ヒト乳ガン・胃ガン細胞特異的ヒトモノクローナル 抗体の作製

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

ヒト乳ガン・胃ガン細胞特異的ヒトモノクローナル 抗体の作製

秋山, 浩一

https://doi.org/10.11501/3098986

出版情報：Kyushu University, 1994, 博士（農学）, 論文博士 バージョン：

権利関係：

的川制衣 回共 此汁 仲仔μ 爪W，

附胞比体 制相村山

VJ 1N J川パ 1ず/

回円 一

・ 門u h/〆 ム什/〆

刊明υパ l//

引仇 ずずし

‘Ih- -hi レ-u lru

フFメく しLr ャ告

1 9 9 4-

目次

第1章 序論

第2章 乳カ、、 ン細胞特異的ヒ トモノク ロ ー ナル抗体

生産性ヒ ト ー ヒ トハイブリド ー マの作製 ⁵

第l節 緒言

第2節 実験材料および方法 第l項 試薬の調製

第2項 細胞の培養

第3項 リ ン パ球の分離

第4項 ハイブリド ー マの作製 第5項 スクリ ニ ン グ

第6項 ク ロ ー ニ ン グ 第3節 結果

第l項 融合効率

第2項 スクリ ニ ン グ 第4節 考察

第3章 乳ガ ン細胞に対し て作製された ヒ トモノク ロ

6 6

1

1

1

1 4

1

ー ナル抗体の細胞株に対する反応性の検討 ^{2 3}

第1節 緒言 2 3

第2節 実験材料および方法 2 3

第l項 試薬の調製 第2項 実験方法 第3節 結果

第4節 考察 第5節 小括

内、U Fhd phU A斗孟 戸hu nJω q/u q/ω η、u η、U

第4章 乳ガ ン に対し て作製されたヒ トモノク ロ ー

ナル抗体の認識する抗原の検索 ^{3 7}

第1節 緒言

第2節 実験材料および方法

第1項 抗体および試薬の調製 第2項 細胞破砕液の調製

第3項 プロ ッ テ ィ ン グおよび イ ム ノ ステイニ ン グ 第4項 抗原の過 ヨ ウ素酸処理 第3節 結果

円Ie nku nハu n川u nHU 円六u n弓U 町、u nぺU A斗A

第1項 第2項

Mab 4Dllの認識する抗原の検索

Mab 4Dllの認識する抗原の

過 ヨ ウ素酸処理

第3項 ^Mab 5Hllの認識する抗原の検索

1lA 円/臼 内/ω 且U1 Aq A性

4

4

第4項 ^Mab 5Hllの認識する抗原の 過 ヨ ウ素酸処理

第4節 考察 第5節 小括

』斗A

・1i λ“A A斗A

「円U

「hd

第5章 ヒ トモノク ロ

ー

認識される乳ガ ン関連抗原の分離精製 ^{5 6}

第l節 緒言 ^{5 6}

第2節 実験材料および方法 ^{5 7}

第1項 試薬の調製 ^{5 7}

第2項 抗原の抽出 ^{5 8}

第3項 カ ラムク ロ マトクラ フ ィ - ⁵⁹

第4項 抗原の検出 ^{6 0}

第5項

SDS-PAGE、 プロ ッ テ ィ ングおよび

第6項 電気溶出に よる抗原の精製 第3節 結果

第l項 カ ラムク ロ マトグラ フ ィ ー 第2項 フ ロ ッ テ ィ ングおよび

イムノ ステイニ ング

6 1 6

2

6 3 6 3

6 4

第3項 電気溶出

第4項 抗原の過 ヨ ウ素酸処理 第4節 考察

第5節 小括

A斗ム

「円u n/M S斗EA RU Fhu ワi

74

第6章 胃ガ ン 細胞特異的ヒ トモノク ロ ー ナル抗体

生産性ヒ ト ー ヒ ト ハイブリド ー マの作製 ^{7 5}

第1節 緒言 ^{7 5}

第2節 実験材料および方法 ^{7 6}

第i項 試薬の調製 ^{7 6}

第2項 細胞の調製 ^{7 6}

第3項、 ハイブリド ー マの作製 ^{7 7} 第4項 スクリ ニ ン グおよびク ロ ニ ン グ ^{7 8}

第3節 結果および考察 ^{7 8}

第7章 胃ガ ン細胞に対し て作製された ヒ トモノク ロ

ー ナル抗体の細胞株に対する反応性の検討 ^{8 4}

第1節 緒言

第2節 実験材料および方法 第1項 試薬の調製

第2項 実験方法 第3節 結果

第4節 考察 第5節 小括

第8章 胃ガ ン細胞特異的ヒ トモノク ロ ー ナル抗体の 認識する抗原の検索

第l節 緒言

第2節 実験材料および方法 第l項 試薬の調製

第2項 細胞抽出液の調製

8 4

8 4 8 4

8 5

8 6

9 5

9 7

9 8

9 8

9 9

9 9

9 9

第3項 抗原の検出

第4項 抗原の過 ヨ ウ素酸処理 第3節 結果

第1項

Mab EMK-F7の認識する抗原の検索

Mab EMK-F7の認識する抗原の

過ヨ ウ素酸処理

第3項 Mab KMK-41の認識する抗原の検索 第4項 Mab KMK-41の認識する抗原の

過 ヨ ウ素酸処理

第5項

Mab 6-3C8

過ヨウ素酸処理

第4節 考察 第5節 小括

第9章 ヌ ー ドマウス移植ヒ ト胃ガン細胞株に対する モ ノ ク ロ ー ナル抗体6 - 3 C 8 の反応性

100 101 101 101

102 103

103

104 108 110

112

第1節 緒言

112

第2節 実験材料および方法 113

第1項 試薬の調製 113

第2項 ヌ ー ドマウスへのガン細胞株の移植 115

第3項 免疫組織化学染色 116

第4項 組織切片の過ヨ ウ素酸処理および

各種酵素処理

