㈱ レ オ ロ ジ ー 機 能 食 品 研 究 所 所 長 藤 野 武 彦 顧 問 灘 修 身 研 究 員 武 田 誠 子
３ － ３ － １ プ ロ ジ ェ ク ト 全 体 に お け る 本 研 究 開 発 部 分 の 位 置 づ け
紅 タ デ は 古 来 よ り 種 々 の 効 能 が 謳 わ れ て い る が 、そ の 医 学 的 検 証 は 全 く 行 わ れ て い な い 。 本 課 題 で は 、 紅 タ デ よ り 抽 出 さ れ た 機 能 性 成 分 の 医 学 的 機 能 性 、 と く に 生 理 学 的 機 能 に つ い て 評 価 す る 。
３ － ３ － ２ 目 的 と 目 標
紅 タ デ よ り 抽 出 さ れ た 機 能 性 成 分 に つ い て 動 物 お よ び ヒ ト を 対 象 に イ ン ビ ト ロ 、 イ ン ビ ボ 実 験 を 行 い 赤 血 球 変 形 能 （ 血 液 サ ラ サ ラ 度 ） 改 善 能 、 血 糖 降 下 作 用 、 肝 機 能 改 善 能 、 コ レ ス テ ロ － ル 低 下 作 用 の 有 無 を 明 ら か に す る 。
３ － ３ － ３ 実 験 方 法 お よ び 実 験 条 件
（ １ ） STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト （ 予 防 モ デ ル ） イ ン ビ ボ 実 験
① 材 料 及 び 実 験 方 法
10 週 齢 の Wistar 雄 ラ ッ ト 24 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス ・ リ バ ー 社 よ り 、 ス ト レ プ ト ゾ シ ン （ STZ） は シ グ マ 社 よ り 、 MF 粉 末 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 。 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 。 実 験 飼 料 は 芽 タ デ 酢 酸 抽 出 物 を 0.5％ の 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の を 用 い た 。
② 飼 料 及 び 飼 育 条 件
室 温 23±2℃ 、相 対 湿 度 50～ 60％ 、12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル（ 7:00～ 19:00）の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 、 動 物 を 各 8 匹 の 3 群 に 分 け た 。 Ⅰ 群 （ 正 常 対 照 ラ ッ ト ） に は 4 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た 。 Ⅱ 群 （ STZ 投 与 － 実 験 飼 料 非 投 与 ラ ッ ト ） に は 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た 後 、 STZ(45mg/Kg)を 腹 腔 内 投 与 し 、 以 後 2 週 間 は 30g/匹 /日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た 。 Ⅲ 群 （ STZ 投 与 － 実 験 飼 料 餌 投 与 ラ ッ ト ）に は 、2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で MF を 与 え た 後 、STZ(45mg/Kg) を 腹 腔 内 投 与 し 、 以 後 2 週 間 は 30g/匹 /日 の 割 合 で 実 験 飼 料 を 与 え た 。
③ 測 定 項 目 １ ． 経 過 観 察
１ ） 血 糖 値 (尾 静 脈 )
STZ 投 与 時 及 び 屠 殺 時 に グ ル テ ス ト エ ー ス R（ 三 和 化 学 研 究 所 ） を 用 い て エ ー テ ル 麻 酔 下 で 尾 静 脈 か ら 測 定 し た 。 な お 、 測 定 前 日 17 時 よ り 絶 食 し た 。
２ ） 体 重
入 荷 時 、 STZ 投 与 時 及 び 屠 殺 時 に 測 定 し た 。 ２ ． 屠 殺
ネ ン ブ タ ー ル （ 大 日 本 製 薬 ） 麻 酔 下 で 屠 殺 し た 。 ３ ． 血 液 検 査
腹 大 動 脈 か ら 採 血 し 血 液 一 般 、生 化 学 検 査（ 血 漿 ）、赤 血 球 変 形 能（ 孔 径：4.23μ m）
を 測 定 し た( 1 、 2 )。
