。叩

+伺^」 U

UE

⁰²⁵

，G 。

H

U、」与^〉 A 〈^ta

0. 0

.1 1

Antibody conc.かg/ml)

山川JRU3，

:

・

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自国的。叩苫ωυ同伺』HO凶門戸〈

(C)

0.3

自 国

m

。 叩

-“ 何

�

^{0. 15}

A

5

L・4o dコm

〈 0.0

.1 1

Antibody conc.同/m1)

Fig. 3・2 Reactivities of IgM type monoclonaI antibodies to

MCF・7 (A)， HBC・4 (B) _and HBC・5 (C) _ceIIs. AA3，(・); 5CI0，(�);

lB10，(・); 4Dll，(+); human serum IgM，(O)

0. 0

Antibody conc.ほ/m1)

1

…( 43J阿国的

。 判

(【日\2.υロoυ身oA32

rl

ス・)J岡田ハ)

∞ω叩旬 。 sz z 符

同.一00.0

。 。

N ^rl

o 0

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(ω)

(OY025E』g

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同.

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同 。

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(向)

rl

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(〈)

第 4 節 考 察

ヒ ト

ー

ヒ

ト ハ イ

フ

リ

ド ー マ を 作 製 す る こ と

に よ り 乳 ガ ン 細 胞 株 と 特 異 的 に 反 応 す る ヒ ト

Mab (H15F2

^{K - 1 -}

5

_{A A}

3 5 C 1 0 、 1 B 1 0

) を 得 る ご と が で き た 。 ま た 、 乳 ガ ン 細 胞 株 と 強 く 反 応 し 、 イ也 の ガ ン 細 胞 株 と も 反 応 す る が 正 常 繊 維 芽 細 胞 と は 反 応 し な い ヒ ト Mab

(4Dll)

も 得 ら れ た 。 ま た 、 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 お よ び 種 々 の ガ ン 細 胞 株 と も 反 応 す る Ma b も 得 ら れ た 。 ご れ ら Ma b の 反 応 性 の パ タ ー ン は そ れ ぞ れ 異 な る ご と か ら そ れ ぞ れ 異 な る 抗 原 を 認 識 し て い る ご と が 示 唆 さ れ た

ご れ ま で 報 告 さ れ た 抗 原 特 異 的 ヒ ト Ma b の ほ と ん ど は 1 g M 型 で あ り 、 1 g G 型 の ヒ ト Ma b は ほ と ん ど 報 告 さ れ て い な い ( • 1 2 ) 。 メ ラ ノ

マ に 対 し て 反 応 す る ヒ ト ー マ ウ ス 抗 体 が 2 例

報告 さ れ て い る の み で あ る ( 1 2 . 3 B ) _。 今 回 初

め て 乳 ガ ン 細 胞 株 と 反 応 し 正 常 繊 維 芽 細 胞 と は 反 応 し な い 1 g G 型 の ヒ ト Ma b が 得 ら れ た

?タ の ^{しー ヲー'} と ^{jま 、} 手し ガ ン 患 者 の ン ノて 1求 ^Lま 抗 原

」

特 異 的 ^{1 g G を 生 産 し て い る も の} が 存 在 し ^、 親

細 胞 株 H ^{0 -323あ} る い ^{lま A 4}

H ^{1 2}

_{と 融 合} す れ ば そ の 抗 原 特 異 的 ^{1 g G} を 生 産 す る ノ\ イ ブ ^{ド 一 マ} を 作 製 ^で き る と い つ ^{t、、ーーョ・-} と を ^刀三 し て る ^。 特

A 4

H ^{1 2}

を 親 細 胞 と し て 用 い ^た I蕩 ^{メ口入 、 1 g G} _{を 生}

産 す ^る

^}\

^{イ ブ ド 一 マ の} 比 率 ^{カ三 日E コ1 し\ ( 7 ) し、 ョー， と}

か ら

1

g G 型 の ^{M a b} を 作 製 す る の 有 利 ^{で あ} る

と 考 ^{え ら れ る 。}

第 5 節 小 括

乳 ガ ^{ン 患 者} 胞 株 H ^{0 - 3 2 3 、} る ^」、ヲ' と よ り

ド ^{一 マ} を 作 製

の あ

、

し ン 細 胞 株 M ^{C F - 7}

る ヒ た と

ン パ 節 ^ン パ 球 と ヒ ト 親 細

い lま A 4 H 1 2 と を 細 胞 融 合 す

ト

M

^{a b} を 生 産 す る ^}\ イ ^フ

。 多 数 ^の

M

^{a b} の 中 か ら 手し ガ

反 応 す る も の を 選 択 し ^、 さ ら に 他 の ガ、 ^ン 細 胞 株 ^、 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 と の