119

第5項 デ ィ ッ シ ュ培養したTMK-l 細胞の免疫染色 120

第3節 結果

120

第4節 考察

133

第5節 小括

135

第1 0章 ヒ ト ー ヒ トハイブリド ー マの無血清培養 136

第1節 緒言

136

第2節 実験材料および方法

137

第l項 試薬の調製

137

第2項 実験方法

138

第3節 結果

139

第4節 考察

146

第5節 小括

147

第1 1章 ヒ トモノク ロ ー ナル抗体の分離精製 148

第l節 緒言

148

第2節 実験材料および方法 149

第1項 器具および試薬 149

第2項 実験方法 150

第3節 結果 第4節 考察 第5節 小括

第1 2章 総括

謝辞

引用文献

151 160 161

162

168

169

第 1 章 序 論

K

Ö

イ ブ リ ド ー マ 技 術 は 存 在 す る ほ と ん ど す べ

て の 抗 原 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 ( M _a b )

の 作 製 を 可 能 と し た 。 M_a b を 作 製 す る ご と に

よ っ て 様 々 な 抗 原 の 検 出 や 同 定 、 精 製 な ど を

容 易 に 行 な う ご と が で き る よ う に な っ た

さ ら に M _a b は 、 ガ ン の 研 究 に も 用 い ら れ

ガ ン 細 胞 の 持 つ 抗 原 を 分 子 レ ベ ル で 解 析 す る

ご と に 用 い ら れ た 。 ご れ ま で に 数 多 く の マ ウ

ス M_a b が 作 製 さ れ 、 多 く の ガ ン 関 連 抗 原 、 す

な わ ち 、 正 常 細 胞 に お い て 生 産 さ れ な い か

ま た は そ の 生 産 量 が ガ ン 細 胞 に お い て 多 量 で

あ る 物 質 が 同 定 さ れ て い る 。 い く つ か の ガ ン

関 連 抗 原 で は 、 ガ ン の 診 断 に お い て 有 効 性 が

不 さ れ て い る ( _{2 )}

。

マ ウ ス に ヒ ト ガ ン 細 胞 を 免 疫 す る こ と で 作

製 さ れ る M_a b は 、 マ ウ ス の 免 疫 反 応 に よ る も

の で あ る 。 ご れ に 対 し ヒ ト リ ン パ 球 を 用 い た

ヒ ト M ^a b は 、 ガ ン に 対 す る ヒ ト の 免 疫 反 応 を 見 る ご と で も あ り マ ウ ス で は 作 製 で き な か っ た 新 し い 抗 原 に 対 す る M ^a b が 作 製 さ れ る 可 能 性 が あ る ご と で も 意 義 が あ る も の と 考 え ら れ る

ま た 、 M ^a b の ガ ン の 治 療 へ の 応 用 が 試 み ら れ て い る 。 す な わ ち 、 ガ ン 細 胞 と の み 反 応 す る M ^a b を 作 製 し こ れ に 制 ガ ン 剤 を 結 合 さ せ 人 体 に 投 与 す れ ば 、 ガ ン 細 胞 の み を 選 択 的 に

死 滅 さ せ る ご と が で き る と 考 え ら れ る ^{( 3 )}

。

し か し ハ イ ブ リ ド ー マ 技 術 は 主 と し て マ ウ ス 細 胞 に 適 用 さ れ て き た た め 、 作 製 さ れ た

M

b は す べ て 、 マ ウ ス 特 有 の 抗 原 を 持 っ て い

る 。 従 っ て 人 体 に 投 与 し た 場 ^A 口 、 異 種 タ ン

パ ク 質 と し て 認 識 さ れ る た め 生 体 内 に と ど ま

る 時 間 が 短 く な り ^{( 4 )} 有 効 な 活 性 が 持 続 し

な い 、 ア ナ フ ィ ラ キ シ ー シ ョ ク な ど の 副 作 用 を 引 き 起 こ す と い っ た 問 題 点 を 持 っ て い る と 考 え ら れ る 。 ご れ ら の 問 題 の 解 決 の た め に は ヒ ト 由 来 の M ^a b を 作 製 す る こ と が 最 も 直 接 的

で 有 効 で あ る と 考 え ら れ る

ヒ ト M ^a b を 作 製 す る た め に は 、 ヒ ト リ ン パ 球 を 効 率 よ く 不 死 化 で き る ヒ ト 融 合 親 細 胞 株 の 開 発 を 待 た な け れ ば な ら な か っ た 。 我 々 の 研 究 室 で は ヒ ト ミ エ ロ ー マ で 融 合 効 率 の 高 い

融 合 親 細 胞 株 を 樹 立 し ^{( 5 . 6 . 7 )} 効 率 よ く ヒ

ト ハ イ ブ リ ド マ を 作 製 す る ご と が 可 能 と な

っ た 。 す で に 肺 ガ ン に お い て は 、 肺 腺 ガ ン と 特 異 的 に 反 応 す る ヒ ト M ^a b が 作 製 さ れ 、 そ の 抗 体 の 認 識 す る 抗 原 を 用 い て 肺 ガ ン の 血 清 診

断 が 試 み ら れ て い る ^{( 8 . 9 . 1 0 )}

。

ヒ ト M ^a b は 、 ガ ン の 治 療 、 診 断 お よ び ガ ン の 生 化 学 的 ・ 免 疫 化 学 的 特 性 を 明 ら か に す る た め 必 要 と さ れ て い る

