スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリ

2 オ

4. スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリ

に十分浸ることを確認して下さい。

5. 圧力鍋のふたをしてロックし（ロックピンが上がります），圧力インジケーターバルブが上がるまで約 4 分間加熱します。その後 1 分間加熱を続けます。

6. 圧力鍋を熱源から外し，ふたの上から冷水を流しかけます。ロックピンが下がったことを確認してからふたを開け，直ちにスライドガラスを蒸留水に浸します。

ロックピンが下がるまで，決してふたを開けないで下さい。

7. TBS（pH 7.6）で 5 分間洗浄します。

8. 1.5％過酸化水素水／メタノール中で 10 分間インキュベートします。

9. 蒸留水で 5 分間 ×2 回洗浄した後，TBS で 5 分間 × 2 回洗浄します。

10. 免疫組織染色を行います。

パラフィン包埋組織

1. 組織を薄切し，VECTABOND（VECTOR LABORATORY 社：#SP-1800）などで表面処理を施したスライドガラスに接着させます。

2. 脱パラフィン処理を行い，脱イオン水で水和します。

3. 1,600 ml の 0.01 M クエン酸ナトリウムバッファー

（pH 6.0）をステンレス製の圧力鍋に加え，ホットプレートなどの熱源で沸騰させて下さい。その際，圧力鍋にふたをしますが，ロックしないで下さい。

4. スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリウムバッファーに十分浸ることを確認して下さい。

5. 圧力鍋のふたをしてロックし（ロックピンが上がります），圧力インジケーターバルブが上がるまで約 4 分間加熱します。その後 1 分間加熱を続けます。

6. 圧力鍋を熱源から外し，ふたの上から冷水を流しかけます。ロックピンが下がったことを確認してからふたを開け，直ちにスライドガラスを蒸留水に浸します。

7. 以下，「EDTA を用いた HIER」の操作 7. 〜 10. と同様です。

圧力鍋の仕様，各部名称は製品により異なります。必ず製品添付の取扱い説明書を確認し，高温，高圧に注意して使用して下さい。

切片がスライドガラスから剥離するのを防ぐため，

VECTABOND（VECTOR LABORATORY 社：#SP-1800）などの接着試薬を使用して下さい。接着後は 37℃で一晩乾燥させた後，56℃で 60 分間乾燥させることを推奨します。

抗原賦活化処理を行う場合，試料切片が剥離しやすくなるため，スライドガラスへの接着性を高める必要があります。また，処理条件によっては，凍結組織切片やアルコール系で固定した組織には適さない場合があります。処理時間，温度，pH は，使用する電化製品ごとに全て最適化する必要があります（ウォーターバスの場合： 92 〜 95℃で 5 〜 10 分間，圧力鍋の場合：120℃で 1 〜 5 分間など）。

処理条件を最適化するためには，時間，温度，pH の条件を変えて組み合わせたマトリックス表を作成し，予備実験を行って下さい。

R&D Systems 社では，pH および組成の異なる 3 種類の HIER 用抗原賦活化試薬「Antigen Retrieval Solution」を取り扱っています。

1 分間 Slide #1 Slide #2 Slide #3 5 分間 Slide #4 Slide #5 Slide #6 10 分間 Slide #7 Slide #8 Slide #9 Antigen Retrieval Solution を用いた HIER の処理時間および pH 最適化のための条件組み合わせ表。上記 9 種の HIER を行ったスライドと，HIER 未処理の 10 枚目のスライドの染色結果を比較する。同様の予備実験を温度についても実施する。