反応 性 を 5周 ^{ベ た 。} そ の 結 果 ^、 乳 ガ ^ン 細 胞 特 異 的 M ^{a b} を 数 種 得 る ^{し‘ ヲ，ー} と に 成 功 し た ^。 ま た ^{、 t、」ョ，ー} れ ま で に ほ と ん ど 報 告 ^さ れ て い な い ^{1 g G} 型 の

M C F - 7 細 胞 ^と 反 応 す る

M

^{a b} を 作 製 す る ^{L ー} と 均三

で き た ^。

第 ₄ 章 乳 ガ ン に 対 し て 作 製 さ れ た ヒ ト

モ ノ ク ロ

ー

ナ ル 抗 体 の 認 識 す る

抗 原 の 検 索

第 1 節 緒 日

ご れ ま で に ガ ン 細 胞 に 対 す る M a b の 作 製

に よ っ て 多 く の ガ ン 関 連 抗 原 が 同 定 さ れ て い る (Table

4-1)

^{( 8 - 5 3 )}

_。

_{ご れ ら の 抗 原 の う ち}

ガ ン の 診 断 に 役 に 立 つ 生 体 物 質 は 腫 蕩 マ ー

カ ー と 総 称 さ れ る ^{( 2 )}

。

ガ ン に 対 し て 作 製 さ

れ た M a b が ど の よ う な 抗 原 を 認 識 し て い る の

か を 明 ら か に す る ご と は そ の 抗 原 の 腫 蕩 マ

ー カ ー と し て の 意 義 や

ガ ン 細 胞 の 生 化 学 的

特 性 を 調 べ る 上 で 重 要 で あ る 。 こ の ご と か ら

第 3 章 で 特 異 性 が 明 ら か に な っ た ヒ ト M a b の

抗 原 を 同 定 し そ の 性 質 を 調 べ る ご と は 、 ガ ン

細胞 の 特 性 を 分 子 レ ベ ル で 解 明 し 、 さ ら に 新

し い 腫 蕩 マ ー カ ー を 発 見 す る 可 能 性 も あ る ご

と で 意 義 深 い と 考 え ら れ る

そ ^{し、 ラ，ー} で し- ヲー' の ^{与コ土主己 で lま}

^、

作 製 ^{し た ヒ ト}

^M

^{a b} の ^つ

ち 4011と

5

_H

1 1に

つ い て

、

そ の ^{三己刃心 三員位以} す る 抗 原 ^を

種 ^々 の 細 胞 株 か ら 抽 出 ^し

^、

分 子 量

^、

^局 在 部 位 お よ び ^{二L ピ ト 一 フ} お しす る 糖 鎖 の 介 在 性 ^つ

い て 検 討 ^{し た 。}

第 2 節 実 験 材 料 お よ び 方 法

第 1 項 抗 体 お よ び 試 薬 の 調 製

M ^a

b は 、 105

c e 1

1

s

/ m 1の ハ イ ブ リ ド ー マ を

1 0完 F C

S 添 加 E

R D F

t-音I也 で 、 3

7

oc 、 5 完 C

0

2/9 5 完

a i

r の 条 件 で 4 日 間 培 養 し た 上 清 を 用 い た

抗 体 濃 度 は 1 % B S A

/

P B S で l μ g

/ m 1に

希 釈 し て

使用 し た

SDS-PAGE用 x 2 サ ン プ ル バ ッ フ ァ ー

o

. ^{5 M}

^{T r i s}

-

^{H C 1}

(

^{p H 6}

.