そ ご で 著 者 は 肺 ガ ン と 並 ん で 頻 度 の 高 い ガ ン で あ り 、 診 断 や 治 療 、 予 防 法 の 確 立 が 求 め ら れ て い る に も か か わ ら ず 、 ヒ ト M ^a b の 作 製 例 が 少 な い 乳 ガ ン お よ び 胃 ガ ン に 注 目 し

と れ ら ガ ン 細 胞 に 対 す る ヒ ト M ^a b を 作 製 し そ れ ら の 認 識 す る 抗 原 の 同 定 を 試 み た

先 ず 初 め に 、 2 種 類 の 親 細 胞 株 を 用 い て 乳

ガ ン 、 胃 ガ ン 細 胞 株 と 反 応 す る ヒ ト M _a b 生 産

性 の ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド ー マ を 作 製 し た

第 2 ^z土且_厚L 第 6 章 _。 そ し て 作 製 さ れ た ハ イ

ブ リ ド

ー

M

の 反 応 性 を 検 討 し た (第 3 ^ニ60._.!fL 第 7 章 _{。 L} ^-ヲ，

れ ら の 結 果 乳 ガ ン 、 胃 ガ ン 細 胞 と 特 異 的 に

反 応 す る ヒ ト M _a b が 数 種 類 得 ら れ た

次 に 、 作 製 さ れ た ヒ ト M _a b の 認 識 す る 抗 原

の 検 索 を 行 な っ た 第 4 章 、 第 8 章 _。 ヒ ト

M a

b

1

2 に お い て は 、 そ の 認 識 す る 抗 原 の

分 離 精 製 を 行 な っ た

M a

b

8 に つ い て は

第 5 章

1 n

。 ま た ヒ ト

v i v 0に お い て 増

殖 し た 胃 ガ ン 細 胞 株 と の 反 応 性 を 検 討 し た

第 9 章 _。

さ ら に 、 よ り 簡 便 で 迅 速 な ヒ ト M _a b の 調 製

の た め に ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド ー マ の 無 血

清 培 養 (第 1 0 章 お よ び 、 ヒ ト M _a b の 分 離

精 製 を 行 な っ た (第 1 1 章 _。

第 2 章 乳 ガ ン 細 胞 特 異 的 ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 生 産 性 ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド

ー マ の 作 製

第 1 節 緒 日

ヒ ト ^{M a b} を 作 製 す る 方 法 と し て lま ^、 次 の ³ つ の 方 法 が あ る ^。

マ ウ ス 由 来 の 親 細 胞 と ヒ ト ^ン パ 球 を ^、

あ る い は マ ウ ス

)\

2

感 染 さ せ 不 死 化 さ せ る 方 法 ^。

3

ム口 さ せ る 方 法

1

落 し 目 的 の 抗 体 の 生 産 が 不 安 定 と い つ 問 題 が あ る ^。

2

耐 性 を 持 ^{つ た} 親 細 胞 株 と 融 合 す る ^しー-? と よ ^つ て ^、 目 的 の 抗 体 の 生 産 を 安 定 化 さ せ る 工 夫 が

必 要 で あ る ^。

治 療 用 ^い る ^{し- ヲ，ー} と の で き る

M

3

で 融 合 効 率 の 高 ^{い ヒ} ト 親 細 胞 株 ^{、 H 0 -}

3

3お

よ び A ^{4 H} 1 ² を ^、 乳 ガ ^ン 患 者 の ^ン パ 節 ^{ン ノヌ}

球 ^と 細 胞 融 合 す る ^t、}ョ， と よ り ^ヒ ト ^{一 ヒ} ト ^J\ イ フ ド ^{一 マ} を 作 製 し 乳 ガ ^ン 細 胞 株 M ^{C F - 7} と 反 応 す る

し ^、 乳 ガ

た

第 2 節

第 1 頂

E R D F 培 地

抗 体 を 生 産 し て る ク ^{ロ 一 ン}

ン 細 胞 特 異 的 ^ヒ ト

M

実 験 材 料 お よ び 方 法

試 薬 の 調 製

E R D F (極 東 製 薬) ^{7 0 . 5 g}

H E P E S

N a H C 0 3

5 . 9 8 g

5 . 6 g

を 選 択 を 試 み

Eセ 酸 ^ス ト レ フ ト ^マ イ ^ン ン 明 治 製 菓 ^{o .}

5

fえ ^一一 ン ン G カ ウ ム 明 治

製 菓

500 . 000

上 記 ^{の も の を 、} 超 系市 水 ^{イ、谷，ム.} 解 し ^、 全 量 を

5

と し た ^{。 t、』ヲー'} れ を ^{o . 2 2μ m} の フ イ jレ タ ^一 で 加

圧 滅 過 減 困 し た ^。

ウ シ 胎 児 血 清

( F C

)

A

5 0完 ポ ^エ チ ^レ

g の P E G

(

り オ ^一 ト ク レ ^一

t-

} ^? れ を 約 ⁴

0

を 加 え 混 合 し た 100 0倍 ^{こ辰曲 度

7

1

ー7

9

0

1

o

で 中 手口 し ^、 全 容

し た ^{。 m} 1ず ^つ

ン グ ^{コ 一} jレ

3 3

50 ，

( 1

0

冷 却 し た f麦 ^、

。

ノ フ ^{ア ン i、谷，J...}

ノ フ ^ア ン

懸 濁 し た f表 溶 解 し た ^。 溶 を

100

0

( P

G )

を 1夏ーφ子 ^{J し、、 �官... ，、.}

2 0分 し

取 た ^。

m 1の E R D F 培 地

t佼

( A )

