試 験 サ ン プ ル の 状 態 お よ び 環 境 要 因 の 評 価
ISS に て 約 1 か 月 間 保 管 し た 後 、SpX-8 で 地 上 帰 還 し た FS の パ ッ ケ ー ジ 外 観 、LcS カ プ セ ル 、温 度 ロ ガ ー お よ び バ イ オ パ ド レ ス に 損 傷 は み ら れ な か っ た（Fig. 4-1）。FS、GC-US お よ び GC-JP の 環 境 温 度 履 歴 を Fig. 4-2 に 示 す 。 FS は 、 ヒ ュ ー ス ト ン の 倉 庫 に 移 さ れ て か ら ISS 保 管 後 に 地 上 へ 帰 還 す る ま で 、19.0℃ ～24.5℃ の 温 度 帯 で 保 管 さ れ て お り 、 室 温 保 管 期 間 に お け る 平 均 温 度 は 21.5℃ で あ っ た 。ISS 船 内 で の 保 管 期 間 中 は 、20.0℃ ～24.5℃ の 温 度 範 囲 で 維 持 さ れ て い た 。FS の 室 温 保 管 期 間 中 、GC-US お よ び GC-JP は 21℃ ～ 22℃ で 安 定 的 に 維 持 さ れ た 。作 業 の た め 一 時 的 に 冷 蔵 庫 か ら 取 り 出 し た 場 合 を 除 き 、 冷 蔵 保 管 期 間 中 は 4℃ ～10℃ で 維 持 さ れ た 。
バ イ オ パ ド レ ス に よ る 放 射 線 の 測 定 結 果 を Table 4-1 に 示 す 。ISS 保 管 中 の FS に 対 す る 総 吸 収 線 量 は 8.53 ± 0.67 mGy in water、総 線 量 当 量 は 17.08 ± 1.39 mSv で あ っ た 。1 日 当 た り の 吸 収 線 量 率 、 線 量 当 量 率 は そ れ ぞ れ 0.26 ± 0.02 mGy、0.52 ± 0.04 mSv と 算 出 さ れ た 。こ れ ら の 値 は 、GC-JP の 値（0.002 mGy/
日 、0.004 mSv/日 ） の 約 130 倍 で あ っ た 。 LcS 生 菌 数
LcS カ プ セ ル 中 の LcS 生 菌 数 の 推 移 を Fig. 4-3 に 示 す 。 製 造 直 後 に お け る LcS の 生 菌 数 は 2.12 × 1011 CFU/g 粉 末 で あ っ た 。 地 上 対 照 品 の 検 査 に よ り 、 試 験 期 間 中 に 生 菌 数 が 徐 々 に 低 下 し て い た こ と を 確 認 し た 。製 造 か ら 約 6 か 月 後 、 地 上 帰 還 し た FS、GC-US お よ び GC-JP の 生 菌 数 を 一 斉 に 測 定 し た 。 結 果 、FS は 1.05 × 1011 CFU/g 粉 末 （ 製 造 時 生 菌 数 の 49.5%）、GC-US 8.05 × 101 0 CFU/g 粉 末（ 同 38.0%）、GC-JP は 9.03 × 1010 CFU/g粉 末（ 同 42.6%）で
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あ っ た 。ま た 、PMA-qPCR法 に よ る 測 定 の 結 果 、FS は 12.5 ± 0.02 log10 cells/g 粉 末 、GC-US は 12.4 ± 0.08 log1 0 cells/g 粉 末 、GC-JP は 12.4 ± 0.10 log10 cells/g 粉 末 と な っ た （ 平 均 値 ± 標 準 偏 差 ）。
遺 伝 子 解 析 お よ び 発 酵 性 状 解 析
RAPD 解 析（Fig. 4-4）お よ び 全 ゲ ノ ム リ シ ー ケ ン ス に よ る sequence variance 解 析 に よ る 遺 伝 子 解 析（Fig. 4-5）を 実 施 し た 。6 種 類 の 異 な る プ ラ イ マ ー を 用 い た RAPD 解 析 の バ ン ド パ タ ー ン に サ ン プ ル 間 （ 製 造 時 、FS、GC-US お よ び GC-JP） で の 違 い は み ら れ な か っ た （Fig. 4-4）。 ま た 、 染 色 体 お よ び プ ラ ス ミ ド pLY101 の sequence variance 解 析 に お い て も 、 サ ン プ ル 間 で バ リ ア ン ト の パ タ ー ン は 同 様 で あ り 、 一 塩 基 多 型 も 確 認 さ れ な か っ た （Fig. 4-5）。
ま た 、 試 験 サ ン プ ル 中 の LcS を 再 培 養 し た と き の 生 育 曲 線 お よ び pH 変 化