その他にも多数の抗原賦活化試薬があります。製品の詳

細については，p.108 〜をご覧下さい。

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Ａ酵素マイクロポリマー染色法

酵素マイクロポリマー染色法

　免疫染色ガイド2014‑2015

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A-1 ^ー

ー

マイクマーシステムステッバック

ランドマスサバーサタイ

◆ ImmPRESS Reagent は，VECTOR 社独自の酵素マイクロポ

リマーで，高活性かつ高密度のペルオキシダーゼ（PO）と二次抗体が結合しています。

◆ 巨大デキストランや高分子ポリマーを酵素ポリマーの骨格とし

て用いたシステムに比べ，標的となる一次抗体に容易に結合するため，非特異的結合も低く抑えられています。その結果，低バックグラウンドで高感度な染色像が得られます。

◆ 吸収処理済みの製品もあります（#MP-7422，#MP-7444）。

◆ 試薬は便利な滴下瓶に入っており，調製済みのため希釈する必

要はありません。

◆ 15 ml で約 150 枚，50 ml で約 500 枚の組織切片を染色可

能です（切片 1 枚に約 100 μl 使用）。

※ ペルオキシダーゼ基質は含まれていません。別途ご用意下さい

（p.91 参照）。

高感度！

小腸組織染色像

一次抗体抗サイトケラチン 8/18 抗体

二次抗体左：ImmPRESS Anti-Mouse Ig（#MP-7402）

右：他社類似製品

小腸の連続組織切片で免疫組織染色を行い，二次抗体に ImmPRESS Reagent を用いた場合と，他社の巨大デキストランペルオキシダーゼポリマー標識抗体を用いた場合で比較した。

一次抗体は同一のものを使用し，基質は DAB（茶色）を用いた。対比染色はヘマトキシリン（青色）で行った。ImmPRESS Reagent を用いた場合の方が高感度で鮮明な染色像が得られた。

低バックグラウンド！

乳がん組織染色像（一次抗体未使用）

左：ImmPRESS Anti-Mouse Ig（#MP-7402）

右：他社類似製品

乳がんの連続組織切片に ImmPRESS Reagent と，他社の巨大デキストランペルオキシダーゼポリマー標識二次抗体のみをそれぞれ反応させ，

DAB基質を用いて染色を行い（茶色）バックグラウンドの高さを比較した。対比染色はヘマトキシリン（青色）で行った。

ImmPRESS Reagent を用いた場合の方がバックグラウンドが低かった。

鮮明な染色像 !

ラットモノクローナル抗体を用いて組織染色を行った。二次抗体はいずれも ImmPRESS Anti-Rat Ig (#MP-7404）を使用し，異なる基質で染色した。

扁桃腺組織染色画像一次抗体：抗 CD3 ラットモノクローナル抗体

基質：ImmPACT VIP（#SK-4605）（紫色）

対比染色：Vector Methyl Green（#H-3402）

（緑色）

一次抗体：抗 CD45 ラットモノクローナル抗体基質：ImmPACT NovaRED（#SK-4805）（赤色）

対比染色：Vector Hematoxylin QS（#H-3404）

（青色）

ImmPRESS Reagent 略

1 一次抗体を加える 2 ImmPRESS Reagent を加える 3 酵素基質を加える

※ 本製品の図解操作マニュアル（日本語）を p.48 に掲載しています。またフナコシホームページ（http://www.funakoshi.co.jp/

products̲faq/vl̲jp̲manual）からも PDF 版をダウンロードできます。

酵素マイクロポリマー染色法

　免疫染色ガイド2014‑2015

1 / / 11: :1

メーカーコード（）名

VEC ImmPRESS Reagent

追 MP-7405 15 ml 22,000 Anti-Goat Ig

MP-7402-15 15 ml 20,000 Anti-Mouse Ig

MP-7422 15 ml 39,000 Anti-Mouse Ig, Rat Adsorbed MP-7500-15 15 ml 30,000 Anti-Mouse/Rabbit Ig, UNIVERSAL MP-7401-15 15 ml 20,000 Anti-Rabbit Ig