S 1 g ^{m a} 社 を 約

に ^、

N N

H

解 後 ^、

^{N H C 1}

た f麦 j慮 過 滅 菌

。C で 保 存 し た ^。

100

( H T ) 136

3

ジ ン を

100

1 0 0

1

の 超 純 水 を 力日 え た f麦 lこ オ ^一 ト ク レ ^一 ブ 滅 菌 し

た ^。 ヒ ポ キ サ ン チ ン ^、 チ ^{、、、句、、� ユノ} ン が 析 出 し な ^い

つ ち 滅 菌 し た ^ス ク 二L ウ キ ^{ヤ ツ} プ 付 き 遠 心

会呂立 分 注 し ^{- 2}

0

後 ⁷

0

倍 濃 度 H ^A T 培 地

1 5

C S

A を

500

力日 え た ^。

H A

T

1 5

C S

培 地

100 0倍 希 釈 ^、 H Tを 100倍 希 釈 と な る よ ^つ に 力日

え た 。

生 理 ン 酸 緩 衝 液

( P B S )

C 1

K H 2

P 0

N a

C 1 8

0

N a 2

H P 0

1 . 1 5

以 上 を 水 ^J谷

解

固 定 ^f佼

^{P B} S 400

¹

² 4 ^% )を

0

フ ロ ツ キ ^ン グ ^f佼

( ^{3 % B} S A / ^{P B} S ) ^{: P B} S に

よ ^{つ ウ シ} 血 清 ^{ー7 ノレ フ} を イ合 解 さ せ た ^。

洗 浄 ^f佼

^{T P B} S ) ^{P B}

る よ ^{つ こ(比目 メ口入} し た ^。

酵 素 標 識 ^{抗 ヒ} ト 免 疫 グ

ヒ ト

^T A ^{G 0}

抗 ヒ ト ^{1 g G ， 1 g}

^M

倍 希 釈 し た ^。

基 質

^イ合

/

、

、、、、.

ン

( B S A 、

、、‘

T

0

ロ フ ン 酵 ^草オミ三 標 識 ^抗

ぺ jレ オ キ ^ユノ ダ ^一 ゼ 標 識

た ^。

^{1 % B} S A / ^{P B} Sで 100 0

A

B T S {

²

^{2 t}

i

d i -

(

h

¹

h i

¹ i

i

i d ) d i

i

¹

、

0

o .

2 M

^f佼

lご 等 ^{呈Eヨ主 ζ(比目 メ口入} し た ^。

第 2 頂 細 胞 の 培 養

ヒ ト 親 細 胞 株 H ^{0 -} 3

²

作 製 さ れ た ^{( 6 )}

F

。

E

F培 地 で 継 代 培 養 し た 。 融 合 前 日 に 培 地 交

換 を 行 な っ て 対 数 増 殖 期 の 細 胞 を 融 合 に 使 用 し た 。 細 胞 数 は セ ル カ ウ ン タ ー を 用 い て 測 定

し た 。 も う 一 つ の 親 細 胞 株 A

1 2 も 同 様 に し

て 培 養 し た

第 3 項 リ ン パ 球 の 分 離

リ ン パ 球 は 、 乳 ガ ン 患 者 か ら 手 術 時 に 摘 出 さ れ た リ ン パ 節 を 用 い て 、 次 の よ う に 調 製 し た 。 ま ず 、 リ ン パ 節 に 付 着 し て い る 脂 肪 塊 な

ど の 余 分 な 組 織 を は さ み で 除 去 し た 後 、 E ^{R D} F

培 地 で 洗 浄 し た 。 ご れ を E ^{R D} F ⁵ m 1 の 入 っ た

6 0

m m シ ャ ー レ に 移 し 2 本 の メ ス を 交 差 さ

せ て 約 2 m m角 に 細 切 し た 。 ご の 小 片 を 2 枚 の ス ラ イ ド グ ラ ス に は さ ん で 押 し 潰 す ご と に よ っ て リ ン パ 球 を 出 し た 。 余 分 な 組 織 片 を ピ ン セ ッ ト で 取 り 除 い た 。 ご う し て で き た リ ン パ 球 懸 濁 液 を 15 m

