熊本大学学位論文
難溶解化合物の効率的な経口剤開発を目的とした 吸収ポテンシャル評価法の構築
2016
矢野 浩志
Assessment of absorption potential of a poorly soluble oral drug with an aim of efficient development
Koji Yano
論文要旨
難溶解化合物の効率的な経口剤開発を目的とした吸収ポテンシャル評価法の構築
矢野 浩志
難溶解化合物の開発において，吸収飽和による曝露不足が課題となっている．難溶解 化合物の吸収ポテンシャルを精度良く予測するためには，消化管での溶解，胆汁酸ミセ ルへの取り込み，拡散，膜透過過程等の複雑な吸収プロセスを総合的に評価する手法が 有用と考えられる．中でも，消化管液中で胆汁酸ミセルに包接された薬物に関して，
free 体で存在している薬物濃度やその吸収機構について，実験的に検証した報告はほと んど提出されていない．こうした課題を科学的に解明することは，難溶解化合物の吸収 飽和を定量的に予測する上で重要である．
そこで本研究では，創薬初期段階に利用可能な in vitroシステムを用いて難溶解化合 物の吸収飽和を予測し，その経口剤開発の可能性の検証を試みた．
[１] 難溶解化合物の消化管膜透過性の評価法の構築
薬物の吸収ポテンシャルを見積もるためには，薬物の溶解性と膜透過性に関するin
vitro測定値が重要なパラメータとなる．難溶解化合物は，装置への吸着等が膜透過評
価の際に課題となるため，ミセル添加によって吸着の抑制が試みられる．また，実際の 小腸の吸収過程においても胆汁酸ミセルが存在する．真の膜透過速度の算出を目的とし て，膜透過評価系におけるミセル添加の影響を検討した．ミセルの添加によって溶液中 薬物のfree体分率の低下が確認されたが，free体分率の低下と膜透過速度の関係につ いて，より詳細な検討が必要となった．
そこで，難溶解化合物の溶出過程と膜透過過程を再現し，ヒト吸収率を予測するD/P システム (Dissolution/Permeation System) で使用する水平型チャンバーを利用して，
胆汁酸ミセル溶液中のfree体分率を測定する動的透析法を確立した．当評価系を用いて，
胆汁酸ミセルの共存下における膜透過機構を詳細に評価した．胆汁酸ミセル濃度と種々 薬物におけるCaco-2細胞単層膜の膜透過速度の関係を評価したところ，free体分率の 低下に依存してCaco-2細胞単層膜の透過速度が低下した薬物と，free体分率の低下ほ
どCaco-2細胞単層膜の透過速度が低下しなかった薬物が存在した．これら結果より，
胆汁酸ミセルの共存下において，薬物が胆汁酸ミセルから粘膜へ直接分配するルートが 示唆された．
本検討によって発見された，胆汁酸ミセルから粘膜へ薬物が直接分配するルートの存 在により，難溶解化合物のミセル溶液中のfree体濃度とその膜透過速度を積算するだけ では，精度の高い吸収予測ができない可能性が示唆された．
[２] D/Pシステムを用いた難溶解化合物の吸収ポテンシャル評価
ヒト小腸における環境を再現した D/P システムを用いて，市販薬を D/P システムに
Celecoxibおよび CilostazolをD/Pシステムで評価した結果，投与量の増加に伴って 吸収率が低下することが示唆された．両薬物のヒト臨床試験結果においても，同様な吸 収率の低下が認められていることから，消化管内での溶解度が律速となる吸収飽和を D/Pシステムで精度よく予測できることが確認された．
Zafirlukast の吸収率は，D/P システムおよびヒト臨床試験のいずれにおいても，投
与量に依存せずほぼ一定であり，溶解速度律速となった吸収特性を有すると判断された．
本検討によって，D/P システムは難溶解化合物の吸収ポテンシャルを予測するうえで 精度の高いシステムであることが示唆された．
[３] 難溶解化合物の開発可能性の検証に向けた定量的評価
親油性が高く溶解性が低いONO-5129 について，in vitro溶解性およびCaco-2細胞 単層膜による膜透過評価，D/P システムによる吸収性評価，ラットによる動態評価等を 実施し，ヒトの臨床試験における曝露飽和の結果と比較した．溶解性および膜透過性パ ラメータから算出した MAD（Maximum absorbable dose 最大吸収量を示す指標）は，
ONO-5129 の臨床で確認された吸収飽和が起こる投与量を過小評価した．一方，ラット
では投与量増加に対して明確な吸収飽和は確認されず，ヒト吸収ポテンシャルを過大に 予測する可能性が示唆された．結果としてD/Pシステムによるヒト吸収率予測が，吸収 飽和に対して精度の高い予測性を有することが確認された．
また，ONO-5129の吸収に対する食事の影響についても評価したところ，ONO-5129
はヒト臨床試験において食事による曝露の増加が確認されたが，in vitroの溶解性評価 は，臨床で確認された食事の影響を過大評価することが確認された．D/Pシステムは，
臨床で確認された食後の曝露上昇を精度良く予測できた．
難溶解化合物の開発可能性評価において，ONO-5129のように胆汁酸による可溶化が 吸収を規定する場合，D/Pシステムによって精度の高いヒト予測が期待できる．
以上のように本研究では，難溶解化合物の開発可能性を検証する上での吸収飽和が起 こす投与量を予測し，適切な化合物選択に向けた方法論について，その理論的な背景も 含め検討した．特に，胆汁酸ミセルの難溶解化合物の吸収に与える影響を中心に検討を
実施し，in vitroやin vivoの種々の評価系についての特性を理論的に解析することがで
きた．
ただし，消化管の薬物吸収過程は多くの物理現象や生理的要因が複雑に絡み合ってい るため，吸収過程の全体を把握するには更なる検討が必要である．今後の検討において，
こうした吸収動態を精巧なモデルとして解明されていくことが期待される．本検討によ る胆汁酸ミセルの影響を中心とした吸収飽和現象の解析も，ヒトの吸収動態の解明に向 けて重要な基礎資料になるものと考えられる．
Assessment of absorption potential of a poorly soluble oral drug with an aim of efficient development
Koji Yano
Absorption saturation, a causal of insufficient exposure is one of the biggest developmental risks against a poorly soluble compound. For predicting absorption potential of such a compound, complicatedly intertwined absorption processes should be analyzed comprehensively. Such as solubilization in the gastrointestinal tract, uptake into bile acid micelle, diffusion and permeation into intestinal membrane are often analyzed. Quantitative analysis of free drug concentration and absorption processes on a drug substance after taken up into micelle is considered especially important for predicting absorption saturation of such a poorly soluble compound.