（Fig. 4-6）、49 種 類 の 糖 に 対 す る 発 酵 性 を 調 べ た （Table 4-2、Fig. 4-7）。 こ れ ら 発 酵 性 状 も サ ン プ ル 間 で 違 い は 認 め ら れ な か っ た 。
免 疫 指 標 解 析
こ れ ま で の 研 究 か ら 、LcS の 細 胞 壁 を 構 成 す る 糖 鎖 の 特 徴 的 な 構 造 が 貪 食 細 胞 に よ る 消 化 へ の 耐 性 に 寄 与 し 、免 疫 機 能 の 維 持 、活 性 化 に 重 要 な 役 割 を 担 う こ と が 示 唆 さ れ て い る （16, 106）。 そ こ で 、 こ の 糖 鎖 を 含 む 細 胞 壁 構 造 を 認 識 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 L8 へ の 反 応 性 （Fig. 4-8）、 細 胞 壁 溶 解 酵 素
（N-acetylmuramidase）に 対 す る 消 化 耐 性（Fig. 4-9）を 評 価 し た 。い ず れ も 、 FS と GC-US、GC-JP で 同 等 の 結 果 を 示 し た 。 さ ら に J774.1 細 胞 を 用 い て 各 試 験 サ ン プ ル 中 の LcS に よ る IL-12 産 生 誘 導 能 を 比 較 し た （Fig. 4-10）。FS、 GC-US お よ び GC-JP の い ず れ も 濃 度 依 存 的 に IL-12 産 生 を 誘 導 し 、サ ン プ ル 間 で 誘 導 能 に 違 い は み ら れ な か っ た 。
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Fig. 4-1. ISS 保 管 後 に 地 上 帰 還 し た 試 験 サ ン プ ル （FS）。A： パ ッ ケ ー ジ お よ び LcS カ プ セ ル の 外 観 、B： バ イ オ パ ド レ ス （ 左 ） お よ び 温 度 ロ ガ ー
（ 右 ）。
A
B
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Fig. 4-2. 各 試 験 サ ン プ ル の 環 境 温 度 履 歴 。 上 段 （ 青 ）：FS、 中 段 （ オ レ ン ジ ）：GC-US、 下 段 （ 緑 ）：GC-JP。
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Table 4-1. ISS 保 管 中 の FS の 放 射 線 被 曝 線 量 総 吸 収 線 量 (mGy in water) 8.53 ± 0.67 総 線 量 当 量 (mSv) 17.08 ± 1.39 吸 収 線 量 率 (mGy/day) 0.26 ± 0.02 線 量 当 量 率 (mSv/day) 0.52 ± 0.04 平 均 線 質 係 数 2.00 ± 0.23
FS に 含 ま れ て い た バ イ オ パ ド レ ス の 実 測 値 か ら GC-US に 含 ま れ て い た バ イ オ パ ド レ ス の 実 測 値 を 差 し 引 い た 値 で あ り 、ISS 保 管 中 の 放 射 線 量 を 反 映 し て い る 。
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Fig. 4-3. 各 試 験 サ ン プ ル に 含 ま れ る LcS の 生 菌 数 推 移 。 青 ：FS、 オ レ ン ジ ：GC-US、 緑 ：GC-JP。 ド ッ ト は 平 均 値 、 エ ラ ー バ ー は 標 準 偏 差 を 示 す
（N = 3）。
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Fig. 4-4. 6 種 類 の プ ラ イ マ ー を 用 い た 各 試 験 サ ン プ ル の RAPD 解 析 に よ る バ ン ド パ タ ー ン の 写 真 。M： 分 子 量 マ ー カ ー 、1： 製 造 時 、2：FS、3： GC-US、4：GC-JP。
p1254 p1281 p1252
p1280 pRPIR pRPICGR
M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 M
M 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 M
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Fig. 4-5. 各 試 験 サ ン プ ル に 含 ま れ る LcS の Sequence variance 解 析 結 果 。A：