1

心

5

れ た ^{ン ノて} 球 ^{ρえ レ jツ ト} を E R D F 培 I也 で ^回 洗 浄

し た 後 、

1 0

F

i� 力日

10m

て

1 0 m ¹

5

で ³ 日寺 間 以 上 培 養 ^{す る し-?ー と よ り} 繊 維 芽 細 胞

を シ ヤ ^一 レ の 底 面 接 着 さ せ 培 地 ^{中 lこ} 浮 遊

し た ン ノて 球 を ^{週 問} 以 内 融 合 ^{に 用 い} た 。

ン ノ可 1求 の 細 胞 数 ^lま 血 球 計 算 板 ^よ つ て 計 調IJ

し た 。

第 4 項 ハ イ ブ リ ド ー マ の 作 製

親 細 胞 株 ^と 第

³

濁 液 を 、 そ れ ぞ れ

5 0 m ¹

100 0

m

5分 遠 心

E R D F

m ¹

100 0

克d型r 呈Eヨ_主

の E R D F 培 地 懸 濁 し 、 細 胞 数 を 計 測 し た 。 親

細 胞 株 ^{と ン} パ 球 の 細 胞 数 の 比 が 、

1

5 0 m ¹

親 細 胞 株 で 0 . 5 "-' 2 X 107 個 と し た 。 親 細 胞

株 と リ ン パ 球 を 混 合 し 、 1000 _{r p} m _， 5分 間 遠 心

し 上 清 を 完 全 に 除 去 し た 後 遠 心 管 の 底 を 軽

く た た く ご と に よ り ペ レ ッ ト を 底 部 壁 面 に 広

げ た

次 に 、 あ ら か じ め 3 7 oc に 保 温 し て お い た 50

完P E G溶 液 1 m 1を ピ ペ ッ ト に と り 、 遠 心 管 を 手

の ひ ら で 暖 め な が ら 1 分 間 か け て 添 加 し た

と れ を 、 1 分 間 手 の ひ ら で 保 温 し た 後 、 3 7 oc

に 保 温 し た E R D F培 地 を 1 m 1加 え 、 さ ら に 、 3 0

秒 ご と に 1 m 1ず つ 合 計 9 m 1添 加 し た 。 添 加

終 了 後

100 0

m

5分 間 遠 心 し た 。 で き た ぺ

レ ッ ト を 、 3 7 oc に 暖 め て お い た 1 5 ^% F C S添 加

E R D F培 地 に 、 親 細 胞 株 の 細 胞 数 に し て 2 x

105 個 / mlと な る よ う に 懸 濁 し た 。 ご の 懸 濁

液 を 、 9 6穴 プ レ ー ト に 100 μ 1 /

1 1で 分 注

し た 。

と の プ レ ー ト を 、 3 7 oC . 5完 C 0 2 _• 7完 o 2 に 制

御 さ れ た イ ン キ ュ ベ ー タ ー で 一 晩 培 養 し た 後

2 倍 濃 度 H

後 、 3 "-' 4 日 ご と に 半 量 ず つ H A T 培 地 を 交 換

し た し た ら

2 "-' 3 週 間 後 、 ハ イ ブ リ ド ー マ が 出 現 H A T 培 地 か ら A を 除 い た H T培 地 に き

第 5 項 ス ク リ ー ニ ン グ

乳 ガ ン 特 異 的 M _a b の 検 出 は 、 M

_{C F}

対 す る 反 応 性 を 酵 素 抗 体 法 (ELISA) で 調 べ る

ご と に よ り 行 な っ た 。 ま ず 、 M _{C F} - 7 細 胞 を 9 6

穴 プ レ ー ト に 単 層 培 養 し 固 定 液 で 1 5分 間 処 理 す る ご と に よ っ て 固 定 し た 。 固 定 液 を 捨 て

各 穴 を T _{P B} S 300 μ l で 3 回 洗 浄 後 、 抗 体 の

非 特 異 的 吸 着 を 防 ぐ た め ブ ロ ッ キ ン グ 液 を

200 μ 1 ず つ 各 穴 に 添 加 し 、 1 時 間 、 3 7 oc で

保 温 し た 。 ご う し て 作 製 し た 抗 原 プ レ ー ト に

9 6穴 中 に 出 現 し た ハ イ ブ リ ド ー マ の 培 養 上 清

0μ 1 添 加 し 、 1 時 間 反 応 さ せ 、 酵 素 標 識

抗 ヒ ト 1 gと 特 異 抗 体 と を 結 合 さ せ た 後 、 基 質

の 添 加 に よ る 発 色 を 検 出 す る こ と に よ り 特 異

抗 体 を 選 択 し た 。 各 穴 の 洗 浄 は 酵 素 標 識 抗 ヒ

卜 1 gお よ び 基 質 の 添 加 の 前 に T P B S

300 μ 1

で 3 回?子 な っ た

第 6 項 ^{ク ロ ー ニ ン グ}

ス ク ^一一 ン グ で 反 応 陽 性 で あ _つ た ノ\ イ _フ

ド ^一 _マ は ス ケ ^一 jレ ^ーノフ _{ツ フ} す る の と 同 時

穴 ^{o .}

3

グ し 、 反 応 性 が 高 く 、 か っ 増 殖 速 度 の 早 い も

の を 選 択 し た

。

し て い る ノ\ イ _フ ド ^一 _マ は 同 様 の 限 界 希 釈 法

で 再 度 ク ロ ^一一 ン グ さ れ た

。

第 3 節 結 果

第 1 ^r百 融 合 効 率

親 細 1包 株 H 0 - 3 23と 手し _ガ ン _{恵、 者} の ン _}て 賀行

ン }、元 球 と を 融 A 口 し た 全小土_口 果 、 1 3回 の 融 ^メ口入 操 作 に よ り 約 2 500個 _{の ノ\} イ _{ブ ド} ^一 _{マ カ三} 出 現 _{し た 。}

し-? れ Lま _、 ま き 込 _{ん だ} 9 6穴 の _つ ち 約 4 5先 の _I\ に

}\ イ _{フ ド} ^一 マ カ三 出 現 _{し た} ^{し- ヲー，} と _{な る 。 高虫} メ口入

効 率 lま 平 均 約

2

c 1

n e /

0

a r e n

c e 1 1 s c 1

n e / 1 0 6 1

n

e c ells)

(Table

親 細 胞 株 A

4

₂

ン _ノて E求 と を 融 A 口 し た 結 果 、 1 2回 の 融 ^メ口入 操 作

に よ り 約

240 0

た ^{。 し切?ー} れ しま ^、 ま き 込 _{ん だ} 9 6穴 の _つ ち 4 5完 _{の I\}

lこ ^)\ イ _{フ ド} ^一 _{マ iJ主} 出 現 _{し た} ^し-?ー と _{な る 。} 融

合 効 率 は 平 均 約

2

c 1

n e /

0

a r e n

c e 1 1 s

c 1

n e /

0 6 1

n

e c e 1 1 s )