⁸

⁾

1

0完 S D

S ( S

_{i g}

m

a

)

2

-メルカプトエタノール

(和 光 純 薬 、 生 化 学 用)

o

. ^{2 5 m 1}

o

. ^{4 m 1}

o

. ^{1 m}

¹

以 上

た 後

に 使

グリセロール

o .

3

1先7ロモフェ/ール7ル- /メタノール

適 量

を よ く ^{{こ比目 A 口} し ^、 細 胞 破 石平 _{f佼 と} 等

、 沸 騰 水 浴 中 で 3 分 問 力日 ^執 _{し て}

用 _し た 。

m

1

主

E三E^L ii日7乞 ^メ口入 _し

S 0 S

- P

A G E

基質 溶 f佼

o . 0 5 %

3

.

3 - 0 i _{a m} i

n

0 b _e

n

z i d i

n

e ^，

t _e t _{r a} h _y d _{r 0 C} h 1 _{0 r} i d _e (同 人 イヒ ^{ρ弓ム乙ら} _と

o . 01%

H ₂ 0 2 を ^ノ白弘、 む

5 0

_m

M

T _r i _s

- H

C

1 ( p H

緩 _衝 f佼

使用 直 月IJ lて 調 製 し た _。

第 2 項 細 胞 破 砕 液 の 調 製

各 種 _ガ ン 細 胞 株 お よ び 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 を

1 0完F C S 添 加 E R 0 F 培 地 を 用 ^い 、 3

7

oc 、

5 %

C 0

2/9 5

先 _{a 1 r} で 培 養 _し た _。 細 胞 を セ jレ ス ク ^レ イ パ

F _a

1

_{C 0 n社} で か き 集 め 、 冷 P B S で 3 回 洗 浄

し た _。 洗 浄 _し た 細 胞 を 、

o . 1 M

K C 1含 有 o . 1 Mリ

ン 酸 緩 衝 液

(pH7 . 4)

中 _{に 懸 濁 し} 、

4

^。C で 晩

撹梓 _し た _。 ^{t‘』・ョ，ー，} れ を

P

B S 対 _し て

4

^。C で _日 透

析 _{し た 。 L、ョ.，. つ し} て 得 ら れ た 細 胞 破 砕 液 ^{を 、} _清

水 ら に よ る 細 胞 分 画 法 ( 5 4 ) に 従 い 可 溶 性 画 分 細 胞 質 画 分 と 不 溶 性 画 分 ( 細 胞 膜 画 分 と に 分 画 し た 。 不 溶 性 画 分 は 1 % S D S に 懸 濁 し 溶解 さ せ 乙 れ を 細 胞 膜 画 分 と し た

第 3 項 プ ロ ッ テ ィ ン グ お よ び イ ム ノ ス テ イ ニ ン グ

第

²

^{頂 で} の S D S ボ

PAGE)

^{( 5 5 )} を ト フ ン ス

5周

ー7

を

フ

製 し た 細 ク jレ ^ーノーァ

行 な ^{い 、}

ア ^一 フ ロ

を 用 ^、

B i

⁰ R a

d

社 ^の

一 ト ロ セ jレ ロ ^一 ス 日莫

一

ン グ J

。

次 日莫 を 各 ^{レ 一} ン ^{し、ヲ'ー、} ク ^{エ 一} ス 大 日 本 製 薬

る は ^、

^{4 。C}

で 晩 保

ツ キ ン グ を 行 な ^つ た

。

o ^.

0

5完 Tw e e n20?:恭 _力日

胞 質 画 分 と 細 胞 膜 画 分

司、、、、.

ド ^{ξR静Z ヌ�}五 泳 動

S D S

-、、

分 自住 さ れ た タ ン ^ノて ク 質

ツ ト ^{ヨ�土史 El旦E}

( B i

^{0 R a} d社

推 奨 す る 方 法 lこ 従 ^{つ て} 転 写 し た フ ロ ツ ア イ

と 切 り 取 り ^{フ ロ ツ}

で ^{ヨ二士三三 ζE日E} で 時 間 あ

二一E回^E す る ^{し-ヲ' ー} と よ り ^{フ ロ}

フ ロ ツ キ ン グ し た 1莫 は

P B S (TPBS)

