図 1-A : 各種乳がん細胞株における転写因子 E2F5 の発現量
図 1-B : 各種乳がん細胞株における p53 蛋白量の発現量
32
図 1-C : 各種乳がん細胞株における転写因子 E2F5 と
p53 蛋白量の発現量の関係
33
図 2 : 乳がん細胞株 MCF-7 における転写因子 E2F5 の
細胞内局在の結果
34
図 3 : 乳がん細胞株 MCF-7 における E2F5 siRNA 導入効果の検討
35
図 4 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞の細胞増殖能の
検討 (A : WST8 アッセイ , B : コロニー形成試験 )
36
図 5 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞の
細胞周期・死細胞の割合の解析
37
図 6 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞における
p53 およびその下流遺伝子 mRNA の発現解析
38
図 7 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞における
p53 およびその下流遺伝子の蛋白発現解析
39
図 8 : 転写因子 E2F5 と p53 蛋白質の結合状態の解析
( 免疫沈降試験 )
40
図 9 : p21
WAF1遺伝子プロモーターにおける転写因子 E2F5 の
結合状態の解析 ( クロマチン免疫沈降試験 )
41
図 10 : p21
WAF1遺伝子プロモーターにおける転写因子 E2F5
の結合状態の解析 ( クロマチン免疫沈降試験 )
42
図 11 : 乳がん細胞株 MDA-MB-231 における
E2F5 siRNA 導入効果の検討
43
図 12 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞の細胞増殖能の
検討 (A : WST8 アッセイ , B : コロニー形成試験 )
44
図 13 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞の
細胞周期・死細胞の割合の解析
45
図 14 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞における
p53 およびその下流遺伝子 mRNA の発現解析
46
図 15 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞における
p53 およびその下流遺伝子の蛋白発現解析
47
図 16 : p53 野生型と変異型の細胞における E2F5 シグナル伝達経路
48
【図説】
図 1-A: 各種乳がん細胞株における転写因子 E2F5 の発現量
Triple Negative タイプ である Hs578T と MDA-MB-231, HER2 陽性タイプで ある BT474 と SK-BR-3, Luminal A タイプである T47D, MCF-7 と MDA-MB-175Ⅶ の計 7 種類の乳がん細胞株における E2F5 の発現量を Real-time PCR により解析した.
図 1-B: 各種乳がん細胞株における p53 蛋白量の発現量
Triple Negative タイプ である Hs578T と MDA-MB-231, HER2 陽性タイプで ある BT474 と SK-BR-3, Luminal A タイプである T47D, MCF-7 と MDA-MB-175Ⅶ の計 7 種類の乳がん細胞株における p53 の発現量を Western blotting により定量した.
図 1-C: 各種乳がん細胞株における転写因子 E2F5 と p53 蛋白量の発現量の 関係
Triple Negative タイプ である Hs578T と MDA-MB-231, HER2 陽性タイプで ある BT474 と SK-BR-3, Luminal A タイプである T47D, MCF-7 と
MDA-MB-175Ⅶ の計 7 種類の乳がん細胞株における E2F5 と p53 蛋白量との相関を解
析した.
図 2 : 乳がん細胞株 MCF-7 における転写因子 E2F5 の細胞内局在の結果 蛍光免疫染色により, 細胞内における E2F5 の局在を, 核の位置は DAPI 染 色により確認した.
49
図 3 : 乳がん細胞株 MCF-7 における E2F5 siRNA 導入効果の検討
MCF-7 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 培養 48 時間後に RNA を回収して, E2F5 mRNA の発現量を Real-time PCR により定量した (**
p<0.01) (A). また, 蛋白レベルにおける E2F5 の発現は Western blotting で確認 した (B).
図 4 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞の細胞増殖能の検討 (WST8 アッセ イおよびコロニー形成試験)
MCF-7 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 4 日後の細胞生存 率を WST8 アッセイにより計測した (** p<0.01) (A). MCF-7 を 5x103 細胞/ml の低密度で 6well plate に播種し, E2F5 siRNA および Control siRNA を導入し た. 10 日後に固定・染色し, コロニー形成状態を観察した (B).
図 5 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞の細胞周期・死細胞の割合の解析 MCF-7 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 培養 4 日後に細胞 を回収して 70％ エタノールで固定した. その後 Propidium Iodide 染色を行い,
各細胞の DNA 含有量の分布を FACS にて解析した (A). そして各細胞の
DNA 含有量の分布の割合は, 縦棒グラフを用いて示した (* p<0.05, ** p<0.01) (B).
図 6 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞における p53 およびその下流遺伝
子のmRNA の発現解析
MCF-7 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 4 日後に RNA を 抽出した. Real-time PCR による解析を行った (** p<0.01).
50
図 7 : E2F5 の発現を抑制した MCF-7 細胞における p53 およびその下流遺伝 子の蛋白発現解析
MCF-7 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 4 日後に蛋白質を 抽出して Western blotting による解析を行った.
図 8 : 転写因子 E2F5 と p53 タンパク質の結合状態の解析 (免疫沈降試験)
MCF-7 細胞より抽出した蛋白質に抗E2F5抗体を加えて沈降させ, 沈降物を電
気泳動し, Western blotting 後に抗p53抗体の反応を行った.
