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列である 15bp の追加配列を含めた．また S．cerevisiae での発現に合わせてコドンの最適 化を行った．これらのcDNAフラグメントは，In-Fusion HDクローニングキット（タカラ バイオ株式会社，日本）を使用し，HindIIIによって線形化されたpGYRとライゲーション された．ヒトFMO遺伝子のGenBank情報を以下に示す．FMO1; NM_001282692，FMO2;
NM_001460，FMO3; NM_006894，FMO4; NM_002022，FMO5; NM_001461．
S. cerevisiae AH22（ATCC 38626）の形質転換は，以前に記載されているように酢酸リチ
ウム法を使用して実施した[23]．得られたクローンを，KOD FX Neo（東洋紡株式会社，日 本）を使用したダイレクトコロニーPCRによって確認した．
3.2.3 FMOを発現する組換え酵母の培養
組換え酵母の培養は，以前に記載されたように実施された[24]． FMO 形質転換体のグ リセロールストックをSD + Hisアガロースプレートに広げ，30°Cで2〜3日間プレインキ ュベートした． コロニーを採取した後，細胞を1 L SD + His培地で，200rpmで振とうし ながら30°Cで一晩培養した． 細胞を2.0〜2.5 OD660の細胞密度で回収し，続いて等量の 蒸留水に再懸濁した． 細胞は-80°Cで保存され，解凍後の生体触媒として使用された．
3.2.4 イムノブロッティングによる酵母細胞で発現したFMO酵素の分析
酵母での FMO 発言は，以前に記載されたようにウエスタンブロット法によって解析さ れた[23，24]． 酵母ペレットを0.5mg / mLザイモリアーゼ100Tで30℃，5分間処理した 後，10％アクリルアミドゲルを使用して SDS-PAGE を行いった． 得られたポリペプチド バンドをニトロセルロースメンブレンに転写し，メタノールで平衡化した後，10％ BSA でブロックした．
一次抗体およびAP結合二次抗体をTBSバッファーで希釈し，それぞれインキュベートし た（室温，1時間）．その後，アルカリホスファターゼ染色用のBCIP-NBT溶液キットを使 用して検出を行った．
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3.2.5 FMO発現酵母を用いたN-oxidesとS-oxidesの合成
FMO形質転換体の酵素活性は，典型的基質であるMTSとBZDを使用して評価した．反 応条件の最適化は，異なる反応パラメータを変化させて実施され，最適化された条件は以 下の通りであった． 湿酵母細胞を，8％（w/v）グルコースを含む100 mM KPiバッファー
（pH 8.3）に25％（w/v）の濃度で懸濁し，DMSO中の10mM基質を最終的に0.1mMの濃 度で細胞懸濁液に添加した．反応は振とうしながら 30℃で行った． インキュベーション 後，2.5 倍量のクロロホルム：メタノール（3：1，v/v）を反応液に添加した． 抽出物は，
遠心分離（12000×g，10分，室温）により，上部の水相と下部の有機相に分離された． 下 側の有機相をエバポレート後，HPLCおよびLC-MS / MS分析に使用する100μLの溶媒に 溶解させた．
3.2.6 HPLC によるFMO代謝物の分析
酵母細胞におけるMTSのS-酸化活性は，HPLC-UVシステム（構成：Waters 2695セパ レーションモジュール，Waters 2487デュアル吸光度UV検出器，Cosmosil 5C18-Ar-II column (5 μm, 4.6 × 150 mm; Waters, Milford, MA)）を使用して測定した．
溶出条件は，0.1％（v / v）ギ酸を含む水-アセトニトリルで，10％アセトニトリル（2
分），10〜80％アセトニトリル（8分），80％アセトニトリル（2分），および10％アセトニ トリル（3分）だった． 流量は1.0mL / min，カラム温度は40°C，注入量は10 μLに設定 した． MTSOの生成を波長254 nmで検出し，標準物質を使用して定量を行った．
3.2.7 LC-MS/MS によるFMO代謝物の分析
ベンジダミンのN-酸化活性は，Agilent 1200シリーズLCシステム（Agilent Technologies Inc.）とAPI 3200 QTRAP質量分析計（AB Sciex, Toronto, Canada）で構成されるLC-MS / MS システムを使用して分析した．カラムはCapcell Pak C18 UG120カラム（5μm，4.6×250 mm，
Shiseido，東京，日本）を使用した．溶出条件は，0.1％ギ酸を含む20％アセトニトリルの
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アイソクラティックで，流量は0.8 mL min，カラム温度は40℃，注入量は2 μLとした．．
MS分析は，マルチプルリアクションモニター（MRM）モードでの陽イオンモードスキ
ャンによるエレクトロスプレーイオン化（ESI）によって実行された． MRM トランジシ ョンは，BZDO（m/z 326→102），BZD（m/z 310→86），および内部標準としてミダゾラム
（m/z 326→291）のプリカーサーおよびプロダクトイオンペアに対応してそれぞれモニタ ーされた．BZDOを定量には，0.1〜30μMの濃度範囲で標準物質と内部標準物質のピーク 面積比を使用して検量線を作成した．
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