（ ２ ） STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト （ 治 療 モ デ ル ） イ ン ビ ボ 実 験
① 材 料 及 び 実 験 方 法
8 週 齢 の Wistar 雄 ラ ッ ト 32 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス ・ リ バ ー 社 よ り 、 ス ト レ プ ト ゾ シ ン （ STZ） は シ グ マ 社 よ り 、 MF 粉 末 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 。 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 。 実 験 飼 料 は 芽 タ デ 酢 酸 抽 出 物 を 0.5％ の 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の （ 実 験 飼 料 A） 及 び 生 長 タ デ 80％ エ タ ノ ー ル 抽 出 物 を 0.1％ 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の （ 実 験 飼 料 B） を 用 い た 。
② 飼 料 及 び 飼 育 条 件
室 温 23±2℃ 、相 対 湿 度 50～ 60％ 、12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル（ 7:00～ 19:00）の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 、動 物 は 正 常 対 照 群（ Ⅰ 群 ）8 匹 と STZ 投 与 群 24 匹 に 分 け 、STZ 投 与 群 に は STZ(80mg/Kg)を 腹 腔 内 投 与 し た 。Ⅰ 群（ 正 常 対 照 ラ ッ ト ）に は 4 週 間 30g/
匹 /日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た 。 STZ 投 与 群 は 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え 、 血 糖 値 に 基 づ き 各 8 匹 （ Ⅱ ～ Ⅳ 群 ） に 分 け た 。 Ⅱ 群 （ STZ 投 与 ‐ 実 験 飼 料 非 投 与 ラ ッ ト ） に は 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た 。 Ⅲ 群 （ STZ 投 与 ‐ 実 験 飼 料 A 投 与 ラ ッ ト ） に は 、 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で 実 験 飼 料 A を 与 え た 。 Ⅳ 群 （ STZ 投 与
‐ 実 験 飼 料 B 投 与 ラ ッ ト ） に は 、 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で 実 験 飼 料 B を 与 え た 。
③ 測 定 項 目 １ ． 経 過 観 察
１ ） 血 糖 値 (尾 静 脈 )
STZ 投 与 時 、 群 分 け 時 及 び 屠 殺 時 に グ ル テ ス ト エ ー ス R（ 三 和 化 学 研 究 所 ） を 用 い て エ ー テ ル 麻 酔 下 で 尾 静 脈 か ら 測 定 し た 。 な お 、 測 定 前 日 17 時 よ り 絶 食 し た 。 ２ ） 体 重
入 荷 時 、 STZ 投 与 時 及 び 屠 殺 時 に 測 定 し た 。 ２ ． 屠 殺
ネ ン ブ タ ー ル （ 大 日 本 製 薬 ） 麻 酔 下 で 屠 殺 し た 。 ３ ． 血 液 検 査
腹 大 動 脈 か ら 採 血 し 血 液 一 般 、生 化 学 検 査（ 血 漿 ）、赤 血 球 変 形 能（ 孔 径：4.23μ m）
を 測 定 し た 。
（ ３ ） 赤 血 球 変 形 能 測 定 法
赤 血 球 の 直 径 は 約 8μ m で あ る が 、自 己 の 直 径 よ り 細 い 管 を パ ラ シ ュ ー ト 状 、さ ら に は 折 れ 曲 が っ て 変 形 し な が ら 通 過 し 得 る 。 こ の 赤 血 球 の 変 形 す る 能 力 （ 赤 血 球 変 形 能 ） を 測 定
す る 。 血 管 モ デ ル と し て ニ ッ ケ ル メ ッ シ ュ を 用 い て 重 力 を 駆 動 力 と す る 重 力 式 ニ ッ ケ ル メ ッ シ ュ 透 過 法 を 用 い た( 3 、 4 、 5 )。