図 9 : p21WAF1 遺伝子プロモーターにおける転写因子 E2F5 の結合状態の解析 (クロマチン免疫沈降試験)
クロマチン断片に抗 E2F5 抗体もしくはコントロール血清を投与し, 沈降物に 含まれる p21WAF1 プロモーター領域の DNA 断片の量を Real-time PCR にて検 討した. p21WAF1 遺伝子のプロモーターの異なった場所 2 か所に対するプライ マーを設計し (A), この 2 か所に対するプライマーを用いて解析を行った (B), (C).
図 10 : p21 WAF1 遺伝子プロモーターにおける転写因子 E2F5 の結合状態の解析 (クロマチン免疫沈降試験)
MCF-7 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 4 日後に各細胞よ りクロマチン断片を回収し, 抗p53抗体を用いた免疫沈降を行った. 沈降物に含 まれる p21WAF1 プロモーター領域の DNA 断片の量を p21WAF1 ChIP_1 (A) お よび p21WAF1 ChIP_2 (B) を用い, Real-time PCR にて検討した.
51
図 11 : 乳がん細胞株 MDA-MB-231 における E2F5 siRNA 導入効果の検討
MDA-MB-231 細胞における E2F5 の発現抑制を行うために, E2F5 siRNA もし
くは Control siRNA を導入した. 培養 48 時間後における E2F5 mRNA の発現 量を Real-time PCR により定量した (** p<0.01) (A). また同様にして, 蛋白レベ ルにおける E2F5 の発現は, Western blotting で確認した (B).
図 12 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞の細胞増殖能の検討 (WST-8 アッセイおよびコロニー形成試験)
MDA-MB-231 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 4 日後の細 胞生存率を WST8 アッセイにより計測した (** p<0.01) (A). MDA-MB-231 を 5x103 細胞/ml の低密度で 6well plate に播種し, E2F5 siRNA および Control
siRNA を導入した. 10 日後に固定・染色し, コロニー形成状態を観察した (B).
図 13 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞の細胞周期・死細胞の割合 の解析
MDA-MB-231 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 培養 4 日 後に細胞を回収して 70％ エタノールで固定後した. その後 Propidium Iodide 染色を行い, 各細胞の DNA 含有量の分布を FACS にて解析した (A). そし て各細胞の DNA含有量の分布の割合は, 縦棒グラフを用いて示した (* p<0.05) (B).
52
図 14 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞における p53 およびその下 流遺伝子 mRNA の発現解析
MDA-MB-231 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 4 日後に RNA を抽出した. Real-time PCR により解析した (* p<0.05).
図 15 : E2F5 の発現を抑制した MDA-MB-231 細胞における p53 およびその下 流遺伝子の蛋白発現解析
MDA-MB-231 に E2F5 siRNA もしくは Control siRNA を導入し, 4 日後に蛋 白質を抽出して Western blotting による解析を行った.
図 16 : p53 野生型と変異型の細胞における E2F5 に関連したシグナル伝達経路
これまでの実験結果から正確に言及できることに基づいて 図 16 を作成とし た.
53
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58
【研究業績目録】
稲垣 喜則
Ⅰ 発表
① 一般発表 21
② 特別発表 なし
Ⅱ 論文
① 原著論文 0 (共 0)
② 症例報告 0 (共 0)
③ 総説 なし
④ Letter 1 (共 1)
Ⅲ 著書 なし
59
Ⅰ 発表
① 一般発表
1. 稲垣喜則, 徳永智彦, 矢内充, 相馬正義. 当院における過去 5 年間の Stenotrophomonas maltophilia 菌血症の検討. 第 89 日本感染症学会総 会, 京都, 2015 年 4 月.
2. 稲垣喜則, 蓮見禎行, 佐野太一, 大木隆史, 高橋恵子, 小川克彦, 鈴木裕, 相馬正義, 亀井聡. 迅速な治療で良好な転帰を得た超高齢脳炎の 1 例.
第 618 回 日本内科学会関東支部関東地方会, 東京, 2015 年 9 月.
3. 徳永智彦, 稲垣喜則, 小長井誠, 矢内充, 相馬正義. 当院総合内科救急外 来における血清プロカルシトニンの測定状況の検討. 第 64 回 日本感 染症学会 東日本地方会学術集会, 北海道, 2015 年 10 月.
4. 稲垣喜則, 須崎愛, 相馬正義. MSSA 敗血症治療中に手指屈筋腱断裂を きたした 1 例. 第 64 回 日本感染症学会東日本地方学術集会, 北海道, 2015 年 10 月.
5. 佐野太一, 蓮見禎行, 稲垣喜則, 池島碧, 高橋恵子, 大木隆史, 小川克彦, 辻野一郎, 須崎愛, 鈴木裕, 矢吹美奈子, 上野高浩, 相馬正義. 抗凝固療 法中に発症したアレルギー性紫斑病の 1 例. 第 539 回 日本大学医学 会例会, 東京, 2016 年 11 月.
6. 稲垣喜則, 鈴木裕, 小川克彦, 徳永智彦, 亀井聡, 相馬正義. 超高齢発症 した単純ヘルペス脳炎. 第 29 回 日本老年医学会総会, 金沢, 2016 年 6 月.