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120  100 

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ON

N2

ω p、4 g 

。

Fig.3^・4^・4.DNA relatedness with strain Vibrio anguiJJarum VA‑04. 

加藤:浸漬ワクチンによる滑走細菌症の防除

3‑5 16S rDNA塩基配列の比較

DNA相向性の比較によって T.maritimumとして扱ってきた菌株群に2つの異なる種が 含まれることが明らかになったが，マダイ由来弱毒株の種としての位置づけは不明である。

そこで本節では強毒株 および弱毒株から 1株ずつ代表株を選出し， 168 rDNAの塩基配 列を解読した。

材料および方法

供 獄 菌 株

5‑1で用いた 20株の内，強毒株群から 8M2202s，弱毒株群から MK9035をそれぞれ代 表株として選出し 供試菌株とした。

16S rDNA塩基配列の解読

供試菌株の 168rDNAを常法に従い PCRによって増幅した。 PCRに用いたプライマー は以下の通りである。

27f‑A (E.coli  No.S... 27)  : AGAGTTTGATCATGGCTCAG  1492r‑T (E.coli  No.1513...1492): TACGGTTACCTTGTTACGACTT 

168 rDNA増幅後， CEQ8000 (Beckman Coulter)を用いて塩基配列を解読した。

データベースとの比較

解読した塩基配列を DDBJ(DNAData Bank of J apan)のデータベースと比較し，類似配 列を持つ菌種を選出した。

結果および考察

8M2202sで 444bp，MK9035で387bpの塩基配列が解読できた。8M2202sの塩基配列 は，

5'‑CGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGGGGTAACATTGTAGCTTGCTACAGATGACGACCGGCGCACGGGTGCGTAA  CGCGTAT‑AGAATCTGCCTTCTACAGAGGGATAGCCTTTAGAAATGAAGATTAATACCTCATAATACTTTGGAGTGGCAT  CGTTTTAAAGTTAAAGATTTATCGGTAGAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGGTAAGGTAACGGCTTACCATGG 

近大水研報 1 3号 (2013) 

CAACGATAGGTAGGGGTCCTGAGAGGGAGATCCCCCACACTGGTACTGAGACACGGACCAGA‑CTCCTACGGGAGGCAGC  AGTGAGGAATATTGGGCAATGGAGGCAACTCTGACCCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTAAACT  GCTTTTATACAGGAAGAAACGTACCTACGAGTAGGTATTTGACGGTACT‑3' 

であった。

また MK9035の塩基配列は

5'‑AACACATGCAAGTCGAGGGGTTAACAGGGAAAAGCTTGCTTTTTTGCTGACGACCGGCGAACGGGTGCGTAACGCGT  AT‑AGAATCTGCCTTGTACAGGAGGATAGCCTTTAGAAATGAAGATTAATACTCCATAATGTTGAGAGATGGCATCATCT  TTTAATTAAAGATTTATCGGTACAAGATGACTATGCGTCCTATTAGCTAGATGGTAAGGTAACGGCTTACCATGGCAACG  CATAGGTAGGGGGTCTGAGAGGATTATCCCCCACACTGGT‑ACTGAGACACGGACCAGA‑CTCCTACGGGAGGCAGCAGT  GAGGAATATTGGTCAATGGAGGCAACTCTGAACCAGCCATGCCGCGTGCAGGAAGACTGCCCTATGGGTTGTA‑3'  であった。

解読できた配列と， デ ー タ ベ ー ス 上 の Tenacibaculum属 の 既 知 の 全 種 の 配 列 デ ー タ を 用いて系統樹を作製した結果， SM2202sは T maritimumに 極 め て 高 い 相 向 性 が 確 認 さ れ た (Fig.3・5・1)。しかし MK9035は Tθnacihaculum属 細 菌 と 近 縁 で あ っ た も の の ， 同 種 と 考 え ら れ る 既 知 の 菌 種 は 認 め ら れ な か っ た 。 し た が っ て SM2202sは T maritimumで あることが再確認されたが， MK9035は Tθnacihaculum属の新種であると考えられる。

既知の Tenacihaculum属細菌全種の基準株を収集し， MK9035を 含 む マ ダ イ 由 来 弱 毒 株 群と詳細に比較することで，種レベノレでの分類学的位置を明らかにする必要がある。

加藤:浸漬ワクチンによる滑走細菌症の防除

T .   o v o l y t i c u s   EKD002

^T 

T .  a e s t u a r i i   SMK‑4

^T 

T .   skagerrakense  D30

^T 

T .  l u t i m a r i s  TF‑26

^T 

T .   amylolyticum  CIP 107214

^T 

T .  l i t o r e u m  CL‑TF13

^T 

MK9035 

T .  mesophilum  CIP 107215

^T 

SM2202s 

T .  maritimum R2

^T 

0.01 

Fig. 3‑5‑1. Evolutionary relationships in Tenacibaculum based on 168 rDNA  sequence. 

