTr-Cl、
和 光 純 薬 ）、 テ ト ラ-n-ブ チ ル-ア ン モ ニ ウ ム フ ル オ ラ イ ド （TBAF、
Sigma-Aldrich）、ナトリウム（関東化学）、トルエン（和光純薬）、ヘキサン（関
東化学）、1-(3-ジメチルアミノプロピル)エチルカルボジイミド（EDC、同仁化 学）、Long Chain Alkylamine Controlled Pore Glass（LCAA-CPG）、アセトニ トリル（MeCN、関東化学）、トリエチルアミン（TEA、和光純薬）、3% トリ クロロ酢酸 / CH2Cl2（Glen Research）、Chemical Phosphorylation Reagent II
30
（CPRII、Glen Research）、ジシクロヘキシルカルボジイミド (DCC、和光純 薬)、アミノエタノール（関東化学）、チミジンホスホロアミダイト（Proligo, SAFC）、1H-テトラゾール（Glen Research）、塩化ホスホリル（POCl3、和光 純薬）、リン酸トリメチル（和光純薬）、水酸化リチウム・一水和物（LiOH･H2O、
関東化学）、T4 RNAリガーゼ（タカラバイオ）、ポリエチレングリコール6000
（PEG、和光純薬）アクリルアミド-HG（和光純薬）、メチレンビス(アクリル アミド)-HG（和光純薬）、テトラメチルエチレンジアミン（TMEDA、和光純薬）、 Urea（Sigma-Aldrich）、Tris（Sigma-Aldrich）、SYBR Gold（インビトロゲン）
は購入して使用した。5′-O-(4,4′-ジメトキシトリチル)-5-[N-2-[N,N-ビス(2-トリ フルオロアセチルアミノエチル)アミノ]エチル]カルバモイルメチル-2′-デオキシ ウリジン（3）32)、及び、3′-O-[(2-シアノエチル)(ジイソピルアミノ)]ホスホリノ -5′-O-(4,4′-ジメトキシトリチル)-5-[N-2-[N,N-ビス(2-トリフルオロアセチルア ミノエチル)アミノ]エチル]カルバモイルメチル-2′-デオキシウリジン（4）32)、 5-カルボキシメチル-2′-デオキシウリジン（15）33)、5′-O-(4,4′-ジメトキシトリチ ル)-5-(N-プロピル)カルバモイルメチル-2′-デオキシウリジン（16a）13)、-アラ ニンメチルエステル塩酸塩一水和物は、それぞれ報告に基づき合成して用いた。
3‐2‐1 修飾ヌクレオシドの固相担体の合成
3（0.15 g、0.17 mmol）をdry ピリジン 1 ml に溶かし、無水コハク酸（72 mg、
0.72 mmol）とDMAP（30 mg、0.25 mmol）を加えて、室温で20時間撹拌した。
反応液はCH2Cl2に溶かし、5% NaHPO4水溶液で洗浄した。有機相をトルエン で3回共沸することでピリジンを除去した。残渣はシリカゲルカラムクロマトグ ラフィ（10% MeOH/CH2Cl2）で精製し、ヘキサン（70 ml）で再沈殿を行った。
31
そして、3′-コハク酸塩 5（20 mg、0.040 mmol）をdry ピリジンに溶かし、DMAP
（6 mg、0.05 mmol）、1-（3-ジメチルアミノプロピル）エチルカルボジイミド
（0.19 g、1.0 mmol）とLCC-CPG樹脂（0.50 g）、そして最後にTEA（40 l）
を加えた後、室温で4時間ゆっくり撹拌した。CPGは濾過を行い、ピリジンと CH2Cl2で洗浄後、乾燥させた。CPGに結合した修飾ヌクレオシドの量を、3% ト リクロロ酢酸/CH2Cl2溶液によって切り出されたDMTrカチオンを定量すること で求め、23.7 mol/gであった。
3‐2‐2 修飾オリゴリボヌクレオチドの合成
RNAはHNF4の研究で報告されている配列を用いた。6つのオリゴリボヌク
レオチド（ORN）は、1 molスケールで392 DNA/RNA synthesizer（アプライ ドバイオシステム）を用いたホスホロアミダイト方法によって合成した（Table 1）。カップリング時間を10分間にし、ORN1と2は3′-オーバーハング領域にTを 導入するためにチミジン（T）のホスホロアミダイトとT-CPGを用いた。同様に、
ORN3と4ではTのホスホロアミダイトと修飾CPG 6を、ORN5と6では修飾ヌク レオシドのホスホロアミダイト体 4と修飾CPG 6を用いた。
合成後、固相担体を濃アンモニア水：エタノール（3：1、v/v）で処理して担体 から切り出した後、55 ˚Cで一晩加熱することで脱保護を行った。そして、TBAF で2′-O-TBDMSの脱保護を行い、カラムとしてODS-80Ts（東ソー、0.46 x 25 cm）、溶離液として50 mM TEAA（pH 7.2）/ 50 mM TEAA（pH 7.2）、70% MeCN を用いたHPLCによって精製した。
32
3‐2‐3 5′-リン酸化C5-修飾ピリミジンヌクレオシドを含むDNA 2merの合
成
