データ解析

5-1) 水平型チャンバーの膜透過実験による，ミセル濃度の上昇に伴う透過速度低下率

(Pratio) の算出

ミセル濃度の上昇に伴う透過速度低下率 (Pratio) にむけて，水平型チャンバーにおける 膜透過速度は式Eq. (6) を用いて算出した．

A C

Vr dt

P dCr

total

app = ⋅ ×

) 0 (

・・・・・Eq. (6)

Papp : 見かけ上の透過速度 (cm/sec)

dt

dCr _:

時間に対する薬物透過量の傾き Vr : Apical相の容積 (cm³)

Ctotal(0) : Apical相の薬物濃度の初濃度

A : 透過膜の有効表面積

ミセルが存在しないTM溶液でのPapp（TM）とミセル溶液でのPapp（SIF）の透過速度の 違いを比としてPratioを算出するEq.(8) ．

) (

) (

TM app

SIF app ratio

P

P = P ・・・・・Eq. (8)

第3章に関する実験の部 1) 試薬

Sodium taurocholate, Lecitine (COATSOME NC-50)は日本油脂(株)から購入したも のを用いた．Dulbecco’s modified eagle medium (D-MEM), Nonessential amino acids (NEAA), Fetal bovine serum (FBS), L-glutamate, trypsin (0.25%), EDTA (1 mM)およ び Antibiotic-antimycotic mixture (10,000 U/ml penicillin G, 10,000 μg/ml

Streptomycin sulfate, 25 μg/ml Amphotericin B in 0.85% saline) は GIBCO BRLか ら購入したものを用いた．

Montelukast sodiumはSigma-Aldrichから購入したものを用いた．ACCOLATE 40 mg錠 (Zafirlukast)，Celecox 100 mg錠およびSINGULAIR 10 mg錠 (Montelukast) はそれぞれAstra Zeneca Japan, アステラス(株)およびMerck & Co., Inc.から購入した ものを用いた．WellSolveはセレステ(株)から購入したものを用いた．

また，その他の試薬はすべて和光純薬工業(株)およびナカライテスク(株)の特級試薬 (reagent grade) を用いた．

2) 培養液の調製 (Culture medium : CM) の調製 第2章実験の部2)と同様の方法で行った．

3) 大腸がん由来上皮細胞 (Caco-2) の培養 第2章実験の部3)と同様の方法で行った．

4) D/Pシステムによるin vitro^{膜透過実験} 4-1) Transport medium (TM) の調製

第2章実験の部4-1) と同様の方法で行った．

4-2) Apical溶液の調製

第2章実験の部4-2) と同様の方法でFaSSIFmodとFeSSIFmod6.5を調製した．

4-3) Basal溶液の調製

第2章実験の部4-3) と同様の方法で行った．

4-4) 膜抵抗値 (TEER) の測定

第2章実験の部4-4) と同様の方法で行った．

4-5) D/PシステムによるCaco-2細胞単層膜の膜透過実験

Cell culture insert上に培養したCaco-2細胞単層膜の粘膜側および漿膜側のCMを 除去後，粘膜側にTM (pH6.5)を1.5 mL，また漿膜側にTM (7.4) または，BASを添加 したTM (pH7.4) を2.6 mL導入し，37℃, 5%CO2条件下で20分間pre-incubationし た．その後，D/Pシステムに装着しApical側にApical溶液（FaSSIFmod）を8 mL, ま たBasal側にBasal溶液5.5 mLを導入してその後の操作は37℃に保った恒温槽 (TOYO INCUBATOR, TOYO SEISAKUSHO, Tokyo) の中で行った．溶液導入後，5 分間恒温槽に放置後，膜抵抗値を測定し，膜のviabilityが確認されたものに関してス ターラーバーをApical側とBasal側に導入し，200 rpmの速度で終始攪拌した．

Apical溶液に，粉砕したACCOLATE 40 mg錠の粉末 (0.1, 0.2, 0.4, 0.8 mg)，Celecox 100 mg錠の粉末 (1, 4, 8 mg) およびSINGULAIR 10 mg錠の粉末 (0.02, 0.1, 0.5 mg) を投薬した．Basal溶液について，試験開始後，15, 30, 60, 90, 120分後に200μLずつ サンプリングした．サンプリング後を体積補正のために直ちにApical溶液および Basal溶液を200μL加えた．また，実験開始120分後，Apical溶液500μLを採取し，

