材料と方法

2.4.1. Cyp4f39^−/−マウスの作製

Cyp4f39^−/−マウスは，CRISPR/Cas9 システムを用いて作製した。Cyp4f39 遺伝 子のエキソン11内にPAM（Protospacer Adjacent Motif）配列に隣接する23塩基 のガイド RNA 標的配列を設定し，最終的に Cas9タンパク質による切断の標的 となるように，ガイドRNA標的配列を含むプライマーペア（f1およびf2; Table 1）を設計し，アニーリングさせたものを，ガイドRNAとCas9タンパク質を共 発現させる CRISPR/Cas9 ベクターである pX330（Addgene, Watertown, MA）の BbsⅠサイトにクローニングした。このプラスミドを C57BL/6J マウスの受精卵 に注入し，仮親へ移植した。産道感染の可能性を排除するため，帝王切開して蘇 生した新生仔を里親に育てさせた。産仔の尾からゲノムDNAを抽出し，エキソ ン 11 の標的配列周辺を増幅するプライマーを用いて PCR を行い，増幅断片の シークエンス解析を行った結果，32 塩基が欠失し，フレームシフトによるナン センス変異が生じた個体が得られた。このマウスを C57BL/6J マウスと交配し，

Cyp4f39^+/−マウス系統を確立した。Cyp4f39^−/−マウスは，Cyp4f39^+/−マウスを交配 することで作製した。マウスのジェノタイピングはマウステールから抽出した ゲノム DNA，プライマー（p1 および p2; 表 1）を用いて PCR による増幅のの ち，制限酵素AflⅢで処理することで確定させた。CRISPR/Cas9システムによっ て欠損した32塩基中にAflⅢサイトが含まれているため，Cyp4f39^−/−マウスに由 来するPCR産物を制限酵素処理した場合，AflⅢによる切断が生じないことを利 用している。

2.4.2. マウスの飼育

マウスの飼育は，SPF環境下，室温23 ± 1 °C湿度50 ± 5 %，12時間毎に明/暗 のサイクルを繰り返す条件で行い，摂餌と給水は自由に行える状態で行った。妊 娠可能な雌を一晩雄と同居させて交配を行い，翌日の正午に雄を別のケージに 移し，この時点を胎生 0.5 日とした。胎生 18.5 日で帝王切開により胎仔を摘出 し，蘇生を行ったのちに解析に使用した。動物実験はすべて，北海道大学動物実 験委員会の規定に従い行った。

2.4.3. 皮膚バリアアッセイ

経表皮水分損失量の測定は，胎生 18.5日の時点で帝王切開により摘出した仔 マ ウ ス の 背 部 に 対 し て ， 生 存 し た 状 態 で 経 表 皮 水 分 蒸 散 計 AS-VT100RS evaporimeter（Asahi Biomed, Yokohama, Japan）を用いて閉鎖式チャンバー法にて 行った。

トルイジンブルー観察は，胎生 18.5日の時点で帝王切開により摘出した仔マ

42

ウスをメタノールに5分間浸したのち，PBSでリンスした状態で0.1 %（w/v %） トルイジンブルー溶液で 30 分間染色を行った。染色後，PBS で再度リンスし，

観察に使用した。

2.4.4. 皮膚の形態観察

ヘマトキシリン/エオジン染色は，胎生18.5日の時点で帝王切開により摘出し た仔マウスの背部の皮膚を使用した。マウスから剥離させた皮膚を10 %中性緩 衝ホルマリン溶液（pH 7.2）で48時間室温にて固定した。固定した皮膚をメタ ノールで脱水したのちキシレンで洗浄し，密閉式自動固定包埋装置（Tissue-Tek

VIP-6; Sakura，Torrance，CA）を使用してパラフィンを浸透させた。これをパラ

フィンブロック包埋装置（TEC-P-DC; Sakura）によってブロック化した。皮膚の パラフィンブロックを，ミクロトームREM-710（Yamato Kohki，Asaka，Japan） を使用して切断し，4 μmの切片を作製した。切片は自動染色装置（Tissue-Tek DRS

2000; Sakura）を使用してキシレンとエタノールで脱パラフィン処理，水洗のの

ちヘマトキシリン/エオジン溶液で染色し，再度エタノールとキシレンで脱水し た。染色された切片はLeika DM5000B microscope（Leica Microsystems，Wetzlar， Germany）を用いて明視野観察を行い，DFC295 digital color cameraで撮影した。