However, there are only few reported on this subject.
In this study, an in vitro system applicable to an early stage of drug development was validated for its predictivity of absorption saturation by using poorly soluble drugs, and applied to assessing developmental potential of a development candidate as an oral agent.
[１] Assessment development of gastrointestinal tract membrane permeability for poorly soluble compounds.
In vitro measurements of solubility and membrane permeability are important parameters for estimating absorption potential of a drug substance. Micelle is often added to suppress adhesion of a poorly soluble test material to experimental
apparatus that hinders accurate membrane permeability assessment – bile acid micelle is always present in the small intestine during absorption. An effect of the added micelle on membrane permeability was examined in order for calculating a true kinetics of membrane permeability. The membrane permeability decreased generally to the decrease of the free fraction was observed. These results suggested that further detailed examination be needed to elucidate the relationships between the membrane permeability and the decrease of the free fraction.
A dynamic dialysis method utilizing Dissolution/Permeation System (D/P
System) with parallel chamber, which can simulate the dissolution and permeation process of low solubility compound and estimate human absorption ratio, was developed in order to measure free drug fraction in the solution containing bile acid micelle. The membrane permeation mechanism was evaluated in detail by using this method in the presence of the micelle. Analysis of the relation between the
concentration of the micelle and membrane permeability of Caco-2 cell monolayer revealed two groups of compounds: one group of which membrane permeability decreased proportionately to the decrease of the free fraction, and the other of which permeability decreased, but not to the extent of the free fraction decrease. This result indicated the presence of a route that a drug substance once taken up into micelle is directly diffused (transferred) to the intestinal membrane.
The presence of the direct route newly discovered in this study potentially suggested that simple multiplication of free fraction in a micelle solution by membrane permeability velocity does not provide highly accurate absorption prediction of a poorly soluble compound.
[２] D/P System, a method to assess absorption potential of poorly soluble compounds
Using commercially available drugs as representatives of poorly soluble compounds, D/P System simulating the environment of the human small intestine was confirmed as a method to predict absorption saturation.
The results on Celecoxib and Cilostazole in the system indicated that their absorption rate decreased inversely to the increase of doses. The same trend was also observed in the clinical testing of each drug. This evidence confirmed that the system was able to highly accurately predict absorption saturation to which solubility in the gastrointestinal tract is a rate limiting step.
Absorption rate of Zafirlukast was mostly unchanged regardless the dose change in both D/P System and a clinical trial. Such drug substances were judged to have absorption characteristics to which dissolution rate is a rate limiting step.
These experiment proved that D/P System be an accurate method to assess absorption potential of poorly soluble drug substances.
[３] Quantitative assessment of developmental potential of a poorly soluble development candidate
ONO-5129 is highly lipophilic, therefore, poorly soluble. The compound was subjected to in vitro measurements of solubility, membrane permeability through Caco-2 cell monolayer, absorption assessment by D/P System, and in vivo rat PK study. These results were compared to the result of exposure saturation observed in human. Maximum Absorbable Dose (MAD), an index of maximum absorption calculable from solubility and membrane permeability of ONO-5129 underestimated the dose causing absorption saturation in human. On the other hand, the rat PK study did not result the saturation regardless the dose increase, therefore, could potentially overestimate absorption potential in human. The results proved that D/P System highly accurately predict of absorption saturation.
Regarding the food effect of ONO-5129 on absorption, which was found positive in human, in vitro solubility was found overestimated the effect in human. D/P system predicted with high accuracy the increase of exposure after food intake, which was proven in human.
D/P System can provide highly reliable evidences for assessing developmental potential of a poorly soluble compound like ONO-5129 that solubilization by bile acid governs its absorption.
As shown above, this study evaluated experimentally and theoretically the prediction of a dose causing absorption saturation whether it could be used in assessing developmental potential of a poorly soluble compound as to be an
appropriate method of candidate selection. This study made enable to theoretically analyze various in vitro and in vivo assessment systems by particularly centering at the effect of bile acid micelle on absorption of this kind of compounds.
Since intestinal absorption processes are intertwined complicatedly with numbers of physical and physiological factors, comprehensive understanding of them requires further studies that will refine this kind of absorption kinetics as an elaborate model.
