5‑1 背景
5‑1‑1緒 言
マ トリ ク ス 支 援 レー ザ ー 脱 離 イ オ ン化(MALDI)法 は 多 種 の 分 子 を 容 易 に イ オ ン化 す る こ とが 可 能 で あ る が 、 様 々 な 分 子 を含 む 混 合 物 中 に お い て 目的 の 分 子 の み を 選 択 的 に イ オ ン 化 す る こ と が 困難 で あ る。 そ の た め 構 造 異 性 体 な ど を含 む 混 合 物 に お い て は 質 量 分 析 計 に お い て 区別 して 検 出 す る こ と が で き な い 。 本 章 で は 温 度 に よ っ て 構 造 が 変 化 す る温 度 応 答 性 高 分 子 の 一 種 で あ る ポ リ ビニ ル メ チ ル エ ー テ ル(PVME)を 用 い て 、サ ン プ ル とマ ト リク ス を コ ー テ ィ ン グ し、 そ の 後 そ こか ら サ ン プ ル を 取 り出 す こ と に よ り鋳 型 マ ト リク ス を作 製 す る。こ の 鋳 型 マ トリ ク ス を用 い る こ とに よ り、構 造 異 性 体 を 含 む 混 合 物 か ら 目的 の 分 子 の み を選 択 的 に イ オ ン 化 す る こ とが 可 能 に な る と考 え 、 質 量 分 析 計 に お け る選 択 的 な検 出 を 試 み た 。 本 研 究 で は 鋳 型 サ ン プ ル と して 三 糖 の 一 種 で あ る ラ フ ィ ノー ス を 用 い て 鋳 型 マ ト
リ ク ス を 作 製 し、 ラ フ ィ ノ ー ス お よび 同 じ く三 糖 で ラ フ ィ ノー ス の 構 造 異 性 体 で あ るマ ル ト トリオ ー ス を 測 定 し、 ラ フ ィ ノー ス の 構 造 選 択 的 検 出 を行 っ た 。
+＼
レ
● ● ●
■ ↓
●' /・ ℃P
▲
▲ ● ● ● ■
▲■▲ ▲
■
■
＼
▲ 活性炭
■THAP
● ● ●Raf
●6●M・1
PVME膜
図5‑1.鋳 型 マ トリ ク ス お よ び 構 造 選 択 的 イ オ ン化 の概 略 図 5‑1‑2温 度 応 答 性 高 分 子[1]
あ る 種 の 高 分 子 は 下 限 臨 界 溶 液 温 度(LowerCriticalSolutionTemperature:LCST)以 下 の 温 度 で は 水 に溶 解 し、 そ れ 以 上 の 温 度 で は疎 水 性 を示 し 白濁 す る。 再 び そ れ をLCST以 下 に冷 却 す る と再 び 水 に 溶 解 す る と い う可 逆 的 な 相 転 移 現 象 を 示 す 。 こ の よ うに 一 定 温 度 で 相 転 移 を示 す 高 分 子 化 合 物 を 一 般 に 温 度 応 答 性 高 分 子 と呼 ぶ 。 これ らの 高 分 子 は水 溶 液 中 の 高 分 子 の 相 転 移 現 象 の解 明 の み な らず 、機 能 性 を有 す る特 殊 な 高 分 子 と して 産 業 お よ び 医 療 用 素 材 へ の 応 用 面 に お け る研 究 も数 多 く され て い る。
こ の よ うな 高 分 子 の 一 例 と して ポ リ ビニ ル メ チ ル エ ー テ ル(PVME)が 挙 げ られ る。PVME は35℃ 付 近 に お い て 相 転 移 を 起 こす 高 分 子 で あ り、濁 度 測 定 、熱 量 測 定 、核 磁 気 共 鳴 、光 散 乱 等 の 手 法 を 用 い て 多 方 面 か ら解 析 され て き た 。 図5‑2にPVMEの 構 造 式 を 、 図5‑3に 相 転 移 の 前 後 に お け るPVME水 溶 液 の 写 真 を示 す 。
OH
3C/ n
㎏ 簿 鰻
7♂雌 ご 戸
図5‑2.PVMEの 構 造 式M図5‑3.相 転 移 の 前 後 に お け るPVME水 溶 液 の 変 化