透過型電子顕微鏡解析は，胎生 18.5日の時点で帝王切開により摘出した仔マ ウスの背部の皮膚を使用した。剥離させた皮膚を5 %グルタルアルデヒド/0.1 M カコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）に浸し，4 °Cで72時間固定した。固定 した皮膚は0.1 Mカコジル酸ナトリウム緩衝液（pH 7.4）で一晩さらに固定した のち，1 % OsO4/0.05 Mカコジル酸緩衝液（pH 7.4）で60分および0.5 % RuO4で 30分処理した（Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA）。固定した皮膚をエタ ノールと酸化プロピレンで段階的に脱水し，Epon 812 resin（Taab Laboratories, Berkshire, United Kingdom）に包埋したのち，70 °Cで4日間処理した。これを厚

さ 70 nm の超薄切片に切断し，酢酸ウラニルとクエン酸鉛で染色した。切片の

解析はJEM-1400Plus（JEOL, Tokyo, Japan）で行った。撮影はCCD camera（EM-14830RUBY2; JEOL）で行った。

2.4.5. 表皮脂質組成解析

脂質抽出は，胎生 18.5日の時点で帝王切開により摘出した仔マウスの背部の 皮膚から行った。剥離させた皮膚は，600 μLのPBSに浸し，55 °Cで3 分間加 温したのち，ピンセットを用いて表皮と真皮を分離した。採取した表皮10–20 mg を乾熱滅菌したホモジェナイザーにいれ，2 mL の chloroform/methanol/water

（30:60:8, v/v/v）を加え，約10分間粉砕操作を行った。抽出物を50 °Cで15分 加温後，800 × gで15分遠心し，上清を回収した。抽出操作を3回行い，上清は

43

すべてまとめた。集めた上清に4.8 mLの水を加え，二層分配を行った。800 × g で15分遠心し，有機層を回収した。乾固させた有機層はchloroform/methanol（2:1， v/v）で再溶解し，TLCおよびLC-MS/MS解析に使用した。

表皮 1 mg 分の脂質を順相 TLC（Silica Gel 60 TLC plates; Merck Darmstadt,

Germany）を用いて3つの溶媒によって分離した。

1. chloroform/methanol/water （40:10:1, v/v）で底辺から2 cmまで展開後乾燥させ，

再度底辺から5 cmまで展開。

2. chloroform/methanol/acetic acid (47:2:0.5, v/v)で底辺から8.5 cmまで展開。

3. hexane/diethylether/acetic acid (65:35:1, v/v)で底辺から9.5 cmまで展開した。

分離した脂質は銅リン酸試薬 [3 % (w/v) CuSO4 in 8 % (v/v)リン酸溶液]の噴霧と

180 °C 3分の加熱によって呈色させた。

表皮125 ng分の脂質はLC-MS/MS解析に使用した。脂質の分離および検出は，

超高速液体クロマトグラフィー（UPLC）連結三連四重極型質量分析計（Xebo

TQ-S; Waters, Milford, MA）を用いて行った。UPLCによる脂質の分離は，グラジエ

ントシステムを用い，移動相 A [acetonitrile/water (3:2, v/v) + 5 mM ammonium formate]と移動相B [acetonitrile/2-propanol (1:9, v/v) + 5 mM ammonium formate] の 混合比を変えて行った（表3）。カラムは逆相系カラム（ACQUITY UPLC CSH C18 column; 粒子径, 1.7 μm; 内径, 2.1; 長さ, 100 mm; Waters）を用い，測定中のカラ

ム温度は55 °C で測定を行った。アシルセラミド，ω-OHセラミド，α-OH セラ

ミド，セラミドの検出は，イオン化にエレクトロスプレーイオン化法を用い，

MRMでポジティブイオンの検出を行った。Q1およびQ3の値とコーン電圧，コ リジョンエネルギーは各分子種に特異的な値を用いた（表 5–7）。測定したデー タの解析はMassLynx software（Waters）を用いて行った。

2.4.6. 定量的RT-PCR

総 RNA 抽出は，胎生 18.5 日の時点で帝王切開により摘出した仔マウスの背部 の皮膚から行った。剥離させた皮膚は，600 μLのPBS に浸し，55 °Cで3分間 加温したのち，ピンセットを用いて表皮と真皮を分離した。総 RNA 抽出は NucleoSpin RNA kit（Machery-Nagel, Dueren, Germany）を用いて行った。RT-PCR は，50 ng/μLに調節した総RNA，プライマー（表2），One step TB Green PrimeScript RT-PCR kitⅡ（Takara Bio）を用いて行った。サーマルサイクラーは，CFX96 Touch real-time PCR detection system（Bio-Rad, Hercules, CA）を使用し，50 °Cで30分，

94 °Cで2分のインキュベートののち，94 °Cで30秒，60 °Cで30秒，72 °Cで 1分を35サイクル行った。mRNA発現量はそれぞれHprtの発現量で補正した。

44

3. ω水酸化脂質による涙液バリア形成機構の解明