で 洗 浄 し

μ g

/

_m 1の ^{M a b} と

1

時 間 反 応 さ せ た ^{。 T P B} Sで

1 0分 間 ^{3 回} 洗 浄 後 ^{フ ロ ツ ク コ二 一 ス} で ¹

000

倍 に 希 釈 し た ^{^' jレ オ キ ン ダ 一 ゼ} 標 識 抗 ^{ヒ ト}

1 g M ま た は ^{1 g G}

(

T A G 0 ネ土 と 室 温 で 時 間 反 応

さ せ た ^{。 T P B} Sで ¹ 0分 間 ^{、 3 回} 洗 浄 し た f麦 ^、

基質 溶 ^f佼

?� ζ .

し て 染 色 し た イ ^{ム ノ ス ア イ 一一} ン グ _j 。

第 4 項 抗 原 の 過 ヨ ウ 素 酸 処 理

抗 原 の 過 ヨ ウ 素 酸 処 理 は ^{W 0 0 d w a r dら ( 5 6} ) の 方法 従 ^{つ て} 行 な ^つ た ^。 す な わ ち ^、 第

³

項 の 方法 で ^{フ ロ 1ツ ア イ ン} グ し た 日莫 を ^{、 5}

0

^{m M} 過 ヨ

ウ 素 酸 和 光 純 薬 合 有 ⁵

0

^{m M} 酢 酸 緩 衝 液

( p

H 4 . 5 で ¹ 時 間 室 温 で 反 応 さ せ た ^。 日莫 を

P B

S

で 洗 浄 後 ^{、 5}

0

^{m M NaBH 4} (和 光 純 薬 合 有

P B

S

で 時 間 室 温 で 反 応 さ せ た ^{。 P B}

S

で 洗 浄

し た 後 第

³

項 の 方 法 で イ ^{ム ノ ス ア イ 一一 ン グ}

す る t、』ヲー， と よ り 抗 原 を 検 出 し た ^。

第 3 節 ^{結 果}

第 l 項

^{M a}

^{b 4 D}

^{1 1の 認 識 す る 抗 原 の 検 索}

実 験 結 果 を ^T

a

b 1 e 4 ^- 2 ま と め て 刀ミ し た ^。

乳 ガ ^{ン 細 胞 株 M C F - 7 を 細 胞 質 と} 細 胞 膜 画 分 に 分 画 ^し た f灸 ^{、 フ ロ ツ ア イ ン グ お よ び イ ム ノ}

ス テ イ ^一一 _ン グ し

M a

b 4 D 1 1の 認 識 す る 抗 原 を

検出 し た ^。

^{M a}

^{b 4 D 1 1は} 分 子 量 約 ^{3 5 k D aの 抗 原}

を 認 識 ^し た ^{。 しーヲー'} の 抗 原 は 細 胞 質 画 分 検 出 さ れ た 均三

、

細 胞 膜 画 分 は 検 出 さ れ な か ^つ た ^。

肺 ガ ^ン 細 胞 株 A

⁵

⁴

^{9 に}

^{つ い} て も 同 様 の 試 験 を

し た ^{。 そ} の 結 果 ^、

M a

^{b 4 D} 1 1 は 細 胞 質 画 分 中 の

分 子 量 約

^{5 5}

^{k D aと 8 0 k D aの 2} 種 類 ^{の 抗 原} を 認 識 し た ^{。 にヨ?ー} れ ら の 抗 原 は 細 胞 膜 画 分 中 ^lこ は 検 出 さ れ な か ^つ た ^。

さ ら ^、 肺 ガ ^ン 細 胞 株 p ^{C -}

^{9 、}

^E同日 ガ ^ン 細 胞 株

M K N ^- 4 5お よ び 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 F ^{1 0 W 2 000}