5′-O-リン酸 チミジン-3′-イル 5-ビス(アミノエチル)アミノエチルカルバモイル
メチル-2′- デオキシウリジン 5′-イル リン酸（13）の合成
室温で、固相担体6 (42 mg、1 mol)上の修飾ヌクレオシドの5′-末端を3%ト リクロロ酢酸/ジクロロメタン1 mL、10分で脱トリチル化した。 7を室温で 1H-テトラゾール（14 mg、200 mol）存在下で、チミジンホスホロアミダイト 8 （15
mg、20 mol）と反応させた。10分後に、0.02 Mのヨウ素を含むTHF/ピリジ
ン/水（88：10：2、1 mL）中で1分間酸化し、9をMeCNで洗浄した。3%ト リクロロ酢酸/ジクロロメタンで脱トリチル化し、得られた生成物は 1H-テトラ ゾール（14 mg、200 mol）存在下で、CPRII （20 mol）と反応させ、0.02 M のヨウ素を含むTHF/ピリジン/水（1mL）中で酸化させた。得られた担体11は、
固相担体からの切り出しと脱保護のために、濃アンモニア水中で 55 ˚C で一晩 インキュベートし、濾過後、ろ液に空気を吹き付けてアンモニアを除去した。
修飾 DNA 2-merは室温で20 分間80% 酢酸で処理した。さらに脱保護のため
に濃アンモニア水に溶かして 37 ˚C で 30 分インキュベートした。生成物は HPLCによって単離し、16%の収率で修飾DNA 2-mer 13を得た。 ESI-MS: m/z 796.8（[M - H]－, C27H43N8O16P2－ calcd. 797.2）。
33
5′-O-リン酸 5-ビス(アミノエチル)アミノエチルカルバモイルメチル-2′-デオキ シウリジン-3′-イル 5-ビス(アミノエチル)アミノエチルカルバモイルメチル-2′- デオキシウリジン 5′-イル リン酸（14）の合成
修飾DNA 2-mer 14 においても固相担体6と修飾ヌクレオシドのホスホロア
ミダイト誘導体4から修飾DNA 2-mer 13 と同様に合成した。その結果、収率 11%で 修 飾 DNA 2-mer 14 を 得 た 。ESI-MS: m/z 968.8 ([M - H]－, C34H58N12O17P2－ calcd. 968.4).
5′-O-(4,4′-ジメトキシトリチル)-3′-O-アセチル-5-(N-プロピル)カルバモイルメチ ル-2′-デオキシウリジン（17a）の合成
アルゴン雰囲気下で、16a（71 mg、0.11 mmol）をDMAP（1 mg、0.01 mmol）
と共にMeCN（1 mL）に溶かした。無水酢酸（16 L、0.17 mmol）を加え、
室温で2時間撹拌した。反応液を酢酸エチル 50 mLに溶かし、5% NaHCO3 aq で洗浄した。有機相をMgSO4で乾燥後、濾過を行った。減圧留去後、残渣はシ リカゲルカラムクロマトグラフィ（1-5 % MeOH / CH2Cl2）によって精製し、
収量73 mg、収率96 %で17aを得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): =7.74 (s, 1H, H6), 7.43-6.84 (m, 17H, Ar), 6.37 (q, 1H, CONH) 6.11 (t, 1H H1), 5.42 (m, 1H, H3′), 4.12 (q, 1H, H4′), 3.79 (s, 6H, OCH3), 3.43 (m, 2H, H5′), 3.10 (m, 2H, CH2CH2), 2.68-2.38 (m, 4H, H2′
and C5-CH2), 2.45 (t, 3H, COCH3), 1.43-1.47 (m, 2H, CH2CH2), 0.866 (t, 3H, CH3), 13C NMR (600 MHz, CDCl3):=170.3 (CONH), 169.0 (COCH3), 163.9 (C4), 158.7 (C4DMT, C4′DMT), 150.2 (C2), 144.4 (C1′′DMT), 138.1 (C6),
34
135.2 (C1DMT, C1′DMT), 130.1 (C2DMT, C6DMT, C2′DMT, C6′DMT), 128.1 (C2′′DMT, C3′′DMT, C5′′DMT, C6′′DMT), 127.0 (C4′′DMT), 113.4 (C3DMT, C5DMT, C3′DMT, C5′DMT), 109.8 (C5), 87.1 (Ar3CODMT), 84.8 (C1′), 84.1 (C4′), 75.1 (C3′), 63.7 (C5′), 55.3 (2×OCH3), 41.4 (C2′), 38.1 (CH2CH2), 34.6 (C5-CH2), 22.7 (CH2CH2), 21.0 (COCH3), 11.4 (CH3). ESI-MS: m/z 670.2 ([M - H]-, C37H40N3O9- calcd. 670.28).