The analysis of absorption saturation centered at the bile acid micelle discussed in this study will be essential for elucidating absorption kinetics in human.
目次
第1章 緒言 ... 1
第2章 難溶解化合物の消化管膜透過性の評価法の構築 ... 4
2-1 序 ... 4
2-2 ミセル包接と薬物の膜透過速度評価 ... 5
2-2-1 難溶解化合物の Caco-2細胞単層膜の透過性評価の課題(ミセル非共存下) ... 5
2-2-2 Caco-2細胞単層膜の評価系における可溶化剤添加の影響 ... 7
2-2-3 Free体濃度から算出したミセル共存下のCaco-2細胞単層膜の膜透過速度... 8
2-3 ミセル共存下の薬物の膜透過評価系の最適化 ... 10
2-3-1 難溶解化合物の人工腸液中のfree体分率の測定 ... 10
2-3-2 胆汁酸ミセルの濃度とfree体分率の算出 ... 11
2-3-3 動的透過法によるfree体分率の検証 ... 12
2-4 ミセル共存下での薬物の消化管膜透過過程の解析（Caco-2細胞単層膜を用いた検 討） ... 14
2-4-1 水平型チャンバーにおける非攪拌水層抑制に向けた攪拌速度の設定 ... 14
2-4-2 ミセルに包接される薬物のCaco-2細胞単層膜および半透膜における透過速 度 ... 15
2-4-3 透過速度におけるミセル溶液中の薬物の親油性の影響 ... 16
2-5 考察 ... 18
2-6 小括 ... 21
第3章 Dissolution/Permeation System（D/Pシステム）を用いた難溶解化合物の吸収 ポテンシャル評価 ... 22
3-1 序 ... 22
3-2 市販難溶解化合物の吸収飽和予測とその検証 ... 22
3-2-1 薬物の溶出に対する投与量の影響 ... 23
3-2-2 薬物の膜透過量に対する投与量の影響 ... 24
3-2-3 D/Pシステムによるヒト吸収率予測 ... 25
3-2-4 D/Pシステムおよびヒトの臨床情報における投与量増加に伴う吸収率低下 ... 27
3-3 難溶解化合物の投与剤型による吸収改善とD/Pシステムによる予測 ... 29
3-3-1 D/PシステムにおけるZafirlukastの溶出量および膜透過量に対する投与剤型 の影響... 29
3-3-2 各投与剤型におけるZafirlukastのラットin vivo曝露評価 ... 31
3.4 考察 ... 32
3.6 小括 ... 33
第4章 難溶解化合物の開発可能性の検証に向けた定量的評価 ... 35
4-1 序 ... 35
4-2 ONO-5129のin vitroパラメータ評価 ... 35
4-2-1 ONO-5129の物理化学的性質 ... 35
4-2-2 ONO-5129のin vitro Caco-2細胞単層膜の透過性 ... 36
4-3 ONO-5129のヒト吸収飽和予測と臨床の吸収飽和の比較 ... 36
4-3-1 In vitro パラメータからのONO-5129のMAD算出 ... 36
4-3-2 D/PシステムによるONO-5129の吸収率予測とその線形性 ... 37
4-3-3 ラットにおけるONO-5129のin vivo動態評価 ... 38
4-3-4 ONO-5129のヒトの臨床での動態評価結果 ... 39
4-3-5 ラットおよびD/PシステムによるONO-5129の吸収ポテンシャル評価の比 較 ... 41
4-4 ONO-5129の吸収における食事の影響 ... 42
4-5 考察 ... 43
4.6 小括 ... 44
第5章 総括 ... 46
実験の部 ... 49
謝辞 ... 66
参考文献 ... 67
本論文で使用した略語一覧表
ACAT Advanced compartmental absorption and transit
AUCinf Area under the plasma concentration-time curve from time zero to infinity
AUClast Area under the plasma concentration versus time curve from time zero to the last quantifiable
BA Bioavailability
BCS Biopharmaceutics classification system BSA Bovine serum albumin
CM Culture medium Cf Free ratio %
Cintestine Drug concentration in the lumen of small intestine CLabs Absorption clearance from small intestine
Cmax Maximum blood concentration
Cmicelle Drug concentration in the micellar phase Cs Concentration of solubility
Ctotal(0) Initial concentration of drug compartment Db Drug concentration in the micellar phase Df Free drug concentration
DMSO Dimethyl sulfoxide Dt Total drug concentration
EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FaSSIF Fed state simulated intestinal fluid
FaSSIFmod Modified simulated intestinal fluids (fasted state) FeSSIF Fasted state simulated intestinal fluid
FeSSIFmod6.5 Modified simulated intestinal fluids (fed state) HPLC High performance liquid chromatography HCO-60 PEG-60 hydrogenated castoroil
LC/MS/MS Liquid chromatography/mass spectrometry/mass spectrometry Mid (Fe–Fa) Intermediate in concentration between FeSSIFmod6.5 and FaSSIFmod
MAD Maximum absorbable dose Papp Apparent permeability
Papp(SIF) Apparent permeability in the presenceof micelles
Papp(TM) Permeability in TM solution Peff Permeability coefficients
Pfree Permeability based on free drug fraction
PK Pharmacokinetics
Pmicelle Permeability of direct partitioning of drugs from the micelle into the cell membrane
Pratio Permeability ratio describe the effect of micelles on drug
permeability
Ptotal Total permeability in two-phase models fraction of the drug
solubilized in micelles
SA Surface area of small intestine SD Standard deviation
SE Standard error
SITT Small intestinal transit time
TM Transport medium
Vr Volume of the receiver compartment
本論文は，学術雑誌に掲載された次の論文を主論文とするものである．
（１） Mechanisms of membrane transport of poorly soluble drugs: Role of micelles in oral absorption processes.