近大水研報 1 3号 (2013) 

総括

薬事法の改正によって海産魚の滑走細菌症に有効な薬浴剤は使用が制限されている。ま た安全性を求める消費者の声の高まりもあり，これまでの抗菌剤を中心とした治療から予 防への転換が養殖業に求められている。そのような中，薬剤の残留，耐性菌の問題のない 水産用ワクチンは近年重要性を増しつつあり，少しずつではあるがその種類を増やしてき ている。そこで本研究では海産魚の滑走細菌症の防除を目的として，原因菌 T.mari tim um  からワクチンを作製し，圏内では最も被害を受けているマダイおよびヒラメでその効果を 検討した。

まずワクチン研究の前段階として効率的で高い再現性のある人為感染法が必要であった ため，

BCG

接種用管室十を用いたスタンプ法と名付けた攻撃法を検討した。その結果，この 方法は水温や魚体サイズの影響を受けずに確実かつ高い再現性を持って感染を成立させら れることから，滑走細菌症の人為感染法として非常に有効であることが示された。今 後 滑 走細菌症のワクチンの実用化を進めるにあたって，本感染法は重要な手法の 1つになると 考えられる。

次に T.maritimumの基準株

R2

で作製したホルマリン不活化ワクチン

FKC‑R2

を用い てマダイの滑走細菌症の防除を試みた。浸漬法で行った一連の実験では，

FKC‑R2

接 種

1

週間後からその有効性が認められた。また 1週間後よりも 2週間後の方が 1回接種より も2回接種の方が滑走細菌症の防除に有効であった口以上のことから，滑走細菌症の浸漬 ワクチンが実用化することができれば，沖出し 1週間前に 2回以上免疫することで防除が 可能であると期待される。しかしながらヒラメを供試魚とした実験では，人為感染に用い た株がワクチンに用いた

R2

と異なっていたためか，十分な効果が得られなかった。その 結 果 を 受 け て 行 っ た

FKC‑GF

を用いた実験でもヒラメの滑走細菌症を防除することはで きなかった。その原因としてはヒラメ固有の免疫反応やワクチン投与法などが考えられる が，マダイとヒラメでは滑走細菌株に対する感受性が異なっていたことから，両魚種に対 する滑走細菌の病原因子が異なっている可能性もある。作製法や投与法の改善によって有 効なワクチンの開発を進める必要がある。

野外分離株についてマダイを用いて人為感染による毒性を比較したところ，ヒラメ由来 株だけでなく，マダイ由来株の中にも病原性の弱し1株 が 認 め ら れ た。分類学的に検討した 結 果³ マ ダ イ 由 来 の 弱 毒 株 は T.maritimum と は 別 種 で あ る こ と が 確 認 さ れ ，

Tenacibaculum属の新種であると推察された。弱毒株群は簡易同定では T.m aritim umと 混同される恐れがあり，効果的な滑走細菌症対策を進める上で障害となりうるD 今 後 マ ダ イ由来弱毒株 に つい て は よ り詳 細な分類学的検討を行う と 共に， 養 殖に与 え る影響 を 疫学

加藤:浸漬ワクチンによる滑走細菌症の防除

的に検討する必要がある。

以 上 述 べ た よ う に 滑 走 細 菌 症 の 防 除 を 目 的 と し て 研 究 を 進 め て き た。ワクチン実用化の た め に は 野 外 試 験 を 繰 り 返 し ， 効 果 が 認 め ら れ な け れ ば な ら な い が ， 近 畿 大 学 水 産 研 究 所 白 浜 実 験 場 沖 で 行 っ た 野 外 試 験 で は ， 試 験 期 間 中 の 滑 走 細 菌 症 の 病 勢 が 弱 か っ た た め ， 有 効 性 を 確 認 で き な か っ た。ま た 実 用 化 の た め に は ワ ク チ ン 有 効 性 の 持 続 期 間 が あ る 程 度 求 められる。マ ダ イ に お い て は 沖 出 し 後 か ら 水 温 の 上 昇 す る 初 夏 ま で の 1‑‑‑‑‑3ヶ月程度持続 するのが望ましい。こ の 間 の 水 温 と 持 続 期 間 の 関 係 は 詳 細 に 検 討 す る 必 要 が あ る。また養 殖 場 に よ っ て ， 株 の 相 違 が 考 え ら れ る こ と か ら ， 十 分 に 調 査 を 行 い ， ワ ク チ ン と し て 有 効 性 の 高 い 株 で ワ ク チ ン を 作 製 す る 必 要 が あ る。