（ ４ ） 赤 血 球 変 形 能 測 定 法 （ 酸 化 モ デ ル ）
酸 化 ス ト レ ス に よ っ て 赤 血 球 変 形 能 が 低 下 す る 酸 化 モ デ ル を 作 成 し 、 そ れ を ヒ ト 赤 血 球 に 応 用 し た 。
酸 化 ス ト レ ス と し て は 、 2,2’ -ア ゾ ビ ス （ 2-ア ミ ジ ノ プ ロ パ ン ） 二 塩 酸 基 （ AAPH） を 使 用 し た 。
ヒ ト 赤 血 球 は HEPES バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 し 、 HEPES バ ッ フ ァ ー で ヘ マ ト ク リ ッ ト を 調 整 し た 。 AAPH、 芽 タ デ も HEPES バ ッ フ ァ ー で 調 整 し た 。 最 終 濃 度 は 赤 血 球 液 3％ 、 AAPH 50mM と し た 。 赤 血 球 液 、 AAPH 液 と も に 37℃ 、 5 分 間 プ レ イ ン キ ュ ベ ー ト し 、 そ の 後 に AAPH を 赤 血 球 液 に 添 加 し 反 応 さ せ た 。45 分 間 後 に 試 験 管 を 氷 に 入 れ 反 応 を 停 止 さ せ 、変 形 能 測 定 前 に 7 分 間 25℃ に お き 、 引 き 続 き 25℃ で 変 形 能 を 測 定 し た 。 フ ィ ル タ ー は 5.35μ 孔 径 を 用 い た 。
（ ５ ） 免 疫 機 能 （ TNF-α ） 測 定 法
ヒ ト の 静 脈 血 か ら 分 離 し た 好 中 球 を 、 タ デ 抽 出 物 を 添 加 し た 培 地 で 6 時 間 培 養 を 行 い TNF-α 産 生 促 進 効 果 の 有 無 を 調 べ た 。 ま た 、 上 記 の 培 地 に LPS を 添 加 し て 好 中 球 に 刺 激 を 与 え て TNF-α を 大 量 に 産 生 す る 条 件 を 作 り タ デ 抽 出 物 に よ る 産 生 抑 制 効 果 有 無 も 同 時 に 調 べ た 。 TNF-α の 産 生 量 は バ イ オ ソ ー ス 社 の ELISA キ ッ ト を 用 い て 測 定 し た 。
（ ６ ） 生 化 学 的 指 標 の 測 定
血 液 を 用 い て 下 記 の 生 化 学 指 標 を 検 査 セ ン タ ー に 委 託 し て 測 定 し た 。
赤 血 球 数 、赤 血 球 形 態 、白 血 球 数 、血 小 板 数 、ヘ モ グ ロ ビ ン 、総 蛋 白 、ア ル ブ ミ ン 、 A/G 比 、AST、ALT、LDH、ア ル カ リ フ ォ ス フ ァ タ ー ゼ 、γ -GTP、総 ビ リ ル ビ ン 、総 コ レ ス テ ロ ー ル 、HDL コ レ ス テ ロ ー ル 、LDL コ レ ス テ ロ ー ル 、中 性 脂 肪 、尿 素 窒 素 、ク レ ア チ ニ ン 、尿 酸 、 Na、 K、 Cl、 CPK、 ア ミ ラ ー ゼ 、 血 糖 、 HbA1C。
（ ７ ） タ デ 抽 出 物 の 安 全 性 試 験
① タ デ 抽 出 物 の 安 全 性 試 験 （ 厚 生 労 働 省 基 準 ） １ ． 材 料 及 び 実 験 方 法
７ 週 齢 の Wistar 雄 ラ ッ ト 6 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス ・ リ バ ー 社 よ り 、 MF 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 。 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 。
２ ． 飼 料 及 び 飼 育 条 件
室 温 23±2℃ 、 相 対 湿 度 50～ 60％ 、 12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル （ 7:00～ 19:00） の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 、 タ デ 抽 出 物 （ 2.5g/Kg） を 胃 ゾ ン デ に て 単 回 投 与 し た 。 ３ ． 観 察
接 触 刺 激 に 対 す る 反 応 、運 動 、呼 吸 、痙 攣 、排 泄 物 、体 毛 お よ び 皮 膚 、 病 理 組 織 学 的 変 化 、 体 重 の 変 化 の 観 察 を 行 っ た 。
② Wistar 系 SPF ラ ッ ト の タ デ 抽 出 物 添 加 実 験 １ ． 材 料 及 び 実 験 方 法