MP-7444 15 ml 39,000 Anti-Rat Ig, Mouse Adsorbed

組織切片約 150 枚分。ブロッキング用 2.5％正常ウマ血清（#MP-7444 のみヤギ血清）添付。

吸収処理：Rat（#MP-7422），Mouse（#MP-7444）

メーカーコード（）名

VEC ImmPRESS Reagent

MP-7405 50 ml 44,000 Anti-Goat Ig MP-7402-50 50 ml 44,000 Anti-Mouse Ig

MP-7500-50 50 ml 66,000 Anti-Mouse/Rabbit Ig, UNIVERSAL MP-7401-50 50 ml 44,000 Anti-Rabbit Ig

MP-7404 50 ml 59,000 Anti-Rat Ig

組織切片約 500 枚分。ブロッキング用 2.5％正常ウマ血清（#MP-7404 のみヤギ血清）添付。

マイクマーブッンットシナ

Ready-to-use フーマット

◆ 使用する一次抗体の免疫動物種により，マウス用またはウサギ

用の製品があります。

◆ キットには，抗マウス／ウサギ Ig 抗体（Ampliﬁer

Antibody）と，酵素標識マイクロポリマー，ブロッキング用血清などが含まれています。

◆ 試料をお手持ちの一次抗体（マウスまたはウサギ由来）と反応

させた後，Ampliﬁer Antibody（抗マウスまたは抗ウサギ Ig 抗体）と反応させます。その後，酵素標識マイクロポリマーを用いて免疫染色を行います。

◆ Ampliﬁer Antibody を介することにより，酵素標識マイクロ

ポリマーのみで染色を行うよりもシグナルが増幅されます。

◆ キットに含まれる抗体はすべてアフィニティ精製済みのため，

高感度かつ低バックグラウンドな染色が行えます。

◆ 1 キットで切片約 150 枚の染色が可能です（試薬 100μl ／切

片）。

1 一次抗体を加える 2 Ampliﬁer Antibody を加える

3 ImmPRESS polymerReagent を加える 4 酵素基質を加える

マス大

一次抗体：抗 CD34 マウスモノクローナル抗体（#VP-C345）

基質：DAB（茶色）

対比染色：Hematoxylin（青色）

ット

● BLOXALL endogenous enzyme blocking solution

● 2.5％ normal horse serum

● Ampliﬁer antibody （goat-anti mouse / rabbit Ig）

● ImmPRESS Excel polymer reagent （horse anti-goat Ig）

● ImmPACT DAB EqV

reagent 1 （Chromogen） / 2 （Buffer）

※

キットに一次抗体，バッファー類は含まれていません。別途ご

用意下さい。

酵素マイクロポリマー染色法

　免疫染色ガイド2014‑2015

1 / / 11: :1

略

パラフィン包埋切片：脱パラフィン後，キシレンなどで水和処理を行う。

凍結切片，細胞試料：必要に応じてアセトン，その他の固定液で固定する。

※

必要に応じて，抗原の賦活化を行って下さい。VECTOR 社の抗原賦活化試薬 Antigen Unmasking Solution をお勧めします。

※

内在性ペルオキシダーゼの不活化には BLOXALL endogenous enzyme blocking solution を使用してください。

バッファーで洗浄後，Normal Horse Serum を添加し，20 分間インキュベートする。

一次抗体と反応させた後，バッファーで洗浄する。

Ampliﬁer Antibody を添加し，15 分間インキュベートした後，バッファーで洗浄する。

ImmPRES Excel Polymer Reagent を添加し，30 分間インキュベートした後，バッファーで 2 回洗浄する。

ImmPACT DAB EqV

を添加し，2 〜 10 分間インキュベートした後，バッファーで 2 回洗浄する。

観察する。

マスモノクーナマスマイクマー

システムステッバックランド

◆ VECTOR 社独自の酵素マイクロポリマーで，高活性かつ高密

度のペルオキシダーゼと二次抗体が結合しています。

◆ 巨大デキストランや高分子ポリマーを酵素ポリマーの骨格とし

て用いたシステムに比べ，標的となる一次抗体に容易に結合するため，非特異的結合も低く抑えられています。その結果，低バックグラウンドで高感度な染色像が得られます。