親水性フィルターで（DISMIC-13CP, ADVANTEC, Tokyo Roshi Kaisha, Ltd.）を用い て濾液を得た（初流は廃棄）．Apical側およびBasal側のサンプル中の薬物濃度を定 量し，Apical側における溶解率 (% of dose/2hr) および各時間におけるBasal側への 120分間における薬物透過率 (% of dose/2hr) を算出した．

5) 動物による吸収実験

一晩絶食したWistar系雄性ラット(200-250g)にZafirlukastを0.8 mg/4 mL/kgの投 与量で経口投与した (ヒト臨床投与量として40 mg/bodyに相当)．また投与剤型として Zafirlukast原末および粉砕した錠剤粉末は0.5% Methylcellulose溶液に懸濁させて投 薬した．一方，溶液投与としてZafirlukast原末をWelsolveで可溶化した溶液に (40 mg/mL) を0.2 mg/mLの濃度となるように0.5% Methylcellulose溶液に希釈して投薬 した．投与後，事前に規定した各採血ポイント毎にラットを無麻酔下で保定器に保定し，

頸静脈より1回につき約0.2 mLをヘパリン処理した注射筒に採血した．血液サンプル は薬物を定量するまで-30℃で保管した．

6) 薬物の定量

6-1) D/Pシステム Apical側サンプルの薬物濃度

実験より得られたD/PシステムのApical溶液のsample (200μL)にAcetonitrile (200μL)を添加し15,000 rpm の回転数で (Himac CF15R, HITACHI, Tokyo, Japan) 遠心しBSAを遠心除去した後，上澄みを高速液体クロマトグラフィー (LC-2010 Shimadzu Co.,Kyoto, Japan) により定量を行った．高速液体クロマトグラフィーの条 件は以下6-2) の通りである．

6-2) D/Pシステム Basal側サンプルおよびラット血漿の薬物濃度

実験より得られた血漿又はD/PシステムのBasal溶液のsample (200μL)に

Acetonitrile (1500μL) を添加し15,000 rpm の回転数で (Himac CF15R, HITACHI, Tokyo, Japan) 遠心した後，上澄み1.3 mLを回収し，40℃減圧下で溶媒を蒸発乾固し た．残渣を0.1 mLのリン酸緩衝液(50 mM, pH 2.5)とAcetonitrileの混液（1/1）で再 溶解し，高速液体クロマトグラフィー (LC-2010 Shimadzu Co.,Kyoto, Japan)により定 量を行った．高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである．

Celecoxib

Column :J’sphere ODS-H80 75×4.6mm I.D.(YMC)

Mobile phase : 50mM Phosphate buffer (pH 2.5) /Acetonitrile = 65/35 Flow rate : 1.0 mL

Wave length : 254 nm Injection volume : 50μL Column temperature : 40℃ Montelukast

Column :J’sphere ODS-H80 75×4.6mm I.D.(YMC)

Mobile phase : 50mM Phosphate buffer (pH 2.5) /Acetonitrile = 40/60 Flow rate : 1.0 mL

Wave length : 254 nm Injection volume : 50μL Column temperature : 40℃ Zafirlukast (D/P system)

Column :J’sphere ODS-H80 75×4.6mm I.D.(YMC)

Mobile phase : 50mM Phosphate buffer (pH 2.5) /Acetonitrile = 60/40 Flow rate : 1.0 mL

Wave length : 254 nm Injection volume : 50μL Column temperature : 40℃

Zafirlukast (ラット血漿)

HPLC system

Column :J’sphere ODS-H80 75×4.6mm I.D.(YMC)

Mobile phase : 50mM Phosphate buffer (pH 2.5) /Acetonitrile = 60/40 Flow rate :

0.5 mL/min. (gradient conditions: 0-1.0 min, 95% A;

1.0-1.5 min, 95% to 5% A; 1.5-4.0 min; 5% A; and 4.0-6.0 min, 95% A)

Injection volume : 10μL Column temperature : 40℃

MS condition

(ESI interface :LCMS-2010A, Shimadzu Co., Kyoto, Japan).