J. Pharm. Sci., 99(3), 1336–1345 (2010).
Koji Yano, Yoshie Masaoka, Makoto Kataoka, Shinji Sakuma, Shinji Yamashita
（２） Assessment of absorption potential of poorly water-soluble drugs by usin g the dissolution/permeation system.
Eur. J. Pharm. Biopharm., 85, 1317–1324 (2013).
Makoto Kataoka, Koji Yano, Yoriko Hamatsu, Yoshie Masaoka, Shinji Sakuma, Shinji Yamashita
（３） Evaluation of dose-dependent oral absorption of a newly developed drug candidate: In vitro-in vivo correlation.
J. Drug Deliv. Sci. Technol., 31, 160–166 (2016).
Koji Yano, Makoto Kataoka, Shizuka Ono, Makoto Hiramatsu, Ichiro Matsumoto, Soonih Kim, Haruki Higashino, Shinji Sakuma, Shinji Yamashita
第1章 緒言
医薬品の多くは経口投与され，薬物が体循環へ移行することで薬効を発現する．経口 的に投与された薬物が消化管から吸収されるためには，まず，消化管内で薬物が溶解す る必要がある．難溶解化合物はその溶解度の低さに起因して，吸収率の低下，食事の影 響による吸収性の変動，投与量に応じた負の非線形性など，薬物吸収に様々な問題を引 き起こす可能性がある．近年の創薬過程では，標的とするレセプター等に対する高い
affinity を持った化合物へと合成展開されるため，多くの新規化合物は，分子量が大き
く水に対する溶解度が極めて低くなることが報告されている(1, 2)．こうした難溶解の化 合物を医薬品候補化合物とした場合，化合物の低溶解性が原因となった吸収率の低下や 血中曝露の負の非線形が問題となり，開発の失敗につながる可能性がある．
経口剤開発の成功確率の向上を目指して，1990 年代後半から難溶解の課題に対する 取り組みが本格化した．その対応の一つとして，合成化合物リスク評価として中性緩衝 液への溶解性スクリーニングが行われるようになり，リスクが高い難溶解化合物を創薬 初期より排除することが可能となった(3-5)．
ただし，最終的に開発候補化合物を選択する場合には，より精度の高いリスク判断が 必要とされる．例えば，Fig.1 に示すように難溶解化合物は消化管内で完全に溶解され る上限以上の投与量（Fig.1では約100 mg）において，吸収量の飽和および吸収率の低 下が起きる．したがって，吸収飽和が起こるまでの投与量の範囲内に臨床投与量が設定 できれば，難溶解に基因した薬物吸収の問題は起きにくいと判断できる．つまり化合物 の溶解度が律速となって吸収量が飽和する投与量（吸収ポテンシャル）を見積もり，実 際の臨床投与量との位置関係を確認することが，難溶解化合物の開発可能性の判断にと って重要となる．
Fig. 1 Dose dependency in the gastrointestinal absorption of low solubility compound.
0 100 200 300
0 100 200 300
Absorption amount (mg)
Dose (mg)
Dose vs absorption amount
0 25 50 75 100
0 100 200 300
Absorption ratio (%)
Dose (mg)
Dose vs absorption ratio
小腸からの薬物吸収速度は，小腸管腔内で溶液として存在していた薬物濃度(Cintestine) と，小腸膜に対する薬物の膜透過性 (P)の積として表されるため，薬物の溶解度と膜透 過速度が共に重要であることがわかる．
薬物吸収速度 =Cintestine × P ・・・・Eq. (1)
経口投与後吸収された薬物の量は，Eq. (1) を投与後の時間と小腸の長さに対して積 分することによって求められる．ここで，小腸からの吸収が一次速度に従い，小腸の管 腔内は良く攪拌されており，また薬物の膜透過性は小腸全ての部位で同じと仮定すると，
投与後t時間までの薬物吸収量は
薬物吸収量 0 abs
0t Cintestinedt×P⋅S AUCt ×CL
=∫ ＝ ・・・・Eq. (2)
となる．式中，CLabs は小腸全体からの吸収クリアランスであり，膜透過性に小腸膜 の総面積 (S）をかけた値である，AUC0tは小腸内で溶解していた薬物の濃度―時間曲 線下面積であり，時間 t を小腸内での薬物滞留時間と考えると，Eq. (2) は投与後の総 吸収量を表すことになる．したがって，難溶解に起因した吸収飽和のリスクを判断する 場合，化合物の溶解性のみでなく，その小腸膜透過性に関しても十分な評価が必要とな る．
また，薬物の溶解性に基因した吸収量の低下は，Fig.1 のように薬物の溶解度が律速 となった吸収率の飽和と薬物の溶解速度が律速となった吸収率の低下の２種類の律速過
程がある(6-8)．溶解速度が律速となった吸収率の低下は，投与量に依存しない一定の吸
収率の低下が確認される．
一方，消化管内液中には内因性，外因性の様々な成分が混在する．特に胆汁酸やレシ チンなどの脂質は混合ミセルを形成し，薬物をミセルの中に取り込むことで，その見か け上の溶解度や溶解速度が上昇することが知られている(9-11)．ただし，胆汁酸ミセルは 難溶解化合物をミセル内に包接することで可溶化するが，ミセルに包接された薬物が直 接的に吸収に寄与するのか，あるいは寄与する場合どの程度の吸収が可能かに関しては 十分な情報が得られていない．
これら消化管環境を踏まえた上で，難溶解化合物の吸収に関連するパラメータを精度 よく算出するためには，ミセル共存下で薬物の溶解性および膜透過性に関する情報取得