1)Sf(左:相 転 移 前
、 右:相 転 移 後) ル 基 の 酸 素 原 子 と周 囲 の 水 分 子 との
ラ
が 、水 温 の 上 昇 に伴 い水 素 結 合 が 不 安 疋 に な 《)とと も に味 水 鄙 の 脱 水 相 か 起 こ り、局 分 手 鎖 が 収 縮 して グ ロ ビ ュ ー ル 状 に な る。 さ らに 疎 水 性 相 互 作 用 に よ り グ ロ ビ ュ ー ル が 凝 集 して 巨視 的 な 総 分 離 が 起 こ る 。 図5‑4に モ デ ル 図 を示 す 。 こ の よ うにPVMEの 相 転 移 現 象 は 水 素 結 合 と疎 水 性 相 互 作 用 との バ ラ ン ス が 崩 れ る こ と に よ っ て 引 き 起 こ され る こ とが 分 か っ て い る 。
態 吠
co
⇔
globule状 態
図5‑4.コ イ ル ー グ ロ ビ ュ ー ル 転 移
5‑2. 溶 液 中 ラ フ ィ ノ ー ス の 固 相 吸 着 実 験 5‑2‑1吸 着 剤 の 検 討
ま ずPVMEで マ トリク ス とサ ンプ ル で あ る ラ フ ィ ノ ー ス の コ ー テ ィ ン グ を 行 うに あ た り、
溶 液 中 にお い て溶 解 して い る ラ フ ィ ノ・一一・̀スを疎 水 性 のPVME中 に 取 り込 む 必 要 が あ る。 そ の た め 吸 着 剤 を 用 い て 溶 液 中 の ラ フ ィ ノ ー ス を 固 相 吸 着 させ 、 吸 着 剤 と マ ト リ ク ス を PVME内 に 取 り込 む 方 法 を考 え た 。 本 節 で は構 造 内 に 細 孔 を持 ち 、 分 子 等 を そ の構 造 内 に 取 り込 む こ とが で き る ゼ オ ラ イ トや 活 性 炭 に 着 目 し、 溶 液 中 か ら効 率 よ く ラ フ ィ ノ ー ス を
吸 着 で き る 吸 着 剤 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 5‑2‑1‑1試 料 調 製 お よ び 実 験 条 件
濃 度 が1mg/mLの ラ フ ィ ノ ー ス(RaD溶 液50mL(溶 媒 は エ タ ノ ー ル:水=4:1(v/v))に 対 し 、 吸 着 剤(ゼ オ ラ イ ト、 活 性 炭)200mgを 加 え10分 間 室 温 に て 擁 拝 を 行 っ た 。 そ の 後 吸 引 ろ 過 を 行 い 、 得 ら れ た 固 体 を50℃ で1日 以 上 乾 燥 させ た 。 そ の 固 体 を50mLの 溶 媒 (エ タ ノ ー ル:水=4:1(v/v))に 溶 か し 、 ス テ ン レ ス 基 板 上 に1pL滴 下 し 、 溶 媒 を 揮 発 さ せ た 。
次 に2,4,6一 ト リ ヒ ドロ キ シ ア セ トフ ェ ノ ン(THAP)とNa置 換 し た モ ル デ ナ イ ト型 ゼ オ ラ イ ト(NaM20)を 重 量 比1:2で 混 合 し た 。 そ れ をTHAPが4mg/mLに な る よ う に 混 合 マ ト
リ ク ス 溶 液(溶 媒 は エ タ ノ ー ル:水=4:1(v/v))を 作 製 し 、 そ れ を1pL先 述 の サ ン プ ル 上 に 滴 下 し 、 溶 媒 を 揮 発 さ せ 混 合 結 晶 を 作 製 し た 。
こ れ をwaters社 製 のMALDImicroMXに 導 入 し て 測 定 を 行 っ た 。 測 定 条 件 は 以 下 に 示 す 。
測 定 条 件
レ ー ザ ー 波 長337nm レ ー ザ ー パ ワ ー6.90pJ 積 算 回 数200shots
5‑2‑1‑2結 果
ゼ オ ライ トと活 性 炭 を そ れ ぞ れ 吸 着 剤 と して 用 い た 場 合 の マ ス ス ペ ク トル を 図5‑5に 示 す 。
( .= .邸 ) 喜 ω = ￡ 三
20x103
15
10
5
0
[THAP+H】
/