5-(N-プロピル)カルバモイルメチル-3′-アセチル-2′-デオキシウリジン（18a）の 合成
17a（73 mg、0.11 mmol）を3% TCA in CH2Cl2 1 mLに溶かし、室温で10 分間撹拌した。減圧留去後、残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィ（3-7 % MeOH / CH2Cl2）によって精製し、収量34 mg、収率 84 %で18aを得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): = 8.90 (s, 1H, imido-NH), 8.14 (s, 1H, H6), 6.60 (s, 1H, CONH), 6.30 (t, 1H, H1′), 5.37 (t, 1H, H3′), 4.15 (d, 1H, H4′), 3.92 (ddd, 2H, H5′), 3.17 (q, 2H, CH2CH2), 2.50-2.40 (m, 4H, H2′ and C5-CH2), 2.10 (s, 3H, COCH3), 1.51 (q, 2H, CH2CH2), 0.90 (t, 3H, CH3). 13C NMR (600 MHz, CDCl3):=170.3 (CONH), 169.0 (COCH3), 163.9 (C4), 150.2 (C2), 138.1 (C6), 109.8 (C5), 84.8 (C1′), 84.1 (C4′), 75.1 (C3′), 63.7 (C5′), 41.4 (C2′), 38.1 (CH2CH2), 34.6 (C5-CH2), 22.7 (CH2CH2), 21.0 (COCH3), 11.4 (CH3). ESI-MS:
m/z 370.2 ([M + H]+, C16H24N3O9+ calcd. 370.15).
35
5′-O-(4,4′-ジメトキシトリチル)チミジン-3′-イル 3′-O-アセチル-5-(N-ヒドロキ シエチル)カルバモイルメチル -2′-デオキシウリジン 5′-イル 2′′-シアノエチル リン酸（19a）の合成
18a（10 mg、0.027 mmol）、チミジンホスホロアミダイト（24 mg、0.033 mmol）、テトラゾール（19 mg、0.27 mmol）をMeCN（1 mL）に溶かし、室 温で10分間撹拌した。反応終了後、0.02Mのヨウ素を含むTHF/ピリジン/水（5 mL）を加え、さらに10分間撹拌した。1% クエン酸aq 20 mLに溶かし、CH2Cl2
で 3 回抽出を行った。有機相を MgSO4で乾燥後、濾過を行った。減圧留去後、
残渣はシリカゲルカラムクロマトグラフィ（1-5 % MeOH / CH2Cl2）によって 精製し、収量28 mg、収率 100 %で19aを得た。
1H NMR (600 MHz, CDCl3): = 7.68 and 7.56 (2×s, 2H, H6a, H6b), 7.37-6.81 (m, 16H, Ar), 6.43-6.25 (m, 2H, H1′a, H1′b), 5.30-5.18 (m, 2H, H3′a, H3′b), 4.43-4.15 (m, 8H, H4a, H4b, H5′a, H5′b), 3.79 (s, 9H, OCH3), 3.53-3.39 (m, 4H, CH2CH2, POCH2), 3.27-3.18 (m, 4H, H2′a, CH2CH2), 3.12 (q, 2H,
C5-CH2)2.84-2.30 (m, 6H, 2×H2′, CH2CN), 2.11 and 2.10 (2×s, 6H, 2×OCH3), 1.97 (s, 3H, C5-CH3), 1.40 (q, 2H, CH2CH2), 0.87 (t, 3H, CH3). 13C NMR (600 MHz, CDCl3): = 170.5 (CONH), 169.8 (COCH3), 164.1 and 163.9 (C4a, C4b), 158.8 (C4DMT, C4′DMT), 150.7 and 150.1 (C2a, C2b), 144.0 (C1′′DMT), 138.43 and 138.29 (C6a, C6b), 135.2 and 135.0 (C1DMT, C1′DMT), 130.2 (C2DMT, C6DMT, C2′DMT, C6′DMT), 128.2 and 128.1 (C2′′DMT, C3′′DMT, C5′′DMT, C6′′DMT), 127.3 (C4′′DMT), 116.6 (CN), 113.4 (C3DMT, C5DMT, C3′DMT, C5′DMT), 111.8 and 110.0 (C5a, C5b), 87.3 (Ar3CODMT), 85.8 and 85.4 (C1′a, C1′b), 84.3 and 84.2 (C4′a, C4′b), 73.8 and 73.7 (C3′a, C3′b), 63.3