と解析法を最適化する必要がある．これまで消化管液中でミセルに包接された薬物に関 して，free 体で存在している薬物濃度やその吸収機構について，実験的に検証した報告 はほとんど提出されていない．こうした点を科学的に解明することは，難溶解化合物の 吸収飽和を予測する上で重要である．さらに，難溶解化合物の複雑な吸収動態を総合的 に評価することで予測精度が高まることが期待される．
そこで本研究では，難溶解化合物の吸収性評価に関し，消化管環境を踏まえた膜透過 評価の最適化を試みた．さらに創薬初期段階に利用可能な in vitroシステムを用いて難 溶解化合物の吸収飽和を予測し，その経口剤開発の可能性の検証を試みた．
以下，得られた結果を3章にわたり論述する．
第2章 難溶解化合物の消化管膜透過性の評価法の構築 2-1 序
固形製剤として経口投与された薬物が血液中へ吸収されていくためには，まず消化管 内溶液中に薬物が溶解し，その後消化管粘膜を透過する必要がある．Amidon らはこう した薬物の吸収プロセスおよびその結果としての吸収率を，absorption number, dose number および dissolution number とよばれる３つのパラメータによるモデルによっ て説明可能であることを示した(12)．このような研究成果に基づき，経口投与後の薬物の 吸収率は溶解や膜透過に関連した情報を用いてシミュレーションされるようになり，
ACAT（Advanced compartmental absorption and transit）モデルによって構築され た GastroPlus®は多くの製薬メーカーで使用されている(13-15)．
薬物の吸収過程について理論的かつ数学的な解釈(16-18)が進歩しているものの，シミュレ ーションによる吸収ポテンシャルの予測精度を高めるためには，in vivo の現象を的確 に反映したパラメータをあてはめる必要がある．薬物の膜透過性に関するパラメータを
in vitroにおいて評価する手法の一つとして，ヒト大腸癌由来の培養細胞であるCaco-2
細胞よりなる単層膜が広く用いられている(19-20)．当試験は，Caco-2 細胞を培養するこ とで細胞間のタイトジャンクションが形成された単層膜を用い，薬物透過量より細胞膜 の透過係数を算出することで，ヒト小腸の透過性を見積もることができる．ただし，
Caco-2 細胞単層膜を用いた膜透過評価の問題点の一つとして，難溶解化合物の膜透過
性を評価する際には，膜透過性の測定に十分な濃度の薬液の調製が困難であり，また，
その様な薬物では，薬物の装置への吸着や粘膜滞留が大きな課題となり真の透過速度を 評価できないことが報告されている(21)．これら課題の回避にむけて，ミセルを含む可溶 化剤を評価系に添加し，高濃度の薬液を調製すると同時に薬物の装置への吸着や粘膜滞 留を抑制することが試みられている．しかしながら，化合物がミセルの包接にされた場 合，膜透過に寄与する薬物は溶液中にfree体として存在している部分と考えられるため
(22)，ミセル添加時の膜透過速度は真の膜透過速度とは異なる．
さらに，実際のin vivoでの吸収においても，食後には胆のうから分泌される胆汁酸 ミセルの共存によって，難溶解化合物の吸収が促進されることが報告されている(23, 24)． しかしながら，胆汁酸ミセル共存下における薬物の膜透過速度については，概念や仮説 によって論じられているものが多く，実験的に検証された例は少ない．
以上のように，化合物の真の膜透過速度を算出するためには，実際のin vivoの胆汁 酸ミセル共存下でのミセルに包接された薬物とfreeの薬物との存在比，それらの膜透過 への寄与に関する情報が重要である．
本章では，難溶解化合物の膜透過評価の課題として，ミセル共存下での難溶解化合物 に膜透過機構を明らかにし，難溶解化合物の吸収における胆汁酸ミセルの役割を解明す ることを試みた．
2-2 ミセル包接と薬物の膜透過速度評価
2-2-1 難溶解化合物の Caco-2細胞単層膜の透過性評価の課題(ミセル非共存下) 経口投与後の吸収が溶解律速となることが知られている Griseofulvin, Danazol, Albendazole の 3 種の薬物を難溶解のモデル薬物として用いた． Hidalgo らの方法に従 ってCaco-2細胞単層膜を用いた各薬物の膜透過性を評価した(25)．Fig.2は，通常の透過 実験に用いる Transport medium（TM: HBSS supplemented with 25mM glucose,
pH=6.5）を溶媒とした場合の結果を示している．それぞれの薬物を10 μg/mLの濃度で
溶解させた TMをApical側に添加後，Apical側（左図）およびBasal側（右図）の溶 液中の薬物濃度を測定した．なお，Albendazole については，10 μg/mL の溶液を調製 するため，メタノールに 250 mg/mL で薬物を溶解させた後，TM で薬物濃度が 10 μg/mLとなるように希釈した．また，Basal溶液には，本章で行うin vitroでのすべて の実験において，常に 4.5%のBSA を添加することとした．これは，Basal側での薬物 の十分な溶解度を確保し，シンク条件下で膜透過を測定するためである．
A Co dt Papp dM
× ×
= 1 ・・・・・Eq. (3)
Papp : 膜透過係数(cm/sec) dM/dt : 膜透過速度(nmol/min) Co : 初濃度(μM)
A : 有効表面積(4.2cm2)
Fig. 2 Time course of apical and basal concentration of three drugs in permeation experiments in Caco-2 monolayer
Table 1 Permeability of the three drugs in Caco-2 monolayer permeability study
いずれの薬物においても，Apical 側添加後，Basal 側の薬物濃度が経時的に増加した．