◆ 特別なブロッキング試薬を用いることで，内在性マウスイムノ

グロブリンの非特異的染色によるバックグラウンドを減少させ，目的の抗原を特異的に染色できます。

◆ 凍結切片とパラフィン包埋切片の両方に使用できます。

◆ 試薬は便利な滴下瓶に入っており，調製済みのため希釈する必

要はありません。

◆ キットに含まれる M.O.M. ImmPRESS reagent, anti-mouse

Ig 15 ml で約 150 枚の組織切片を染色可能です（切片 1 枚に約 100 µl 使用した場合）。

※ VECTOR M.O.M. Immunodetection Kit のラインナップに

つきましては，B 章（p.89）をご覧下さい。

※ ペルオキシダーゼ基質は含まれていません。別途ご用意下さい

（p.91 参照）。

ット

● M.O.M. mouse Ig blocking reagent

● 2.5％ Normal horse serum

● M.O.M. ImmPRESS reagent, anti-mouse Ig

マス（）

左：二次抗体：市販のペルオキシダーゼポリマー標識二次抗体

右：二次抗体：M.O.M. ImmPRESS reagent, anti-mouse Ig（#MP-2400）

基質：DAB（#SK-4100）（茶色）

対比染色：Hematoxylin（青色）

M.O.M. ImmPRESS を用いた場合の方が，バックグラウンドが低く，特異性が高い染色像が得られた。

マス

一次抗体：抗 Ki67 抗体

二次抗体：M.O.M. ImmPRESS reagent, anti-mouse Ig（#MP-2400）

基質：DAB（#SK-4100）（茶色）

対比染色：Hematoxylin（青色）

メーカーコード（）名

VEC MP-2400 1 kit 50,000 M.O.M. ImmPRESS Peroxidase Polymer Kit Mouse on Mouse ImmPRESS Peroxidase Polymer Kit

メーカーコード（）名

N2 VEC MP-7602 1 kit 33,000 ImmPRESS Excel Anti-Mouse IgG Staining Kit N1 VEC MP-7601 1 kit 33,000 ImmPRESS Excel Anti-Rabbit IgG Staining Kit

ドキュメント内 funakoshi免疫染色2014_P000前付i.indd (ページ 66-129)

スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力 鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリ

2 オ

4. スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力 鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリ

に十分浸ることを確認して下さい。

5. 圧力鍋のふたをしてロックし（ロックピンが上がりま す），圧力インジケーターバルブが上がるまで約 4 分 間加熱します。その後 1 分間加熱を続けます。

6. 圧力鍋を熱源から外し，ふたの上から冷水を流しかけ ます。ロックピンが下がったことを確認してからふた を開け，直ちにスライドガラスを蒸留水に浸します。

ロックピンが下がるまで，決してふたを開けないで下 さい。

7. TBS（pH 7.6）で 5 分間洗浄します。

8. 1.5％過酸化水素水／メタノール中で 10 分間イン キュベートします。

9. 蒸留水で 5 分間 ×2 回洗浄した後，TBS で 5 分間 × 2 回洗浄します。

10. 免疫組織染色を行います。

パラフィン包埋組織

1. 組織を薄切し，VECTABOND（VECTOR LABORATORY 社：#SP-1800）などで表面処理を施したスライドガ ラスに接着させます。

2. 脱パラフィン処理を行い，脱イオン水で水和します。

3. 1,600 ml の 0.01 M クエン酸ナトリウムバッファー

（pH 6.0）をステンレス製の圧力鍋に加え，ホットプ レートなどの熱源で沸騰させて下さい。その際，圧力 鍋にふたをしますが，ロックしないで下さい。

4. スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力 鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリ ウムバッファーに十分浸ることを確認して下さい。