( T a b 1 e

。

第 2 _{r百 ス ク} ン グ

ス ク ン グ の 結 果 数 十 個 の ハ イ ブ リ

ド ー マ の 培 養 上 清 中 に M C F - 7 細 胞 と 反 応 す る 抗 体 が 検 出 さ れ た 。 ご れ ら 反 応 陽 性 の ハ イ ブ

リ ド ー マ を ス ケ ー ル ア ッ プ し 限 界 希 釈 法 に

よ り ク ロ ン グ を ?子 な っ た ご の 結 果

M

- 7 細 胞 と 反 応 す る M a b を 生 産 し て い る 1

種 類 の ハ イ フ リ ド ー マ を 樹 立 す る ご と が で き た (Table 2- 3)

。

H 0 - 3 2 3を 親 細 胞 株 と し た 場 合 、 樹 立 し た ハ

イ ブ リ ド ー マ の う ち 1 g M 型 の M a b を 生 産 す る ハ イ ブ リ ド ー マ は

H 1 5

2

K 2 7

3

H 1 5

4 の 3

ー マ は K -

5 の 1 種 で あ っ た 。 K - 1 - 5 は

1 g

M も 同 時 に 生 産 し て い た 。 ご の 1

M に は

M C F

- 7 細 胞 と の 反 応 性 は な か っ た

親 細 胞 株 と し た 場 ^メ入口 、 樹 立 し た ハ イ ブ リ ド マ の う ち 1 g M 型 の M a b を 生 産 す る ハ イ ブ リ ド

ー マ は

3

5

1

1

1

4

1 1の 4 l重

1

G 型 の M a b を 生 産 す る ハ イ ブ リ ド ー マ は

CHll ， 5Hllの 2 手重 で あ っ た

Table 2・1 Fusion efficiencies of HO・323 with lymphocytes derived from lymph nodes of breast cancer patients

a

Patients No.of seeded well

A 480

B

480

C 480

D

384

E 288

F 384

G 384

H 384

I 480

J 478

K 480

L 480

M

480

Total 5662

No. of hybridomas a

250 189 223 117 83 134 119 179 201 452 223 15

222 2543

Efficiencies (Clone/105parent cells)

2.5 1.9 2.2 1.5 1.7 1.7 1.5 2.2 2.0

4.5 2.2

1.5

2.2

圃・・・・・・・・・・

2.3

No. of hybridomas showed the number of wells in which hybridomas emerged after fusion of H 0・323with Iymphocytes derived from Iymph nodes of breast cancer patients.

b Average

Table 2・2 Fusion efficiencies of A4H12 with lymphocytes derived from lymph nodes of breast cancer patients

a Efficiencies Patients N o. of seeded well No. of hybridomas

(Clone/105parent eeHs)

A

567 171 1.4

B 480 185 1.9

C 288 102 2.0

D

288 112 2.2

E

480 211 2.1

F 480 243 2.4

G 480 251 2.5

H 480 225 2.2

I

480 231 2.2

J 480 234 2.3

K 480 245 2.5

L 480 234 2.3

Total 5463 2444 2.2

a No.of hybridomas showed the number of wells in which hybridomas emerged after fusion of A4H12 with Iymphocytes derived from Iymph nodes of breast cancer patients.

b Aaverage

Table 2-3 Human-human hybridomas producing monoclonal antibody reactive to breast cancer cell line，九1CF・7.

Hybridoma Parent cell Ig type

H15F2 HO-323 Ig九f

K-I-5 HO-323 IgG(lgM) a

K27C3 HO-323 IgM

H15B4 HO-323 IgM

AA3 A4H12 IgM

5CI0 A4H12 Ig九f

lBI0 A4H12 Ig九f

4Dll A4H12 Ig九f

CHll A4H12 IgG

5Hll A4H12 IgG

aThis hybridoma produced both IgG and IgM. Reactive Ig was IgG type.

第 4 節 考 察

親 細 胞 株 H ^{0 -}323あ る い は A ⁴ H 1

2 と 乳 ガ ン 患

リ ド ー マ を 作 製 す る ご と が で き た 。 ま た

M C F -

7 細 胞 と 反 応 す る 抗 体 を 生 産 し て い る ク

ロ ー ン 1 0株 を 樹 立 す る ご と が で き た

K j

nら (

パ 芽 球 腫 細 胞 と を 融 合 し て 作 製 さ れ た ヒ ト 親 細 胞 株 K ^{R -} 1 2 を 用 い て ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド

ー マ を 作 製 し て い る 。 ご の 時 の 融 合 効 率 は

1 .

0

n

/ 1 0

s で あ っ た

H 0 -3 2 3や A ⁴ H 1 2 を 用 い た 場 合 の 融 合 効 率 は ご

れ よ り 約 2 0倍 高 く

の ヒ ト 親 細 胞 株 ^{( 6 )}

ご れ ま で に 報 告 さ れ た ど

よ り も 高 い ご と か ら ""?