上 記 の 様 な 課 題 は 残 さ れ て い る も の の ， マ ダ イ に 対 し て は 浸 漬 ワ ク チ ン 実 用 化 の 目 途 が ある程度立ったと思われる。既 に 本 ワ ク チ ン に つ い て は 特 許 を 出 願 し ， 製 薬 会 社 と 共 同 で 実 用 化 に 向 け て の 研 究 を 開 始 し て い るO 数 年 の 内 に は 製 品 化 し て マ ダ イ の 滑 走 細 菌 症 防 除 に役立てられると期待している。

近大水研報 1 3号 (2013) 

Summary 

The aim of this study is  to control gliding bacterial disease of marine fish. For this  purpose， the following experiments were performed. In the first part of this article， 

"stamp injection" using an injector designed for human BCG vaccination was examined  to establish highly‑reproducible and efficient challenge method with the pathogen that  was necessary to evaluate effect of vaccination. In the next part， formalin‑killed cells  (FKCs)  were  developed from the  pathogen T mari・timum， and their  efficacies  as  vaccines  were  examined in  red  sea  bream Pagrus major and J apanese  flounder  Paralichthys olivaceus. In the last  part， the  field  isolates  of Tenacibaculum from  diseased fish  were studied comparatively by experimental infection  and taxonomic  characterization. 

Part 1.  Development of artificial  infection method with an injector designed for human BCG  vaccination 

To establish highly‑reproducible and efficient challenge infection with T maritimum，  stamp injection method was evaluated in red sea bream (55.2g in mean body weight).  Stamp injection was performed using an injector， consisting of a hollow plastic cylinder  with nine needles， designed for  human BCG vaccination.  The body surface of the  experimental fish was pressed with the cylinder of which the tip of the needles had  been soaked in the cell suspension of R2， the type strain of T maritim um， for a few  seconds. Stamp injection with three bacterial concentrations and immersion challenge  (5.3 X 10⁸ CFU/mL， 20 min) were compared by cumulative mortality during 7 days after  challenge. Control fish were stamp injected with PBS. As a result， the mortality of fish  which received stamp injection with 4.0 x 10⁹CFU/mL， 2.0 x 10¹⁰ CFU/mL and 1.5 x 10¹¹  CFU/mL were 40， 100 and 100%， respectively.  But no fish was killed by immersion  challenge  and stamp injection  with  PBS.  Ulcerative  lesion  was observed  on the  stamped sites of all the dead fish， and T maritim um was recovered from the affected  areas of fish died on day 1 post infection. These results indicate that stamp injection  method can be utilized for artificial infection of T maritimum. 

Part 2.  Examinations of immersion‑vaccination  2‑1  Efficacies of FKC‑R2 

加藤;浸漬ワクチンによる滑走細菌症の防除

Experiment 1. Evaluation of the efficacy of FKC‑R2 in  red sea bream 

The efficacy of immersion‑vaccination of the formalin killed cells prepared from R2  (FKC‑R2) against gliding bacterial disease in red sea bream (1. 6g) was examined. 

FKC was prepared from bacterial cells grown on modified Cytophaga agar medium  containing  70%  sea  water  for  24h  at  25⁰C by inactivating  with 1.5% (v/v)  formalin‑PBS for 24h at 4⁰C. The experimental design was consisted of two groups. 

Each group had 60 fish， which were kept in 500‑L tanks. One group was vaccinated  with  FKC‑R2， while  the  other  group  received  no treatment.  Vaccination  was  performed by immersion in FKC‑R2 suspensions in seawater (20μg wet wt./mL) for  30 min.  Immersion challenge  (20  min) with R2 was performed one week after  vaccination. Thirty fish of each tank were challenged with 1.6 x 10⁷CFU/ml and the  others were done with 2.2 x 10⁷CFU/ml.  Relative percentage survival (RPS) was  calculated from cumulative mortality during 7 days after challenge. The survival  rates of both vaccinated groups were significantly higher than that of the control  (P<0.05). The RPS of  the  groups  challenged  with 1.6 x 10⁷CFU/ml and 2.2 x  10⁷CFU/ml were 64.3 and 83.3%， respectively. 