Zeolite
ActivatedCarbon
[THAP+Na】
[disaccharide+Na】[Raf+Na】
//
0100200300400500600
mノ 乞
図5‑5.吸 着 剤 を 用 い た と き の ラ フ ィ ノ ー ス の マ ス ス ペ ク トル
700
図5‑5よ りゼ オ ラ イ トで は溶 液 中 の ラ フ ィ ノー ス を 固 相 吸 着 させ る こ とが 困 難 で あ る が 、 活 性 炭 で は 固 相 吸 着 させ る こ と に成 功 した 。 ま た 活 性 炭 を用 い た 場 合 は 二 糖 由来 の ピー ク が 出現 した 。 こ れ は 活 性 炭 に レー ザ ー が 照 射 され た こ と に よ り ラ フ ィ ノ ー ス が 二 糖 に 分 解
され た た め と考 え られ る 。 次 に活 性 炭 の 吸 着 効 率 に つ い て 検 討 を 行 っ た。
5‑2‑2活 性 炭 の 吸 着 効 率 に つ い て 検 討 5‑2‑2‑1試 料 調 製 と 実 験 条 件
サ ン プ ル 溶 液 と して1mg/mLの ラ フ ィ ノ ー ス 溶 液(溶 媒 は エ タ ノー ル:水=4:1溶 液)に 活 性 炭 を入 れ 、10分 禮絆 した 後 ろ過 し、 ろ 液 を 得 た 。 サ ン プ ル と して こ の ろ 液 と活 性 炭 を 加 え る 前 の ラ フ ィ ノー ス 溶 液 を1pLス テ ン レス 基 板 上 に滴 下 し溶 媒 を揮 発 させ た 。
次 に 先 述 の マ トリ ク ス 溶 液 を1pLサ ン プル 上 に 滴 下 し、溶 媒 を揮 発 させ て 混 合 結 晶 を作 製 した 。
これ を先 述 の 装 置 に導 入 して 測 定 を 行 っ た 。 測 定 条 件 は 以 下 に 示 す 。 測 定 条 件
レ ー ザ ー 波 長337nm レ ー ザ ー パ ワ ー6.90pJ 積 算 回 数200shots
5‑2‑2‑2結 果
1mg/mLラ フ ィ ノ ー ス 溶 液 と 活 性 炭 に 固 相 吸 着 させ た ラ フ ィ ノ ー ス 溶 液 の 結 果 を 図5‑6 に 示 す 。
500
400
ら
5 ci300
》
喜 2
.ig200 .⊆
100
0
525 526527528529
m/z
図5‑6.吸 着 前 後 の ラ フ ィ ノ ー ス の マ ス ス ペ ク トル
530
図5‑6よ り 固 相 吸 着 に よ り ラ フ ィ ノ ー ス を 一 部 除 去 し た ろ 液 の マ ス ス ペ ク トル の ピ ー ク 強 度 は1mg/mLの ラ フ ィ ノ ー ス 溶 液 に 比 べ て ピ ー ク 強 度 が 減 少 し た 。 こ こ で 活 性 炭 に よ る ラ フ ィ ノ ー ス の 吸 着 率 を 以 下 の よ う に 定 義 し た 。
吸 着 剤 を 用 い た 際 の ラ フ ィ ノ ー ス の[Raf+Na]+ピ ー ク 強 度 吸 着 率
二1‑
1mg/mLラ フ ィ ノ ー ス 溶 液 の[Raf+Na]+の ピ ー ク 強 度
以 上 の 結 果 よ り活 性 炭 に よ る ラ フ ィ ノ ー ス の 吸 着 効 率 は65%と 算 出 され 活 性 炭 に よ りエ タ ノー ル:水=4:1溶 媒 中 の ラ フ ィ ノー ス を 高 効 率 に 吸 着 で き る こ と が 分 か っ た。
5‑2‑3活 性 炭 を マ ト リ ク ス に 応 用 で き る か 検 討
上 記 の 結 果 よ り活 性 炭 を使 用 す る こ とで 、 ラ フ ィ ノ ー ス を 高 効 率 にPVME疎 水 性 ゲ ル に 内 包 す る こ とが で き る と考 え た 。 ま た 、図5‑7に 示 す 拡 散 反 射 ス ペ ク トル よ り、活 性 炭 自身 が 照 射 レー ザ ー 波 長(337nm)に 吸 収 を持 つ こ とか ら活 性 炭 を マ ト リク ス と して使 用 す る こ
