空腸と回腸粘膜からのtotal RNA の単離は, ISOGENを用いて行った.ゲノムDNAの コンタミネーションを防ぐために, 抽出物をDNase Iで処理した. Total RNAの濃度と純 度は, 分光光度計により計測した. Total RNA (1 μg) と5 pmol のoligo (dT) primer混合液 に, 逆転写酵素であるRNase H 活性(-) のRevertra Aceを1U添加し, 2 mM dNTPsの存 在下で逆転写反応 (42˚C, 1 hr) を行った. 得られた逆転写産物を鋳型として, 以下に 示すプライマーおよび反応条件で, 1Uの Platinum Taq DNA polymeraseを用い, PCRを線 形性の増幅を示す領域で行った. さらに, 得られたPCRの増幅産物を, 1.5%アガロース ゲルで電気泳動し, Ethidium bromideで染色した.
GAPDH (26 cycles at 95°C for 15 s, 59°C for 30 s, 72°C for 30 s) Forward primer (5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC; 1369-1388) Reverse primer (5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA; 1820-1801)
AB010635 (27 cycles at 95°C for 15 s, 59°C for 30 s, 72°C for 32 s) Forward primer (5’-ACGGTCTCCACTACAGTGGC; 811-830) Reverse primer (5’-AATAGCTGGGTGCATGTTGG; 1339-1320)
AY034877 (32 cycles at 95°C for 15 s, 58°C for 30 s, 72°C for 33 s) Forward primer (5’-AATCTGAGGTGGTCTACAAG; 794-813) Reverse primer (5’-TGCTTGATGAAGCTGGGCAG; 1337-1318)
Hydrolase B/C (30 cycles at 95°C for 15 s, 56°C for 30 s, 72°C for 20 s) Forward primer (5’-CCAAAGACCCAAGGATGTAG; 1382-1401) Reverse primer (5’-TGAGGTTGTCTCTTAGCCAG; 1678-1659)
第5章に関する実験の部
1) 8週, 46週および90週齢ラットの空腸および回腸S9における酵素活性
1-1) 空腸および回腸 S9における PNPA加水分解活性および酵素速度論的パラメータ
ー
PNPA活性は, 第3章の実験の部: 2) 加水分解実験に準じて測定し, またKm, Vmaxは,
基質濃度25-500 μMでの各加水分解活性をMichaelis-Menten式に当てはめ, 非線形最小
二乗法プログラムMULTI109) により解析した.
1-2) 空腸S9におけるP-450活性の測定
第4章の実験の部: 2) P-450活性の測定に準じて, 8週, 46週, 90週齢ラット空腸S9
におけるP-450活性を測定した.
2) 8週, 46週および90週齢ラットの空腸, 回腸および肝臓からのtotal RNAの調製と RT-PCR
第4章の実験の部: 5) ラットの空腸, 回腸からのtotal RNAの調製とRT-PCRに準じ て, 8週, 46週および90週齢ラットの空腸, 回腸粘膜および肝臓からのtotal RNA の調製 ならびに逆転写反応, RT-PCRを行った. また, 前章に用いた以外のプライマーを以下に 記す.
Hydrolase A (26 cycles at 95°C for 15 s, 59°C for 30 s, 72°C for 28 s) Forward primer (5’-CTGGACTTACTTGGAAACCC; 931-950) Reverse primer (5’-TGCAACCAAGTCCTGGAACA; 1278-1259)
RL2 (32 cycles at 95°C for 15 s, 55°C for 30 s, 72°C for 30 s) Forward primer (5’-ACACAGATGACCCAGACAGA; 1210-1229) Reverse primer (5’-CAGTGGCTTCATAGCCAGAA; 1661-1642)
D50580 (29 cycles at 95°C for 15 s, 59°C for 30 s, 72°C for 30 s) Forward primer (5’-TATCGTCAGGACCATCTCTG; 904-923) Reverse primer (5’-AGGAAGTTGGACTGATGCTG; 1320-1301)
kdel receptor 1 (33 cycles at 95°C for 15 s, 58°C for 30 s, 72°C for 14 s) Forward primer (5’-TACTGCTGTTTTGGCGTTCC; 303-322)
Reverse primer (5’-TGCGAACAGGTAATGGCTGG; 462-443)
kdel receptor 2 (33 cycles at 95°C for 15 s, 58°C for 30 s, 72°C for 14 s) Forward primer (5’-TGTAGGAGGCCTCTCATTCC; 303-322) Reverse primer (5’-GAAGAAGAGGTAGTGGGTGG; 462-443)
3) 電気泳動によるエステラーゼの検出
試料懸濁液に, 同容量の試料可溶化液 (1% Nonidet P-40含有) を添加し, 酵素活性 を保持させた状態で可溶化した. このサンプルを7.5% Polyacrylamideゲルを用いて, 200 V 定 電 圧 下, native 電 気 泳 動 に 40-50 min 供 し た. 泳 動 終 了 後 の ゲ ル は, 1%
1-Naphthylacetate を基質とした活性染色を行い, エステラーゼに由来するバンドを検出
した.
謝辞
本研究を行うに際し，終始御指導，御鞭撻を賜りました熊本大学医学薬学研 究部今井輝子教授に深甚なる感謝の意を表します．
本論文作成にあたり有益な御助力と御閲覧を賜りました熊本大学医学薬学 研究部齋藤秀之教授，有馬英俊助教授に深く感謝の意を表します．
本研究に際し，種々の御鞭撻と御協力を惜しまれなかった熊本大学医学薬学 研究部橋本満助手に深く感謝の意を表します．
本研究に際し，貴重な
Testosterone
代謝物（6β-，16β-水酸化体）を賜りまし た第一化学薬品株式会社二宮真一氏に深く感謝いたします．また，Isovaleric acid
の定量においてガスクロマトグラフィーを御貸しくださいました熊本大学医学 薬学研究部入江徹美教授に深く感謝いたします．本研究に際し，御協力いただいた熊本大学大学院薬学教育部病態薬効解析学 研究室の諸氏に心から感謝いたします．
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