Experiment 2.  Time necessary for  development of effective  protective  immune response  after vaccination in  red sea bream 

A total of 200 fish (14.6g) were divided into 8 tanks， and allocated to 4 groups.  Each group had 50 fish， which were kept in  200‑L tanks.  Three groups  were  challenged with R2 (1.1x10⁸CFU/mL， 20 min) 3 days， 1 week， and 2 weeks after  vaccination， and the  other  group  was non‑vaccinated control.  Vaccination was  performed by immersion in FKC‑R2 suspensions in seawater (20μg wet wt./mL) for  30 min. RPS of the groups challenged after 3 days， 1 week and 2 weeks were 4.0，  56.0 and 76.0% respectively. Survival rates of 1 week and 2 weeks were significant  higher than that of control (P<0.05). 

Experiment 3.  Effects of booster vaccination in  red sea bream 

A twice‑vaccinated group was compared with once‑vaccinated groups and control.  A total of 120 fish (2.5g) were divided into 4 tanks， and allocated to 4 groups. Three  groups were challenged 1 week， 2 weeks， and both 1 and 2 weeks (twice) before 

近大水研報 1 3号 (2013) 

challenge  with  R2 (2.4^X10⁷CFU/mL， 20  min)， and  the  other  group  was  non‑vaccinated control. As a result， the survival rates of all the vaccinated groups  were significantly higher than that of the control (P<0.05)， and twice‑vaccinated  group showed the highest survival rate. 

Experiment 4.  Determination of the efficacy in  Japanese flounder 

The  efficacy  of  immersion‑vaccination  against  gliding  bacterial  disease  in  Japanese  flounder  (2.3g)  was  examined  in  the  same  way as  experiment  2.  Immersion  challenge  was  performed  with  the  strain  GF0609  isolated  from  Japanese flounder (4.5X10⁷CFU/mL). However， RP8 of the group challenged after 2  weeks was only 16.7%， and the others were 0%. 

Part 3.  Comparative study on the field isolates of the pathogens 

R2 and other 19 strains of gliding bacteria isolated from diseased fish were compared  for  their  pathogenicity by stamp challenge  method in red sea bream (57.0g).  Ten  strains among them were highly pathogenic， though the others showed 20% or less  mortalities. These two groups can be distinguished by sea water requirement， sodium  chloride requirement， growth temperature range and ability to use carbon sources. The  whole cell protein profile is different between low virulent strains and virulent strains.  In addition， DNA‑DNA hybridization with R2 showed more than 70% homology in  virulent strains but less than 52% in low virulent strains. DNA homology of the low  virulent strains to the strain MK9035， which was one of low virulent strain obtained  from red sea bream， were more than 70%. And 168 rDNA sequence of MK9035 was  similar to Tenacihaculum species but was different from all validated species. From  the above results， low virulent strain group is  presumed a new species. 

加藤:浸漬ワクチンによる滑走細菌症の防除

謝 辞

本研究を行うにあたり 近 畿 大 学 大 学 院 教 授 ・ 水 産 研 究 所 所 長 熊 井 英 水 先 生 ， お よ び 同 研 究 所 副 所 長 ・ 教 授 村田 修先生には終始ご指導とご鞭援を賜り また本論文のご高 閲を頂きました さ ら に 本 論 文 を 取 り ま と め る に あ た っ て ， 近 畿 大 学 大 学 院 教 授 太 田 博

巳 先 生 に は 終 始 貴 重 な ご 助 言 と ご 指 導 を 賜 り ま し た。厚 く 御 礼 申 し 上 げ ま す。

ま た 実 験 を 行 う に あ た っ て 近 畿 大 学 水 産 研 究 所 白 浜 実 験 場 石 丸 克 也 助 手 に は 懇 篤 な る ご指導を頂きました。ま た 同 水 産 研 究 所 の 教 職 員 ， な ら び に 近 畿 大 学 農 学 部 水 産 学 科 水 産 増 殖 学 研 究 室 の 学 生 各 位 に ご 協 力 い た だ き ま し た。ここに心から感謝の意を表します。

近大水研報 1 3号 (2013) 

文 献

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ドキュメント内 浸漬ワクチンによる滑走細菌症の防除に関する研究 (ページ 38-54)