とが で き る か 検 討 した 。
7.0
6.5
6.0
Σ5・5
5.0
4.5
4.0
200 300400500600
wavelength(nm)
図5‑7.活 性 炭 の 拡 散 反 射 ス ペ ク トル
700
5‑2‑3‑1試 料 調 製 と 実 験 条 件
マ ト リク ス 溶 液 と して 活 性 炭4mg/mL、 サ ン プ ル 溶 液 と して ラ フ ィ ノ ー ス1mg/mL溶 液 を そ れ ぞ れ 調 製 した(溶 媒 は と も に エ タ ノ ー ル:水=4:1)。 そ れ ら をそ れ ぞ れ1pLず つ ス テ ン レス 基 板 上 に 滴 下 し、 溶 媒 を揮 発 させ て 混 合 結 晶 を 作 製 した 。
これ を先 述 の 装 置 に導 入 して 測 定 を 行 っ た 。 測 定 条 件 は 以 下 に 示 す 。 測 定 条 件
レ ー ザ ー 波 長337nm レ ー ザ ー パ ワ ー6.9011J 積 算 回 数200shots
5‑2‑3‑2結 果
本 実 験 の 結 果 を 図5‑8に 示 す 。
1200
1000
今
需800 ε 診'あ
⊆ 600 9 .⊆
400
200
0
100200300400500600
m/2
図5‑8.活 性 炭 を マ ト リ ク ス と し て 使 用 し た 際 の ラ フ ィ ノ ー ス の マ ス ス ペ ク トル 図5‑8よ り活 性 炭 を マ トリ ク ス と して 使 用 した 場 合 、 ラ フ ィ ノー ス を 三 糖 の ま ま 検 出 す る こ とは で きず 、 二 糖 に 分 解 して 検 出 され た 。 そ の た め 本 研 究 に お い て活 性 炭 とTHAPを 混 合 した マ トリ ク ス を用 い る 必 要 が あ る とい うこ とが 分 か っ た 。
5‑3 活 性 炭 とPVMEの 混 合 比 に つ い て の 検 討
活 性 炭(AC)に サ ン プ ル で あ る ラ フ ィ ノ ー ス を 吸 着 させ て マ ト リ ク ス と と も に 疎 水 性 PVMEに 内 包 させ た 後 、透 析 に よ りサ ン フ.ルの ラ フ ィ ノ・一一・̀スをPVME内 か ら取 り除 く こ と に よ り鋳 型 マ ト リク ス の 作 製 を試 み る。そ こ でACの 混 合 比 がPVMEよ り極 端 に 高 い 場 合 、 PVMEに よ る活 性 炭 の コー テ ィ ン グ が 不 十 分 で あ る た め 、 マ ト リク ス が む き 出 しに な っ て い る箇 所 が 存 在 す る可 能 性 が 考 え られ る。 ま た 活 性 炭 の 混 合 比 がPVMEよ り極 端 に 低 い 場 合 、活 性 炭 の周 囲 のPVME層 が 厚 す ぎ る た め透 析 に よ るサ ンプ ル の 除 去 が 困難 に な る と考 え られ る。そ の た めACとPVMEの 重 量 比(ACIPVME)が 重 要 で あ る と考 え 、最 適 な 重 量 比 に つ い て 検 討 した 。
5‑3‑1試 料 調 製 と 実 験 条 件
ま ず 乳 鉢 でACとTHAPと ラ フ ィ ノ ー ス を 重 量 比1対1対1で 混 合 した 。 次 に そ の 混 合 した もの を 適 量 のPVME溶 液(10wt%、 溶 媒 は エ タ ノ ー ル:水=4:1)に 加 え 、 全 量 が20 mLに な る よ う溶 媒 を加 え た 。
そ の 後 そ の 溶 液 を加 熱 撹 拝 し、50℃ の 溶 液 を1pLス テ ン レ ス 基 板 上 に滴 下 し、溶 媒 を揮 発 させ た 。 これ を先 述 の 装 置 に導 入 して 測 定 を 行 っ た 。 測 定 条 件 は 以 下 に 示 す 。
測 定 条 件