5. 圧力鍋のふたをしてロックし（ロックピンが上がりま す），圧力インジケーターバルブが上がるまで約 4 分 間加熱します。その後 1 分間加熱を続けます。

6. 圧力鍋を熱源から外し，ふたの上から冷水を流しかけ ます。ロックピンが下がったことを確認してからふた を開け，直ちにスライドガラスを蒸留水に浸します。

7. 以下，「EDTA を用いた HIER」の操作 7. 〜 10. と同 様です。

圧力鍋の仕様，各部名称は製品により異なります。必 ず製品添付の取扱い説明書を確認し，高温，高圧に注意 して使用して下さい。

切片がスライドガラスから剥離するのを防ぐため，

VECTABOND（VECTOR LABORATORY 社：#SP-1800）などの接着試薬を使用して下さい。接着後は 37℃で一晩乾燥させた後，56℃で 60 分間乾燥させる ことを推奨します。

処理条件を最適化するためには，時間，温度，pH の条件 を変えて組み合わせたマトリックス表を作成し，予備実験 を行って下さい。

R&D Systems 社では，pH および組成の異なる 3 種類 の HIER 用 抗 原 賦 活 化 試 薬「Antigen Retrieval Solution」を取り扱っています。

その他にも多数の抗原賦活化試薬があります。製品の詳

細については，p.108 〜をご覧下さい。

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A-2． カ ー ……… 72

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Ａ 酵素マイクロポリマー染色法

酵素マイクロポリマー染色法

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A-1 ー

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マイク マー システム ステッ バック

ラ ンド マ ス サ バーサ タイ

リマーで，高活性かつ高密度のペルオキシダーゼ（PO）と二 次抗体が結合しています。

て用いたシステムに比べ，標的となる一次抗体に容易に結合す るため，非特異的結合も低く抑えられています。その結果，低 バックグラウンドで高感度な染色像が得られます。

要はありません。

能です（切片 1 枚に約 100 μl 使用）。

（p.91 参照）。

高感度！

低バックグラウンド！

鮮明な染色像 !

products̲faq/vl̲jp̲manual）からも PDF 版をダウンロードできます。

酵素マイクロポリマー染色法

1 / / 11: :1

マイク マー ブ ッ ン ット シ ナ

Ready-to-use フ ーマット

用の製品があります。

Antibody）と，酵素標識マイクロポリマー，ブロッキング用 血清などが含まれています。

させた後，Ampliﬁer Antibody（抗マウスまたは抗ウサギ Ig 抗体）と反応させます。その後，酵素標識マイクロポリマーを 用いて免疫染色を行います。

ポリマーのみで染色を行うよりもシグナルが増幅されます。

高感度かつ低バックグラウンドな染色が行えます。

片）。

ット

reagent 1 （Chromogen） / 2 （Buffer）

キットに一次抗体，バッファー類は含まれていません。別途ご

用意下さい。

酵素マイクロポリマー染色法

1 / / 11: :1

略

凍結切片，細胞試料 ： 必要に応じてアセトン，その他の固定液で固定する。

必要に応じて，抗原の賦活化を行って下さい。VECTOR 社の抗原賦活化試薬 Antigen Unmasking Solution をお勧めします。

内在性ペルオキシダーゼの不活化には BLOXALL endogenous enzyme blocking solution を使用してください。

を添加し，2 〜 10 分間インキュベートした後，バッファーで 2 回洗浄する。

マ スモノク ーナ マ ス マイク マー

システム ステッ バック ラ ンド

度のペルオキシダーゼと二次抗体が結合しています。

て用いたシステムに比べ，標的となる一次抗体に容易に結合す るため，非特異的結合も低く抑えられています。その結果，低 バックグラウンドで高感度な染色像が得られます。