その増加速度より，Eq.(3) に従って算出した各薬物の膜透過性をTable 1に示す．本実 験で得られた膜透過性は，Griseofulvin で最も高く，また Albendazole，Danazolにお いても 10 ×10-6 cm/sec 以上と比較的高い値となり，これら薬物が消化管膜に対して良 好な透過性を示すことが明らかとなった．しかしながら，同時に測定した Apical 側の
濃度は，Danazol において添加後急激に減少し，測定開始 5 分後には添加濃度の 20%
以下となった．この時点で Basal 側に出現した Danazol 量は極めて僅かであったこと
から，Apical側濃度の急激な減少は，Danazolが細胞膜表面，あるいは実験器具へ速や
かに吸着したためと推察された．この様な非特異的な吸着が生じた場合，Apical 側薬物 濃度が常に一定と仮定した Eq.(3)では，正確な膜透過速度が算出できない可能性が考え られる．
そこで，膜透過実験終了後に Apical 側，Basal 側および細胞中に存在した薬物量を 測定し，それぞれの薬物の全体回収率および薬物の分布の内訳を Fig. 3 に示した．
Griseofulvin の回収率はほぼ 100%であり，Apical 側，Basal 側の溶液中に同程度存在 した．これに対し Danazol においては回収率が 20%程度と極めて低く，細胞中薬物量 を加えても添加薬物が全量回収されなかったことから，これら薬物では器具等への著し い吸着が生じたものと推察された．
Fig. 3 Amount of drugs in apical and basal solution and Caco-2 cell after permeation experiments
そこで次に，薬物の十分な溶解度を確保するとともに，器具等への非特異的な吸着を 防止し，真の膜透過性を算出することを目的に，可溶化剤を用いた検討を行った．
2-2-2 Caco-2細胞単層膜の評価系における可溶化剤添加の影響
まず，代表的な可溶化剤である DMSO と HCO-60 を添加した場合の Caco-2 細胞単 層膜の透過性を測定した．各可溶化剤添加濃度は1%とした．得られた回収率をTable 2 に，また膜透過性をTable 3に示した．回収率はHCO-60添加時には，Danazolにおい てもほぼ 90%の薬物が回収されたことから，非特異的な吸着が顕著に抑制されることが 確認された（Griseofulvin では回収率は約 100%）．回収率に対する DMSO の効果は，
Danazol では Control に比べて DMSO 添加時の回収率が有意に上昇したが，その効果
はHCO-60添加を下回った．
Table 2 Eeffect of solubilizing agent on total recorvery in Caco-2 permeability study Griseofulvin Danazol
Control 98.47±7.55 18.46±0.75
DMSO 101.11±6.57 34.00±2.98
HCO-60 108.09±2.82 88.82±1.86
Recovery (%)
一方，Table 3 に示した様に，膜透過性については，DMSO を添加した場合には
Danazol の 値 が 可 溶 化 剤 無 添 加 （Control） 時 に 比 べ て 有 意 に 上 昇 し た も の の ，
Griseofulvin では有意な変化は認められなかった．一方，HCO-60 を添加した場合には，
Griseofulvinでは1/2，Danazolでは1/3程度まで低下することが明らかとなった．
Table 3 Solubilizing agent on permeability across Caco-2 monolayers (×10-6 cm/sec) Griseofulvin Danazol
Control 54.05±2.52 10.22±0.37
DMSO 52.04±1.44 18.75±0.32
HCO-60 25.70±0.20 3.53±0.33
可溶化剤の中でも，DMSO の様な混合溶媒はコソルベント効果によって溶媒への溶 解度を高める．これに対し，HCO-60 などの界面活性剤は，そのミセルに薬物を取り込 むことによって見かけの溶解度を上昇させる．本章における検討では，難溶解化合物の 吸着を防止することを目的として可溶化剤を添加しているため，実験に用いた薬液は飽 和溶解度以下で調製されている．したがって，ミセルやエマルション中に薬物が取り込 まれた場合，溶液中のfreeの薬物濃度が低下することになる．実際に膜透過に寄与する 薬物はこの様な可溶化剤に取り込まれていないfreeの薬物であると考えられることから，
HCO-60 等の可溶化剤によって薬物の膜透過性が低下した理由として，薬液中の free
の薬物濃度の割合が低下したためと推察される．
特に Danazol のような装置への吸着が大きい難溶解化合物の場合，装置への薬物の
吸着を抑制するには HCO-60 のようなミセルを添加する必要がある．ただし，界面活 性剤添加によって膜透過評価を実施した際には，腸液中にfree体として存在する溶解度 を 測 定 し ，free 体 に よ る 真 の 膜 透 過 速 度 に 換 算 す る 必 要 が あ る ． そ こ で ， Griseofuluvin とDanazolについて， HCO-60共存下の free体濃度を測定し，真の膜 透過速度を調べた．
2-2-3 Free体濃度から算出したミセル共存下のCaco-2細胞単層膜の膜透過速度
ミセル共存下の見かけ上の膜透過速度をミセル溶液中のfree体の濃度で補正すれば，
ミセル非共存下の膜透過速度（真の膜透過速度）と同等になると考えらることから，半 透膜を用いた平衡透析法によりミセル (HCO-60) 共存下のfree体分率 (Cf) を測定し た．平衡透析法とは薬物のような低分子は半透膜を自由に通過するが，ミセル等に取り 込まれた薬物は半透膜を透過しないという現象を利用したものである．
Dt 100 100 Df ) Db Df (
Cf = Df × = ×
＋ ・・・・・Eq. (4)
Cf : freeの薬物%（フリー体分率） Db : 取り込まれた薬物濃度