レ ー ザ ー 波 長337nm レ ー ザ ー パ ワ ー8.60pJ 積 算 回 数200shots
5‑3‑2結 果
実 験 結 果 を 図5‑9に 示 す 。
14x103
12
ACIPVMEニ0.1 ACIPVME=1 ACIPVMEニ10 ACIPVMEニ100
( .= .ε 喜 ω = ￡ 三
108
6
4
2
0
【Monosaccharide+Na】
[THAP+Na】
[Raf+Na】
[Disaccharide+Na】
/
f+K】0100200300400500600
mlz
図5‑9.ACIPVMEを 変 化 させ た 時 の ラ フ ィ ノ ー ス の マ ス ス ペ ク トル
700
図5‑9よ りACIPVMEが10以 下 の と き ラ フ ィ ノ ー ス を 検 出 す る こ と が で き ず 、ACIPVME が100の と き ラ フ ィ ノ ー ス を 検 出 す る こ と が で き た 。 こ の こ と か らACIPVMEが10以 下 の と きAC、THAP、 ラ フ ィ ノ ー ス はPVMEに 内 包 さ れ て い る と 思 わ れ 、ACIPVME=100 の と きAC、THAP、 ラ フ ィ ノ ー ス の 一 部 がPVMEに コ ー テ ィ ン グ さ れ ず に む き 出 し 状 態 に な っ て い る と 思 わ れ る 。
そ の た め 、ACIPVME=10が 最 適 で あ る と 考 え た 。 次 に 透 析 条 件 に つ い て 検 討 す る が 、 ACIPVME=10で は 元 々 ラ フ ィ ノ ー ス が 検 出 さ れ て い な い た め 、透 析 が 適 当 か 検 討 す る こ と
が 困 難 で あ る 雨 、ACIPVME=100に お い て 透 析 実 験 を 行 っ た 。
5‑4 透析
先 述 の 通 りACIPVME=10の と き 最 適 な 条 件 で サ ン プ ル で あ る ラ フ ィ ノ ー ス と マ ト リ ク
ス を疎 水 性PWEに 内 包 す る こ とが で きた 。 次 に ラ フ ィ ノ ー ス の 鋳 型 を 作 製 す るた め 、 そ こ か ら ラ フ ィ ノ ー ス を取 り出 す 必 要 が あ り、そ の た め の 透 析 条 件 に つ い て 検 討 した 。 しか し ACIPVME=10で は 元 々 ラ フ ィ ノー ス が検 出 され て い な い た め 、透 析 が 適 当 か 検 討 す る こ と
が 困 難 で あ る た め 、ACIPVME=100に お い て 透 析 実 験 を行 っ た 。 5‑4‑1試 料 調 製 と 実 験 条 件
ACIPVME=100の 重 量 比 に お い て 先 ほ ど と同 様 の 条 件 で コー テ ィ ン グ を行 っ た 後 、 コー テ ィ ン グマ ト リク ス 溶 液 を5mL透 析 チ ュ ー ブ に と り、50℃ の水 に て10分 間 透 析 を行 っ た。 透 析 後 の 溶 液 を1pLス テ ン レス 基 板 上 に 滴 下 、 溶 媒 を 揮 発 させ た 。 これ を先 述 の 装 置 に 導 入 して 測 定 を行 っ た 。 測 定 条 件 は 以 下 に示 す 。
測 定 条 件
レ ー ザ ー 波 長337nm レ ー ザ ー パ ワ ー8.6011J 積 算 回 数200shots
5‑4‑2結 果
実 験 結 果 を 図5‑10に 示 す 。
200
150
言 豆
喜1・ ・ 2
￡ .⊆
50
0
matrix(afterdialysis)only
0100200300400500600700
m/z
図5‑10.透 析 後 のACIPVME=100鋳 型 マ ト リ ク ス の マ ス ス ペ ク トル
図5‑9に 示 す 透 析 前 のACIPVME=100の マ ト リ ク ス で は ラ フ ィ ノ ー ス 由 来 の ピ ー ク が 高