Nebulizing gas : 2.5 mL(N2) Ionization : Electrospray Probe voltage : 1.5kV

m/z :

zafirlukast (m/z 576.70) warfarin used as the internal standard

(m/z 309.00) 7)

^{データ解析}

7-1) D/Pシステムによるヒト吸収率 (Fa) の予測

D/Pシステムによる透過試験の膜透過率 (% of dose/2 h) の結果から，ヒト吸収率の予 測を以下のEq. (12)に従って実施した．

γ γ

PA PA

PA (%) Abs

Fa r

50 max

+

= ∗ ・・・・Eq. (12)

Absmax : 最大吸収率(%),100% (maximum Fa),

PA : D/Pシステムにおける膜透過率 (% of dose/2 h)

PA50 : 吸収率50%のときのD/Pシステムにおける膜透過率 (% of dose/2 h)

γ : Hill係数

片岡ら⁽³⁶⁾の検討によって，既存薬物の経口吸収率とD/Pシステムでの膜透過率につい て非線形最少二乗法を用いたデータフィッティング(MULTI) ⁽³⁷⁾によって算出したパラ メータ(PA50, γ)を使用した．（空腹時PA50, γ = 0.883, 0.334；摂食時PA50, γ = 1.334, 0.121）

第4章に関する実験の部 1) 試薬

Sodium taurocholate, Lecitine (COATSOME NC-50)は日本油脂(株)から購入したも のを用いた．Dulbecco’s modified Eagle medium (D-MEM), Nonessential amino acids (NEAA), Fetal bovine serum (FBS), L-glutamate, trypsin (0.25%), EDTA (1 mM)およ び Antibiotic-antimycotic mixture (10,000 U/ml Penicillin G, 10,000 μg/ml

Streptomycin sulfate, 25

μ

g/ml Amphotericin B in 0.85% saline) は GIBCO BRLか ら購入したものを用いた．ONO-5129原薬およびONO-5129錠剤は小野薬品工業㈱で 合成および製造したものを用いた．

Cellulose acetate filters はAdvantecから購入したものを用いた．また，その他の試 薬はすべて和光純薬工業(株)およびナカライテスク(株)の特級試薬 (reagent grade) を 用いた．

2) In vitro^{溶解性の測定}

ONO-5129粉末2mgをガラス試験管に秤量し，日本薬局方崩壊試験第1液，日本薬

局方崩壊試験第2液，リン酸緩衝液（pH7.4）を各2 mL添加する．5分間水浴下で超 音波処理により懸濁化する．懸濁液を37度で24時間インキュベートした後，懸濁液を cellulose acetate filter 0.20 μm (ADVANTEC) で初流廃棄の後，濾過した．濾液 500μLと同量のAcetonitrileを混合後，濾液中の薬物濃度を測定しONO-5129の溶解 度とした．

3) 培養液の調製 (Culture medium : CM) の調製 第2章実験の部2) と同様の方法で行った．

4) 大腸がん由来上皮細胞 (Caco-2) の培養 第2章実験の部3) と同様の方法で行った．

5) Caco-2細胞単層膜による透過実験

Caco-2細胞単層膜によるONO-5129の膜透過評価をHidalgoらの方法⁽²⁵⁾に従って実 施した．Caco-2細胞単層膜は12-well Transwell®（Costar）の上に播種し，21日間培 養して得られた単層膜を使用した．透過試験に用いる媒体として10 mM HEPES と15 mM glucoseを含んだ Hank’s Balanced Salt Solution を用い，Apical側はpH 6.5,

Basal側はpH 7.4に調製した．Apical側の媒体は10 mMのONO-5129を含むDMSO 溶液を10μMになるようにApical側に使用する緩衝液で希釈し，Apical側に加えた．