9 週 齢 の Wistar 雄 ラ ッ ト 24 匹 は 日 本 チ ャ ー ル ス ・ リ バ ー 社 よ り 、 MF 粉 末 飼 料 は オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 よ り 購 入 し た 。 飲 水 は 水 道 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 。 実 験 飼 料 は 芽 タ デ 酢 酸 抽 出 物 を 0.5％ の 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の （ 実 験 飼 料 A） 及 び 生 長 タ デ 80％ エ タ ノ ー ル 抽 出 物 を 0.1％ 割 合 で MF 粉 末 に 混 合 し た も の（ 実 験 飼 料 B）を 用 い た 。
２ ． 飼 料 及 び 飼 育 条 件
室 温 23±2℃ 、 相 対 湿 度 50～ 60％ 、 12 時 間 の 明 暗 サ イ ク ル （ 7:00～ 19:00） の 環 境 下 で 1 週 間 の 予 備 飼 育 後 、動 物 は 各 8 匹 を 3 群 に 分 け た 。Ⅰ 群（ 正 常 対 照 ラ ッ ト ） に は 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で MF 粉 末 を 与 え た 。Ⅱ 群（ 実 験 飼 料 A 投 与 ラ ッ ト ）に は 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で 実 験 飼 料 A を 与 え た 。 Ⅲ 群 （ 実 験 飼 料 B 投 与 ラ ッ ト ） に は 、 2 週 間 30g/匹 /日 の 割 合 で 実 験 飼 料 B を 与 え た 。
３ .測 定 項 目 １ ） 体 重
入 荷 時 、 群 分 け 時 及 び 屠 殺 時 に 測 定 し た 。 ２ ） 屠 殺
ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム 麻 酔 下 で 屠 殺 し た 。 ３ ） 血 液 検 査
腹 大 動 脈 か ら 採 血 し 血 液 一 般 、生 化 学 検 査（ 血 漿 ）、赤 血 球 変 形 能（ 孔 径：3.85、
4.24μ m） を 測 定 し た 。
（ ８ ） ヒ ト に 対 す る 機 能 性 成 分 含 有 ド リ ン ク 剤 の 投 与 法 対 象 1.年 齢 （ 24～ 51 歳 ）
2.性 別 女 性 3.健 常 者 被 検 者 数 12 名
試 験 デ ザ イ ン プ ラ セ ボ 対 照 ・ 単 盲 検 並 行 比 較 試 験
タ デ ド リ ン ク 1 日 1 回 1 本 を 1 週 間 摂 取 し 、有 効 性 と 安 全 性 を 評 価 す る 。
有 効 性 評 価 項 目 血 液 生 化 学 的 検 査
摂 取 前 、 摂 取 後 に 空 腹 時 血 糖 、 総 コ レ ス テ ロ ー ル 、 HDL コ レ ス テ ロ ー ル 、 LDL コ レ ス テ ロ ー ル 等 の 測 定 を 行 っ た 。
な お 、 い ず れ も イ ン フ ォ ー ム ド ・ コ ン セ ン ト を 得 ら れ た 者 に 行 っ た 。
３ － ３ － ４ 実 験 結 果
（ １ ） STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト （ 予 防 モ デ ル ） イ ン ビ ボ 実 験 （ 図 1）
紅 タ デ 抽 出 成 分 の 投 与 に よ り 下 記 の 結 果 が 得 ら れ た。
１ ） 酸 化 に よ る 肝 機 能 （ AST,ALT） の 悪 化 を 統 計 的 に 有 意 に 防 止 し た 。 ２ ） 総 コ レ ス テ ロ － ル に 差 は な か っ た が LDL コ レ ス テ ロ － ル が 低 下 し た 。 ３ ） 赤 血 球 変 形 能 （ サ ラ サ ラ 度 ） の 低 下 (悪 化 )を 防 止 す る 傾 向 が み ら れ た 。 ４ ） そ の 他 の 測 定 項 目 に は 有 意 な 変 化 は 見 ら れ な か っ た 。
白血球(×102/μｌ)
0 10 20 30 40 50 60
STZ（-）
実験食（-）
対照群
STZ（＋）
実験食（-）
群
STZ（＋）
実験食（＋）
群
血小板(×104/μl)
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
STZ（-）
実験食（-）
対照群
STZ（＋）
実験食（-）
群
STZ（＋）
実験食（＋）
群
総蛋白（g/dｌ）
0.0 0.51.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