つ い て 同 様 の 試 験 を ^し た 結 果 細 胞 質 画 分 ^に

も 細 胞 膜 画 分 ^も 抗 原 は 検 出 さ れ な か ^{つ た 。}

第 2 項

M a

b 4 D

1 1の 認 識 す る 抗 原 の 過 ヨ ウ 素

酸 処 理

乳 ガ ン 細 胞 株 M ^{C F - 7} の 細 胞 質 画 分 に 検 出 さ

れ た M a ^{b 4 D} 1 1の 認 識 す る 抗 原 を 過 ヨ ウ 素 酸 処

理 し 糖 鎖 の 開 裂 反 応 を 行 な ^つ た ^。 そ の 結 果

抗体 の 反 応 性 は 消 失 し た ^。 ま た ^、 肺 ガ ン 細 胞

株A 5 4 9の 細 胞 質 画 分 中 に 検 出 さ れ た ² 種 類 の

抗原 に 対 し て も 同 様 の 試 験 を し た 結 果 ど ち ら の 抗 原 の 反 応 性 も 変 化 は な か ^マコ た ^。

第 3 項

乳 ガ ン に 分 画 し ス テ イ ^一一

検出 し た を 認 識 し れ た が ^、

M a

^b 5 H

1 1の 認 識 す る 抗 原 の 検 索

細 胞 株 M ^{C F - 7} を 細 胞 質 ^と 細 胞 膜 画 分

た 後 ^{、 フ ロ ツ ア イ} ン グ お よ び イ ^{ム ノ}

ン グ し

M a

^{b 5 H} 1 1の 認 識 す る 抗 原 を

。

M a

^{b 5 H} 1 1は 分 子 量 約 ^{3 8 k D} aの 抗 原

た ^{。 し-ヲー'} の 抗 原 は 細 胞 質 函 分 に 検 出 さ 細 胞 膜 画 分 は 検 出 さ れ な か ^つ た ^。

肺 ガ ン 細 胞 株 A ^{5 4 9に --コ} い て も 同 様 の 試 験 を し た 。 そ の 結 果

M a

^b

⁵

^H

1 1 ^は

細 胞 膜 函 分 中 の

分子 量 約

^{8 4 k D}

aの 抗 原 を 認 識 し ^{た 。 し‘ヨ' ー} の 抗 原 は 細 胞 質 画 分 中 ^{lこ Lま} 検 出 さ ^{れ な か つ た 。}

E同E ガ ン 細 胞 株 M ^{K N - 4 5に つ} い て も 同 様 の 試 験

を し た 結 果 ^、 細 胞 膜 画 分 に 分 子 量 約

3 ^{6 k D}

aと

3 9

k D a

の

細胞 質 中 た

さ ら 細胞 株

し た 結 果 原 は 検 出

第 4 頂

2 種 類 の 抗 原 が 検 出 さ ^{れ た 。} 方

は ^{し-ヲ' ー} れ ら の 抗 原 ^は 検 出 さ ^{れ な か つ}

1市 ガ ン 細 胞 株 p ^{C - 9お よ} び 正 常 繊 維 芽

F 1 _{0 W} 200 0 _つ い て も 同 様 の 試 験 を

、 細 胞 質 画 分 も 細 胞 膜 画 分 も 抗

さ ^{れ な か つ た 。}

M a

^b

⁵

^H

1 1の 認 識 す る 抗 原 の 過 ヨ ウ 素

酸 処 理

乳 ガ ン 細 胞 株 M ^{C F -}

_{7 の 細 胞 質 画 分 に 検 出 さ}

れ た M

a

^b

⁵

^H

1 1の 認 識 す る 分 子 量 約 3 ^{8 k D} aの 抗

原を 過 ヨ ウ 素 酸 処 理 し 糖 鎖 の 関 裂 反 応 を 行 な

っ た そ の 結 果 抗 体 の 反 応 性 は 消 失 し た ま た ^、 肺 ガ ^ン 細 胞 株 A 5 ⁴ 9 の 細 胞 膜 画 分 中 に 検 出 さ れ た 抗 原 に 対 し て も 同 様 の 試 験 を し た 結

果 抗 原 の 反 応 性 は 消 失 ^し た ^。 さ ら ^、 胃 ガ

ン 細 胞 株 M ^{K N - 4} 5 の 細 胞 膜 中 に 検 出 さ れ た ^つ

の 抗 原 に 対 し て も 同 様 の 試 験 を ^し た ^。 そ の 結 果 ど ち ら の 抗 原 の 反 応 性 に ^も 変 化 は 見 ら れ な か っ た ^。

念

Table 4・1 List of monoclonal antibodies against a human tumor associated antigen

Mab

OFA-l

Type

Human IgM **

HMFG-2 Mouse IgGl 10-3D2 Mouse

F36/22 Mouse IgG3 323A/3 Mouse IgGl Wl Mouse IgGl

b-8

b帽12

Mouse IgGl b-15

H23 Mouse IgGl DF・3 Mouse 7DI0 Mouse IgGl PR・2 Mouse IgGl

MAC40/43 Human IgM

Antigen

M.'布.