Df : freeの薬物濃度 Dt : 全薬物濃度
Table 4 Free drug fraction in the presence of HCO-60 Griseofulvin 0.295
Danazol 0.008
Griseofulvin，Danazolの膜透過性を顕著に低下させたHCO-60 を用いて平衡透析を 行い，Eq. (4)によって算出したfreeの薬物濃度をTable 4に示した．全薬物量に対する free の薬物の割合は，Griseofulvin では 30%程度であったのに対して，Danazol では 1%以下と非常に低い値であった． HCO-60 添加時の真の膜透過性を求めるために，
Apical側でのfree の薬物濃度を基準とした膜透過係数PfreeをEq. (5)に従って算出し，
その結果をTable 5にまとめた．なおTable.5のHCO-60を添加していないControl値 は，化合物の装置への吸着が安定していると考えられる実験開始 5 分後の Apical 側の 化合物濃度をCo初濃度としてEq.(3)より算出した．
Cf
Pfree= Papp ・・・・・Eq. (5)
Pfree : permeability based on free drug fraction Papp : Apparent permeability
Cf : free drug (%)
Table 5 Permeability of Griseofulvin and Danazol across Caco-2 monolayers on free drug fraction (×10-6 cm/sec)
Control HCO-60
Griseofulvin Papp 54.05±2.52 25.62±0.19
Pfree 86.85±0.64
Danazol Papp 75.19±2.69 4.16±0.39
Pfree 526.58±49.37
Table 5に示したように，今回得られた結果では，特にDanazolにおいてfree体濃度 から換算した膜透過速度が大きく上昇していた．ミセルに取り込まれた薬物は膜透過に 寄与しないと考えた場合，ミセル非共存下における膜透過性を示すControlのPappと，
HCO-60共存下のfree体濃度から換算した膜透過速度を示すPfreeの値が一致すること
が妥当である．Table 5の結果は，難溶解化合物の膜透過パラメータを算出する場合，
薬物によっては今回用いた膜透過評価法に課題があることが示唆された．Controlの PappとHCO-60共存下のPfreeの不一致を招いた原因として，ミセルの共存によって
Caco-2細胞単層膜近傍の薬物拡散速度が向上し，薬物の透過速度を抑制する非攪拌水
層の影響が低下した結果，見かけ上の膜透過速度が向上した可能性(26)が考えられる．ま たは，ミセルに取り込まれた薬物が直接細胞膜に分配することで見かけ上の膜透過速度 が向上した可能性も考えられる．ただし，実際のヒトの小腸内にも胆汁酸ミセルが存在 しているため，HCO-60などと同様にミセル共存下の膜透過性に留意する必要がある．
したがって，難溶解化合物のin vivoでの膜透過性を評価するためには，ミセル共存下 における薬物の膜透過過程を明らかにした上で，評価系を最適化することが必要と考え られた．
2-3 ミセル共存下の薬物の膜透過評価系の最適化
2-3-1 難溶解化合物の人工腸液中のfree体分率の測定
2-2の検討より，難溶解化合物の真の膜透過速度を算出するためには，ミセル共存下 のfree体分率の測定，非攪拌水層の影響の低減が必要であることが示唆された．2-2の 検討では平衡透析法によってミセル溶液中のfree体分率を測定したが，平衡透析法では ミセル構成成分も半透膜を通過しReceiver 側にもミセルを形成することで，free体分 率を正確に測定できていなかった可能性がある．そこで，胆汁酸ミセル共存下と非共存 下における半透膜の透過速度比によって，free体分率の算出を試みた．今回の膜透過試
験ではFig. 4に示す水平型チャンバーを用いた．本システムでは，その中央に半透膜あ
るいはCaco-2細胞単層膜を装着することが可能であることから，Caco-2単層膜を用い
た膜透過試験と同じ条件下で，半透膜を用いたfree体分率の測定が可能である．
薬物の見かけ上の膜透過速度を抑制する非攪拌水層の影響を低減するためには，
Apical相およびBasal相共に薬液を攪拌することが重要となるため，水平型チャンバ
ーのスターラーで水相を攪拌し評価した(Fig. 5)．また，膜透過評価におけるミセルの 影響はその構成成分によって異なる可能性があるため，実際のヒト小腸環境に模した胆 汁酸ミセル共存下(27, 28)で膜透過速度を評価することとした．
Caco-2 monolayer or Dialysis membrane
Fig. 4 Dissolution / Permeation system (D/P system：Parallel chamber )
2-3-2 胆汁酸ミセルの濃度とfree体分率の算出
Apical側に添加する胆汁酸ミセル溶液として，タウロコール酸とレシチンを含む人工
腸液であるFaSSIFmod（空腹時），FeSSIF mod6.5（食後）とMid (Fe-Fa)（空腹時と食 後の中間の濃度）を用いた（Table 6）．
Table 6 Simulated intestinal fluids used in the Parallel chamber
pH Taurocholate Lecithin Osmolality (mOsm)a
TMb 6.5 ― ― 306.3 ± 0.6
Simulated intestinal fluid (SIF)c
FaSSIFmod 6.5 3 mM 0.75 mM 311.7 ± 0.6
Mid (Fe-Fa)d 6.5 9 mM 2.25 mM 318.7 ± 1.0
FeSSIFmod6.5 6.5 15 mM 3.75 mM 325.7 ± 0.6
a Osmolality was measured by OSMOSTAT (OM-6040, ARKARY).