透過試験は37℃，5% CO2の条件下で2時間インキュベートした．試験開始2時間後

Basal側から200μLサンプリングを行い，薬物濃度を定量した．

6) D/Pシステムによるin vitro^{膜透過実験} 6-1) Transport medium (TM) の調製

第2章実験の部4-1) と同様の方法で行った．

6-2) Apical溶液の調製

第2章実験の部4-2) と同様の方法でFaSSIFmodとFeSSIFmod6.5を調製した．

6-3) Basal溶液の調製

第2章実験の部4-3) と同様の方法で行った．

6-4) 膜抵抗値 (TEER) の測定

第2章実験の部4-4) と同様の方法で行った．

6-4) D/PシステムによるCaco-2細胞単層膜の膜透過実験

第3章実験の部4-5) と同様の方法で行った．ただしApical側にFaSSIFmodおよび FeSSIFmod6.5を用いた．投与薬物としてApical側に， ONO-5129 10 mg錠の打錠前の 顆粒 (ONO-5129を23%w/w含有：ONO-5129として0.03, 0.1, 0.3, 0.6, 1.2, 1.8 と 2.4 mg 含有する粉末) を投与した．

7) ラットによる吸収実験

1% DKエステルにONO-5129原末を懸濁させ，一晩絶食又は飽食下のWistar系雄

性ラット (200-240g) に，1，3，10 mg/kgの投与量で経口投与した．また

30%HP-β-CDのONO-5129を溶解した液について1 mg/kgの投与量で静脈内投与を実施した．

投与後，事前に規定した各採血ポイント毎にラットを無麻酔下で保定器に保定し，頸静 脈より1 回につき約0.2 mLをヘパリン処理した注射筒に採血した．血液を遠心分離後，

血漿を得た．血漿サンプルは薬物を定量するまで-80℃で保管した．

8) ヒト臨床試験

日本人の健康成人男性（20-35歳）を対象に，ONO-5129単回経口投与時における薬 物動態を検討した．1，3，10，30，60，120，180，240 mg/personの投与量で1mg錠，

30mg錠を用いて各8例（内プラセボ2例）に空腹時経口投与した．また，30

mg/personについては同一被験者に空腹時投与ならびに食後投与を行い，食事摂取の影

響についても検討した．投与後0.25, 0.5, 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 48, 72時間に採血を実施 した．血液を遠心分離後，血漿を得た．血漿サンプルは薬物を定量するまで-80℃で保 管した．

9) 薬物の定量

9-1) In vitro^{溶解性サンプル分析}

In vitro溶解性試験より得られたサンプルについて高速液体クロマトグラフィー

(LC-2010 Shimadzu Co.,Kyoto, Japan) により定量を行った．高速液体クロマトグラフ ィーの条件は以下の通りである．

HPLC condition

Column :

CAPCELL PAK C18 UG120 150×4.6mm (SISEIDO)

Mobile phase : 20mM Phosphate buffer (pH 3.0) /Acetonitrile = 35/65 Flow rate : 1.0 mL

Wave length : 230 nm Injection volume : 10μL Column temperature : 25℃

9-2) In vitro Caco-2単層膜透過実験のサンプル分析

In vitro Caco-2単層膜透過試験より得られたサンプルについて，薬物の定量はMS検

出器を備えた高速液体クロマトグラフィー (LC-MS, PE SCIEX API 150 system, International Equipment Trading Ltd)により行った．高速液体クロマトグラフィーの 条件は以下の通りである．

HPLC condition

Column :

Keystone Hypersil BDS C18 3μm 30 × 2.0 mm (Thermo)

Mobile phase :

90% water, 10% 25 mM Ammonium Formate Buffer, pH 3.5 (A), 90% Acetonitrile, 25 mM Ammonium Formate Buffer, pH 3.5 (B)

Gradient program : 0-1.2 min, 100-60% A; 1.2-3.0 min, 60-0% A; 3.1-4.0 min 100% A

Flow rate :

0.3

mL

Injection volume : 10μL Column temperature : 25℃ MS condition

Nebulizing gas : 1.5 mL(N2) Ionization : Electrospray Probe voltage : 1.5kV

m/z :

418.5

(+)