*

GMz ( Glycolypid) Milk fat globul >400kDa Posphoglycolipid 126kDa

DCA(島'1ucin like)

Gp**** 43 k，70 kDa Mucin like >200 kDa

Mucin like 350 kDa

Gp 68kDa

Gp 300-450 kDa

Gp 76 kDa

Gp 470 kDa(native) 44 kDa(subunit)

Gp

₄

7 k

Da

Epitope Main reactive cancer Ref.

Sugar Breast 13

Sugar Breast

14

*** Breast 15

Breast 16

Peptide Breast 17

Sugar Breast 18

Sugar

Peptid Breast 19

Sugar

Breast 20

Peptide Breast，Ovarian 21，22，23

Breast 24

Sugar Prostate，Breast 25，26

Sugar

Breast

₁₁

寸 ム

Table 4-1 continued

Mab Type Antigen 民生、有r.

@ @@

COL-Mabs Mouse IgGl CEA(Gp) 180 kDa NS19-9 Mouse IgGl CA19・9 (Gp) 210 kDa

sialylated lacto・N-fucopentaose SC-1

2F9 56/16

AF10 Mab 8 九1ab15 43圃9F

HB4C5 LA恥'12 LAM8 SWA20

Hetero IgM @@@

@@@@

Hetero IgM Hetero IgM @@@

Mouse IgGl

Mouse IgG3 Mouse IgGl MouselgM HumanlgM 民生ouse IgM Mouse IgG2a

50kDa

Gp >200 kDa

38kDa Gp 100圃150kDa

Gp 48kDa

45 k，85 kDa

Mucin like 50 k-200 kDa Cp，Cytc，His #

Gp 100 k・120k，200 kDa 90 k・135k，200 kDa Gp 40 k，100 k，180 kDa

Epitope Main reactive cancer Ref.

Stomach 27

Sugar Gastro in testinal 28

Stomach 29

Gastro in testinal，

Sugar

Lung adenocarcinoma 30

Stomach 31

Peptide Lung 32

Sugar

Lung 33

Peptide

Sugar Squamouse lung 34，35 Peptide Lung adenocarci noma 5，8，9，10 Sugar SmaIl cell lung 36

Small cell lung 37

Table 4-1 continued

Mab Type Antigen M.W. Epitope Main reactive cancer Ref.

LS62，76， Mouse IgG2a

159 Gp 29 k-70 kDa Peptide Melanoma 38

LSI13，140， Mouse IgGl 152

DS九1-1 Heter"ö IgG ^## Gp 60 kDa Peptide Melanoma 39

お F19 Mouse IgG2a 95 k，120 kDa

G171 Mouse IgG2a Gp 75 kDa Sarcoma 40

S5 Mouse IgG2a 120 kDa

TM九1R-2 Mouse IgGl 26 kDa Osteosarcoma 41

OC125 Mouse IgG Gp 200 kDa Peptide Ovarian 42 恥IA54 MouselgM CA54(Mucin like)

Ovarian 43

MC61 九10use IgM CA61(Mucin like)

DU-PAN-2恥louse IgM Mucin like Sugar Pancriatic 44 SPan-l

Mouselg九f Mucin like Sugar Pancriatic 45

YPan・1

九1344 Mouse IgGl 63 k，300 kDa Peptide Bladder 46

89E5 Mouse IgGl

45 k，53 kDa

(PAl) _(Hetero IgM) #付 Epitherial 47

ドキュメント内 ヒト乳ガン・胃ガン細胞特異的ヒトモノクローナル 抗体の作製 (ページ 42-65)