グロブリンの非特異的染色によるバックグラウンドを減少さ せ，目的の抗原を特異的に染色できます。

要はありません。

Ig 15 ml で約 150 枚の組織切片を染色可能です（切片 1 枚に 約 100 µl 使用した場合）。

つきましては，B 章（p.89）をご覧下さい。

（p.91 参照）。

ット

スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリ

4. スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリ

5. 圧力鍋のふたをしてロックし（ロックピンが上がります），圧力インジケーターバルブが上がるまで約 4 分間加熱します。その後 1 分間加熱を続けます。

6. 圧力鍋を熱源から外し，ふたの上から冷水を流しかけます。ロックピンが下がったことを確認してからふたを開け，直ちにスライドガラスを蒸留水に浸します。

ロックピンが下がるまで，決してふたを開けないで下さい。

8. 1.5％過酸化水素水／メタノール中で 10 分間インキュベートします。

1. 組織を薄切し，VECTABOND（VECTOR LABORATORY 社：#SP-1800）などで表面処理を施したスライドガラスに接着させます。

（pH 6.0）をステンレス製の圧力鍋に加え，ホットプレートなどの熱源で沸騰させて下さい。その際，圧力鍋にふたをしますが，ロックしないで下さい。

4. スライドガラスを金属性の染色用ラックにいれ，圧力鍋の底に置きます。スライドガラスがクエン酸ナトリウムバッファーに十分浸ることを確認して下さい。

5. 圧力鍋のふたをしてロックし（ロックピンが上がります），圧力インジケーターバルブが上がるまで約 4 分間加熱します。その後 1 分間加熱を続けます。

6. 圧力鍋を熱源から外し，ふたの上から冷水を流しかけます。ロックピンが下がったことを確認してからふたを開け，直ちにスライドガラスを蒸留水に浸します。

7. 以下，「EDTA を用いた HIER」の操作 7. 〜 10. と同様です。

圧力鍋の仕様，各部名称は製品により異なります。必ず製品添付の取扱い説明書を確認し，高温，高圧に注意して使用して下さい。

VECTABOND（VECTOR LABORATORY 社：#SP-1800）などの接着試薬を使用して下さい。接着後は 37℃で一晩乾燥させた後，56℃で 60 分間乾燥させることを推奨します。

処理条件を最適化するためには，時間，温度，pH の条件を変えて組み合わせたマトリックス表を作成し，予備実験を行って下さい。

R&D Systems 社では，pH および組成の異なる 3 種類の HIER 用抗原賦活化試薬「Antigen Retrieval Solution」を取り扱っています。

A-1．ー ……… 60

A-2．カー ……… 72

A-3．ー ……… 80

Ａ酵素マイクロポリマー染色法

A-1 ^ー

マイクマーシステムステッバック

ランドマスサバーサタイ

リマーで，高活性かつ高密度のペルオキシダーゼ（PO）と二次抗体が結合しています。

て用いたシステムに比べ，標的となる一次抗体に容易に結合するため，非特異的結合も低く抑えられています。その結果，低バックグラウンドで高感度な染色像が得られます。

マイクマーブッンットシナ

Ready-to-use フーマット

Antibody）と，酵素標識マイクロポリマー，ブロッキング用血清などが含まれています。

させた後，Ampliﬁer Antibody（抗マウスまたは抗ウサギ Ig 抗体）と反応させます。その後，酵素標識マイクロポリマーを用いて免疫染色を行います。

凍結切片，細胞試料：必要に応じてアセトン，その他の固定液で固定する。

マスモノクーナマスマイクマー

システムステッバックランド

て用いたシステムに比べ，標的となる一次抗体に容易に結合するため，非特異的結合も低く抑えられています。その結果，低バックグラウンドで高感度な染色像が得られます。

グロブリンの非特異的染色によるバックグラウンドを減少させ，目的の抗原を特異的に染色できます。

Ig 15 ml で約 150 枚の組織切片を染色可能です（切片 1 枚に約 100 µl 使用した場合）。