しー

れ ら 2 つ の 親 細 胞 株 は ヒ ト ー ヒ ト ハ イ ブ リ ド ー マ の 作 製 に 非 常 に 有 利 で あ る

と の よ う な 高 い 融 合 効 率 を 得 る た め に 注 意 す る 点 と し て 以 下 に あ げ る と

生 き の よ い 細 胞 を 融 合 用 ^し\ る た め ^、 親

細 胞 株 の 培 地 交 換 を 頻 繁 行 な ^{つ し‘τ，ー} と ^。 そ し て 対 数 増 殖 期 の 親 細 胞 株 を 融 合 に 用 い る ^{し- ヲ'ー}

と ^。 さ ら ^{、 ン} パ 球 は 手 早 く 分 離 し ^、 早 目

に 使 用 す る ^。

2

F C S

速 い ^{ロ ツ ト} を 選 択 す る ^。

3

4 ^ーノ^{フ 、、、、、、、.} ノ フ ^{ア ン} Lま 細 胞 融 合 後 1 2 "'-' 1 6時 間

で 添 加 す る ^。

5 融 合 後 の 培 養 ^{lま 、 7 % 0 2 ， 5完C 0 2} に 制 御 さ れ

た イ ^ン キ ^{コー べ 一} タ ^一 を 用 ^{し\ て} 行 な ^{つ 。}

」_‘τ，

れ ら の 他 出 現 し た ^)\ イ フ ド ^{一 マ} の 安

疋 し た 増 殖 の た め lこ は ^、 培 地 交 換 の 時 期 ^{、 ス}

ケ ^一 jレ

ー7

ス ク ^{一一 ン} グ 用 い る 抗 原 ^{と し て}

^jj

一 一

ン グ Lま 培 養 細 胞 株 を 用 い た ^{(._ーョー，} の 方

一 。

法 は ^、 培 養 細 胞 株 を ⁹ 6穴 増 殖 さ せ ^、 国 ^疋 す

る ^しー-ヲ' と よ ^つ て 大 量 に 均 な 抗 原 を 調 製 す

る ^し相? と カ三 で き る ^{。 に、 ヲー，} の 抗 原 フ レ ^一 ト を 用 た

E L 1 S A 法 lま ^、 少 量 の 培 養 液 で ^、 簡 単 大 量 の

サ ン フ ル を ^ス ク ^一一 ン グ で き る 点 で 優 れ て い る と 考 ^え ら れ る ^。

第 3 章 乳 ガ ン 細 胞 特 異 的 ヒ ト モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 細 胞 株 に 対 す る 反 応 性 の 検 討

第 1 節 緒 己

第 2 章 で 、 乳 ガ ン 細 胞 株 M C F ^- 7 と 反 応 す る ヒ ト M ^a b を 生 産 す る ハ イ ブ リ ド ー マ を 作 製 し た 。 こ れ ら の ヒ ト M ^a b の 反 応 性 を さ ら に 詳 し く 検 討 す る た め 、 乳 ガ ン お よ び 各 種 ガ ン 細 胞 株 、 正 常 線 維 芽 細 胞 株 と の 反 応 性 を E L 1 S A に

よ り 調 べ た

第 2 節 実 験 材 料 お よ び 方 法

第 1 項 試 薬 の 調 製

M

b H 1 5 F

7 C 3

H 1 5 B 4 の 3 種 は 、 無 血 清

K ^- 1 ^-

5

キ シ ^{ーノ勺〉 ノて} タ イ 精 製 し た も ^の

券:;:/ 昭^{、 、、 。 そ の}

を ¹ 0完

^F

^S

/ P B Sで ?ラ な ^てコ

ガ ン 細 胞 株 は ^{、 1 0先}

^F

0 6

フ ^{ロ ツ} キ ン グ

抗 抗 体 ^{べ jレ} よ び 基 質 J谷 f佼 o ^.

6

血 清 培 養 f麦 ^{の i-立口} 養 f佼 を ^、 ヒ ド ^ロ

ト ^、 お よ び フ ^{ロ ア} イ ン

A

を 用 ^し\ た 第 ¹

^G

イ也 の M ^a b は 各 ^ノ\ イ フ ド ^一 マ

加

E R D F

。 抗 体 ^、 抗 抗 体 ^の 希 釈 lま l完

B

た ^。

お よ び 正 ^戸吊ι. 繊 維 ^牙 細 胞 株 ^の I音 養

添 力日

E R D F

先 グ ^jレ タ ^{ノレ ーノ'フ} jレ ^ア ヒ ド

/ P B S

f佼 3 完B

S

/

S

オ キ ^ユ/ ダ ^一 ゼ 標 識 抗 ^ヒ ト

1

1 g M

(

m g

/

B T S {

( 3

6

)

d i a m m 0 n i ^{u m s a} 1 t }水 溶 f佼 を ^{、 o .} 0 6完H ² 0 ^{2 ノ同弘、} 有

o ^. 2 M ク ^コニ ン 酸 緩 衝 f佼

(

に 等 量 ^{こ(比目 ム口} し た も ^{の 。}

反 応 停 止 f佼 1 ^. 5完シ ^二L ウ 酸

洗 浄 液 o ^.

0 5

T

P B S ( T P B S )

第 2 項 実 験 方 法

各 種 ガ ^ン 細 胞 株 正 常 線 維 芽 細 胞 株 ^と 作 製

さ れ た ^ヒ ト ^{M a}

^b

調 べ た ^。 ガ ^ン 細 胞 正 常 線 維 芽 細 胞 は 9 6穴 プ

レ ^一 ト に 単 層 培 養 さ れ 宏ニ士二 ^{J目1lll で 1 5分 間 国 定 液

に 浸 し た ^。

3

グ 液 で ^、

3

製 し た 細 胞 抗 原 ^{μ g}

/ m

b

100

回 洗 ^つ た 後 ^、 抗 抗 体 を

¹⁰⁰

³⁰⁰

^l

回 洗 ^つ た f麦 基 質 溶 液 を

¹⁰⁰

^l

3

。C で

に 反 応 停 止 液 を

¹⁰⁰

^l

し

た 後

り 吸 光 度 405 ⁿ mを 測 定 し た ^。

第 3 節 結 果

T a b 1 e

3

3

フ ド ^一 マ に よ _つ て 生 産 さ れ る ヒ ト

M

各 種 ガ ^ン 細 胞 株 ^{お よ} び 正 常 線 維 芽 細 胞 株 と の

反 応 性 ^を E L 1 S A iこ よ り 調 ^べ た 結 果 ^を 刀ミ^一 し た 。

M a b H 1 5 F 2 は 、 乳 ガ ン 細 胞 株 M C F - 7 と 5主 く 反

応 し た 。 そ の イ也 の ガ ン 細 胞 株 と しま 全 く 反 応 し な か _つ た _。 ま た 正 常 線 維 芽 細 胞 株 と も 反 応 ^し

な か _つ た 。

F i g .