染 色 体 、B：プ ラ ス ミ ド pLY101、Baseline：製 造 時 。推 定 さ れ る コ ピ ー 数（3 コ ピ ー ） を 考 慮 し て 解 析 を 実 施 し た 。
Position in the chromosome
Variant frequency
A
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Fig. 4-5. （ 続 き ）
B
Variant frequency
Position in the plasmid (Kb)
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Fig. 4-6. 再 培 養 し た 試 験 サ ン プ ル 中 の LcS の 生 育 曲 線 （ 上 段 ） お よ び pH 変 化 （ 下 段 ）。N = 2 の 平 均 値 を 示 す 。
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Table 4-2. 各 試 験 サ ン プ ル 中 の LcS の 糖 資 化 性 評 価 結 果
+： 陽 性 、w： 偽 陽 性 、 空 欄 ： 陰 性 。
糖源 FS GC-US GC-JP
Glycerol Erythritol D-Arabinose L-Arabinose
Ribose + + +
D-Xylose L-Xylose
Adonitol + + +
β-Methyl-xyloside
Galactose + + +
D-Glucose + + +
D-Fructose + + +
D-Mannose + + +
L-Sorbose + + +
Rhamnose Dulcitol Inositol
Mannitol + + +
Sorbitol + + +
α-Methyl-D-mannoside
α-Methyl-D-glucoside + + + N-Acethyl-glucosamine + + +
Amygdaline + + +
Arbutine + + +
Esculin + + +
Salicin + + +
Cellobiose + + +
Maltose + + +
Lactose + + +
Melibiose
Saccharose + + +
Treharose + + +
Inulin Melezitose D-Raffinose Amidon Glycogen Xylitol
β-Gentiobiose + + +
D-Turanose + + +
D-Lyxose
D-Tagatose + + +
D-Fucose L-Fucose D-Arabitol L-Arabitol
Gluconate w w w
2-Keto-gluconate 5-Keto-gluconate
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Fig. 4-7. API 50 CH stripによる各試験サンプルに含まれるLcSの培養後の写真。
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Fig. 4-8. 各 試 験 サ ン プ ル に 含 ま れ る LcS の LcS 特 異 的 抗 体 反 応 後 の ヒ ス ト グ ラ ム 。 濃 い 灰 色 は 抗 体 と 結 合 し た LcS、 薄 い 灰 色 は 抗 体 と 結 合 し て い な い LcS を 示 す 。
FS GC-US GC-JP
蛍 光 強 度
細胞数
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Fig. 4-9. 細 胞 壁 溶 解 酵 素 に よ る 各 試 験 サ ン プ ル に 含 ま れ る LcS の 消 化 耐 性 解 析 結 果 。 バ ー は 平 均 値 、 エ ラ ー バ ー は 標 準 偏 差 を 示 す （N = 3）。
0 20 40 60 80 100
0 30 60 120
% (OD600)
時間 (min)
FS GC-US GC-JP
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Fig. 4-10. 試 験 サ ン プ ル 中 の LcS 刺 激 に よ る IL-12 産 生 誘 導 の 解 析 結 果 。 バ ー は 平 均 値 、 エ ラ ー バ ー は 標 準 偏 差 を 示 す （N = 3）。
0 5000 10000 15000
無添加 FS GC-US GC-JP
IL-12 (pg/mL)
20 µg/mL 60 µg/mL 200 µg/mL
LcS 含 有 粉 末 濃 度:
80