東京大学大学院農学生命科学研究科 ミニ特集：PPV（ウメ輪紋ウイルス）の現状と対策
ックスウイルス検出キット」について概説する。
LAMP
は4
〜6
種類のプライマーと耐熱性鎖置換型DNA
合成 酵素を用いる迅速・高感度な等温遺伝子増幅法である（TOMITA
et al., 2008）。逆転写酵素の添加により RNA
の 検出も可能であり（RT―LAMP），幅広い分野で遺伝子
検査技術として利用されている。本キットでは，
PPV
の保存領域を標的としたプライマ ーセットを採用しており，従来のRT―PCR
や海外で報告された
RT―LAMP
と比較しても検出感度は10
倍以上で，迅速性にも優れる。さらに，一般的な核酸抽出工程を，
爪楊枝を葉に刺すだけでよい簡易核酸サンプリング法で 代替し，蛍光発色液による遺伝子増幅の可視化を採用し ているため，温湯と魔法瓶を用いて反応液を
63℃前後で 30
〜60
分間保つだけで，目視による結果判定が可能である。実験機器（遠心機やサーマルサイクラー，電気泳 動装置，ゲル撮影装置）を必要としないので，あらかじ め試薬を分注しておけば，現場での診断も可能である。
III
改良型RT
―LAMP
による遺伝子診断 一般に抗体診断は遺伝子診断と比較して検出感度が劣 るものの安価なため，スクリーニングに用いられること が多い。PPV根絶事業の場合も同様に，発生地域の特 定を主眼として，比較的安価なイムノクロマトキットが スクリーニング（1次診断）に利用され，2次診断をRT
―LAMP
キットが担ってきた（なお，財産権の観点か ら誤処分の可能性を極力排除するために，両キットで陽 性となった場合に感染樹と判定される）。全国の発生状況調査が進むにつれ発生地域がほぼ特定
②ウイルスタンパク質が吸い上げられる （毛細管現象）
③ウイルスタンパク質が 金コロイド標識抗体と結合
④さらに吸い上げられる
①粗汁液を滴下 サンプルパッド 試薬紙 判定紙
判定ライン
：金コロイド標識抗体
：固相化抗体
：粗汁液
：ウイルスタンパク質 吸収帯
⑤ウイルスタンパク質が固相化抗体と結合
⑥金コロイドの判定ラインが出現
A
B
図−1 イムノクロマトの原理 A．試験紙の各部位の名称．
B．反応の原理．粗汁液を加えた後は自動的に反応が進行し15分で検出される．
33 PPVの簡易迅速な診断技術の開発
されたと考えられたため，
PPV
根絶事業は，発生地域 における感染樹の早期発見・処分を通じた早期清浄化が 求められる段階に入ってきた。そこで，東京大学植物病 院®では1
次診断の時点から高感度なRT―LAMP
を用い る有用性について検討した。課題として，2×2 cmの 葉の粗汁液を用いるイムノクロマトと比べて，爪楊枝の 先端で葉を刺突するRT
―LAMP
ではサンプリング範囲 が狭く，偽陰性となる可能性が懸念された。そこで，イ ムノクロマトと同様に葉の粗汁液を用いて診断すること ができる改良型RT―LAMP
キット「プラムポックスウ イルス検出キットVer.2 for Turbidimeter
」を開発した。本キットは蛍光ではなく濁度により判定するため濁度測 定装置および電源が必要となるが，試薬組成の改良によ り
30
分以内に結果が得られるため，世界で最も迅速なPPV
の遺伝子診断技術である（図―2
）。そのうえ，従来 のRT
―LAMP
キットと比べて検出感度が向上し，単価 もイムノクロマトキットを下回るため，PPV根絶事業 の1
次診断に適した仕様である。本キットは2013
年8
月に（株）ニッポンジーンにより製品化された。本キットを用いた
1
次診断により，イムノクロマトキ ットと比べて取りこぼしの可能性が格段に低くなるだけ でなく，陽性となった検体の粗汁液をそのままイムノク ロマトによる抗体診断に使用できるため，作業も大幅に 簡略化され，1時間以内にPPV
の遺伝子診断および抗 体診断の実施が可能である（図―2
）。今後の活用が期待 されるとともに，本試薬組成の利用により他のLAMP
診断系の改良も期待される。1．葉（2×2 cm）をプラス
チックパックに入れる
遺伝子診断キット
「プラムポックスウイルス検出キット Ver.2 for Turbidimeter」
抗体診断キット
「プラムポックスウイルス イムノクロマト」
2．抽出液1.3 mlを入れる
（スポイトで2回分）
4．抽出液に漬けた爪楊枝を チューブ内の検査液に浸す
4．抽出液0.65 mlチューブに移す 5．試験紙を抽出液に15分浸す
5．濁度測定装置を用いて 65℃で30分反応させる 3．パックの口を閉じて
葉をすり潰す
共通工程遺伝子診断︵
30
分︶抗体診断︵15
分︶非感染 感染
非感染
control PPV
感染 濁度が上昇すれば陽性
ラインが二本出れば陽性 一本出れば陰性 図−2 植物粗汁液を利用した遺伝子診断・抗体診断キットによる診断手順
共通のテンプレートを用いて1時間以内にRT―LAMPおよびイムノクロマトによる診断が可能．