STZ（-）
実験食（-）
対照群
STZ（＋）
実験食（-）
群
STZ（＋）
実験食（＋）
群
AST（IU/ｌ）
0 100 200 300 400 500 600
STZ（-）
実験食（-）
対照群
STZ（＋）
実験食（-）
群
STZ（＋）
実験食（＋）
群
※
総コレステロール（mg/dｌ）
0 10 20 30 40 50 60 70
STZ（-）
実験食（-）
対照群
STZ（＋）
実験食（-）
群
STZ（＋）
実験食（＋）
群
LDLコレステロール（mg/dｌ）
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
STZ（-）
実験食（-）
対照群
STZ（＋）
実験食（-）
群
STZ（＋）
実験食（＋）
群 ALT（IU/ｌ）
0 50 100 150 200 250 300
STZ（-）
実験食（-）
対照群
STZ（＋）
実験食（-）
群
STZ（＋）
実験食（＋）
群
※
（ ２ ） STZ 糖 尿 病 ラ ッ ト （ 治 療 モ デ ル ） イ ン ビ ボ 実 験 （ 図 ２ ） 紅 タ デ 抽 出 物 成 分 の 投 与 に よ り 下 記 の 結 果 が 得 ら れ た 。
１ ） 芽 タ デ 抽 出 物 は 肝 機 能 （ AST,ALT） の 悪 化 を 有 意 に 予 防 し 、 LDL コ レ ス テ ロ － ル を 低 下 さ せ た 。 血 糖 値 も 改 善 傾 向 を 示 し た 。 ま た 、 赤 血 球 変 形 能 （ サ ラ サ ラ 度 ） を 改 善 し た 。
２ ） 生 長 タ デ で は 、 酸 化 に よ る 白 血 球 、 血 小 板 低 下 を 防 止 し 、 LDL コ レ ス テ ロ － ル を 低 下 さ せ る 効 果 が み ら れ た 。 赤 血 球 変 形 能 改 善 は 見 ら れ な か っ た 。
図 ２ 紅 タ デ 抽 出 成 分 投 与 後 の 血 液 生 化 学 検 査 結 果 （ 治 療 モ デ ル ）
血小板（×104/μl）
0 20 40 60 80 100
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット 対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群
AST(IU/l)
0 100 200 300 400 500 600
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット
対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群
赤血球（×104/μl）
600 640 609 720 760 800
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット
対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群
白血球（×102/μl）
0 5 10 15 20 25 30
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット 対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群
血小板（×104/μl）
0 20 40 60 80 100
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット 対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群
AST(IU/l)
0 100 200 300 400 500 600
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット
対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群
赤血球（×104/μl）
600 640 609 720 760 800
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット
対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群
白血球（×102/μl）
0 5 10 15 20 25 30
正常ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット STZ糖尿病ラット 対照群 対照群 芽タデ投与群 生長タデ投与群