9-3) In vitro ^D/Pシステムの吸収性評価のサンプル分析

In vitro D/Pシステム評価により得られたApicalとBasalのサンプル200μLについ て，Acetonitrileを1.5 mL加え

vortex mixer

^で10分間攪拌した．15,000 rpm の回 転数で20分間遠心 (Himac CF15R, HITACHI, Tokyo, Japan) して得られた上澄み1.3 mLについて，ロータリーエバポレーターを用いて蒸発乾固した．その後，100μLのリ ン酸緩衝液 (pH2.5)/ Acetonitrile溶液 (1/1) で再溶解させた．薬物の定量はMS検出 器を備えた高速液体クロマトグラフィー (LCMS-2010A, Shimadzu Co.) により行った．

高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りである．

HPLC condition

Column :

Mercury MS Luna C18, 10×4.0 mm (Phenomenex,

Mobile phase

CA)

:

0.1% formic acid in water (A), Acetonitrile (B) Gradient program

:

0-1.0 min, 95% A; 1.0-1.5 min, 95% to 5% A; 1.5-4.0

min; 5% A; and 4.0-6.0 min, 95% A

Flow rate :

0.5

mL

Injection volume : 10μL Column temperature : 40℃ MS condition

Nebulizing gas : 1.5 mL(N2) Ionization : Electrospray Probe voltage : 1.5 kV m/z :

418.5

(+)

9-4) ラット吸収実験の血漿中濃度分析

ラット吸収実験より得られたサンプルについて，血漿試料 50μL をガラス試験管に 採取し，内部標準溶液 (ONO-PR1-084をEthanolで2.50μg/mL の濃度に調製) 10μL

およびHPLCの移動相600μLを添加してボルテックスにより撹拌した後，約1,400g

で5 分間遠心分離し，上清を回収した．薬物の定量はMS検出器を備えた高速液体ク

ロマトグラフィー (LC-MS/MS TSQ-7000 triple quadrupole mass spectrometer

(ThermoQuest)) により行った．高速液体クロマトグラフィーの条件は以下の通りであ

る．

HPLC condition

Column :

Symmetry Shield RP18 3.5μm 2.1×50 mm (Waters)

Mobile phase :

CH

3

CN/H

2

O/HCOOH (800:200:1

，

v/v/v)

Flow rate :

0.2

mL Injection volume : 20μL Column temperature : 30℃ MS condition

Ionizationmethod : Electrospray Ionization Detection mode : SRM, Positive

Heating capillary temperature : 250°C Spray voltage : 4.5 kV

Sheath gas pressure : 60 psi (N2) Auxiliary gas flow : 20 unit (N2) Multiplier voltage : 1500 V Manifold temperature : 70°C Collision energy : ONO-5129 : -35 eV

: IS : -35 eV

Collision gas : Ar gas (2.5 mTorr)

Monitor ion Precursor Product

ONO-5129 : m/z 418.3 → m/z 200.0 Internal standard : m/z 423.1 → m/z 204.8

9-3) ヒト臨床試験の血漿中濃度分析

ヒト臨床試験より得られたサンプルについて，ガラス遠心沈澱管に 100μL 量りとり，

100 mmol/L リン酸ナトリウム緩衝液(pH7.0) 1 mL，エタノール25μLを添加後， 内 部標準溶液（ONO-PR1-084:40.0 ng/mL）25μLを添加し，t-ブチルメチルエーテル5 mL を加えて 5 分間振り混ぜた．2500 rpm（約 1300g），5 分間室温にて遠心分離後，

ドライアイス／メタノールにて水層を凍結させ，t-ブチルメチルエーテル層をディスポ ーザブルガラス試験管に分取した．窒素気流下40℃にて溶媒留去後，残留物にアセト ニトリル／0.2％ギ酸溶液混液（50:50，vol%）200μL を加え再溶解した．薬物の定量 はMS検出器を備えた高速液体クロマトグラフィー (

LC-MS/MS TSQ-7000 triple

quadrupole mass spectrometer (ThermoQuest)

) により行った．高速液体クロマ トグラフィーの条件は以下の通りである．

ドキュメント内 熊本大学学位論文 (ページ 63-79)