b TM; Transport medium (HBSS supplemented with 25mM glucose).
c From Kataoka et al.11
d Mid (Fe-Fa); Intermediate in concentration between FeSSIFmod6.5 and FaSSIFmod.
これらの溶液を用いて，ミセル濃度の上昇に伴う半透膜の透過速度低下率について以 下の式により解析を実施した．
膜透過速度は式Eq. (6) を用いて算出した．
A C
Vr dt
P dCr
total
app = ⋅ ×
) 0 (
・・・・・Eq. (6)
Papp :見かけ上の透過速度(cm/sec)
dt
dCr :時間に対する薬物透過量の傾き Vr :Apical相の容積(cm3)
Ctotal(0) :Apical相の薬物濃度の初濃度
A :透過膜の有効表面積
また，半透膜を用いて評価された膜透過速度において，半透膜を通過する薬物はfree 体のみと仮定して，見かけ上の透過速度はEq. (7) で示される．
) 0
C (
C P P
total free free app
= ⋅ ・・・・・Eq. (7)
胆汁酸ミセル共存下において半透膜を透過する薬物は，胆汁酸ミセル非共存下の透過 速度に対する濃度比（Cfree/Ctotal）に相関する．実際Cfree濃度は直接的に測定できない ため，ミセルが存在しないTM溶液でのPapp（TM）とミセル溶液でのPapp（SIF）の 透過速度の違いを比として算出することでfree体分率として換算したEq.(8) ．なお，
新たに開発した半透膜を用いたfree体分率の測定法を動的透過法と命名した．
f C
C P
P P
total free TM
app SIF app
ratio = = =
) 0 ( )
( )
( ・・・・・Eq. (8)
2-3-3 動的透過法によるfree体分率の検証
水平型チャンバーを活用した動的透析法によって算出されるPratio値を，free体分率 との活用する妥当性を検証するために，本法と溶解度測定法によって算出されるfree 体分率について比較した．
薬物の溶解度によってfree体分率を算出する方法は，PoelmaやKatneniらによっ て報告されている（29, 30）．本法は，ミセルを含まない溶液の飽和溶解度（溶液にfree体 で存在する濃度）とミセル混合溶液の飽和溶解度（ミセルに含包されることで可溶化さ れた濃度）の情報からfree体分率を概算する手法である．溶解度法によるfree体分率 は以下の式で示される．
( )
+
−
+ −
= C
C
s C ・・・・・Eq. (9)
C+ ：ミセルに溶解された薬物の飽和溶解度 C－ ：TMへの薬物飽和溶解度
s
f =1− ・・・・・Eq. (10) ｓ ：ミセルによって可溶化された薬物分率
f ：ミセル溶液中のfree体分率
Griseofulvin の溶解法によって測定された FaSSIFmod，Mid (Fe-Fa)，FeSSIFmod6.5
における free 体分率（freeratio）と，半透膜を用いた動的透過法によって評価した Pratio
を比較した (Table 7）．
Table 7 Free ratio and permeability ratio for Griseofulvin
TM FaSSIFmod Mid(Fe-Fa) FeSSIFmod6.5
Freeratioa 1.00 0.75 0.50 0.35
Pratiob 1.00 0.84 0.68 0.46
a Freeratio is calculated by Eq. (9, 10)
b Pratio is calculated by Eq. (8)
動的透過法によって測定されたPratioは，溶解度測定法によって算出されたfreeratioと 比較して相対的にやや高い値を示したが，ミセル濃度の上昇に伴ったfree体分率の低下 についてほぼ同等の推移を示した．
さらに，胆汁酸共存下ミセル共存下ミセル共存下の半透膜への薬物透過性に対する 影響を評価した．胆汁酸ミセルには取り込まれないことが報告されている(29)
Theophyllineを用いて，胆汁酸ミセル共存下のPratioを評価した．結果として，
FaSSIFmod と FeSSIFmod6.5 におけるPratio はそれぞれ1.04 と 1.02であり，胆汁酸ミ セルに取り込まれないTheophyllinの半透膜への透過に対して，ミセルの影響は確認さ れなかった．したがって，胆汁酸ミセルはfree体として存在する薬物の半透膜透過に 影響を与えないことが確認できた．今後の検討では，胆汁酸ミセル溶液中のfree体分 率は動的透過法によって得られるPratioを使用することとした．