3

M

M

線 を 刀ミ し た 。 M a b H 1 5 F 2 は M C F - 7 と 抗 体 濃 度

依 存 的 反 応 し た 。

M a b

K

^jJ、

反 応 し た 。 他 の ガ ン 細 胞 株 ^{お よ} び 正 常 線 維 芽 細 胞 株 と lま 反 応 し な か つ た 。

L 、τ， れ ら の ^し-ヲー' と か ら M a b H 1 5 F 2 お よ び K - 1 - 5

は 乳 ガ ン 特 異 的 ^と 考 え ら れ た 。

M a b H 1 5 B 4 お よ び K 2 7 C

3

て の 細 胞 株 と 反 応 し た 。

T

a b

3 - 2 に 、 A 4 H 1 2 を 親 細 胞 株 と す る ハ

イ ブ リ ド ー マ に よ っ て 生 産 さ れ る ヒ ト M a b と

各 種 ガ ン 細 胞 株 と の 反 応 性 を E

A に よ っ て

調 べ た 結 果 を 示 し た 。 1 g M 型 の M a b 5 C 1 0

1

1 0お よ び 4

1 1は 、 試 験 し た 3 種 の 乳 ガ ン 細

胞 株 す べ て と 反 応 性 を 示 し た 。 M a b A A 3 は 乳

ガ ン 細 胞 株 M C

- 7 お よ び H

C - 5 と 反 応 し

H B

C - 4 と は 反 応 し な か っ た 。 1

M 型 の M a b は

4 種 と も

い 反 応 性 を 示 し た 。 肺 ガ ン 細 胞 株 と は M a b

4 D 1 1が 試 験 し た 2 種 と も に 反 応 し た が 、 他 の

3 つ の M a b は 反 応 し な か っ た 。 正 常 繊 維 芽 細

胞 株 に 対 し て は 4 つ の M a b と も 反 応 し な か っ

た 。 乙 れ ら の こ と か ら

M a b A A 3

び 1B 1 0は 乳 ガ ン 特 異 的 と 考 え ら れ た

5 C 1 0お よ

1 g

G 型 の M a b C H 1 1は 乳 ガ ン 細 胞 株 M C

- 7 お

よ び HB C ーら と 反 応 し た 。 胃 ガ ン 細 胞 株 2 種 と

も 反 応 し た が 、 正 常 繊 維 芽 細 胞 株 を は じ め そ

の 他 の 試 験 し た 細 胞 株 と は 反 応 し な か っ た

Mab 5Hllが 反 応 す る 細 胞 株 は 、 M a b C H 1 1と ほ

と ん ど 同 じ で あ ^つ た 7J主 ^、 肺 ガ ^ン 細 日包 株 ^A 549と 反 応 性 を ^司ミ す ^占 _{均三 ニ�とg}と^、、 な ^つ て た ^。

3

jj'

細 胞 株 女千 す る

1 g _M

₄

の M a b の 反 _{応 曲 線 を}

描 く ^{仁、τ，一} と よ り そ れ ら の

反 応 性 _{を 比 較 し た}

(Fig . 3-2)

M C F - 7

細 日包 対 し て lま

4

M

反 応 _し ^{M a b} 4 D 1 1 カ三 ^耳E支ヨ も ^{同E コ1 い} 反 応 性 _を 刀ミ し

た

(Fig . 3-2 (

)

B C

4

M

b

B

0が

M

4 D 1 1

と ^{M a b}

5 C _{1 0は ��}

M

3

た

(Fig . 3-2 ( B ) )

H B C -

5

M

D

1 M

5 C _{1 0}

お よ び

M

1 B _{1 0が}

M

A A

3

_��

(Fig . 3-2 ( C ) )

同 様

1 g

た

(Fig . 3-3)

_M C

-

C

5

ず れ お ^し\ て も

M

5

1 1 の

_M

C

り 5皇 反 _応 ^'性 _を 刀ミ し た ^。

Table 3-1 Reactivities of human monoclonal antibodies to various human cell lines

Monoclonal antibodies

H15F2 K・1-5 K27C3 H15B4

Cell lines Ig type Ig九f IgG IgM Ig九f

Breast cancer

MCF-7

骨+ -t+ -t+ +

HBC-4 ^-

+ +

HBC-5 ^{- -・圃・・・・・・圃}

+ +

Lung cancer

PC-8 ^{- -}

-t+

Stomach cancer

MKN-28 ^{-・・圃・・・・・・ -}

+

Bladder cancer

KU-l ^{掴園田・・・・・圃・ -・・・・・圃・・・}

+ +

Epidermoid cancer

A圃431 ^{-・・・・・圃・・・ -}

→ー +

Normal fibroblast

b

+十 +

Flow2000 ^- NT

判官-38 ^{- 園田・・・・・・・}

-t+ +

a Strength of reactivities of human monoclonal antibodies was

b

expressed as follows:the absorbance at 405 nm was below 0.1 (ー)，

0.1・0.2 (+)，0.2・0.3 (++ )，and over 0.3 (+++). Each of human monoclonal antibodies was prepared at 1μg/ml .

NT: N ot tested.