アポ酵素 (apo IMP-1) の調製

精製したIMP-1溶液をMOPS-NaOH緩衝液 (50 mM, pH 6.5, 1.0 M NaCl) へ緩衝液 を置き換え1.68 mMに濃縮し、グリセリン濃度が酵素溶液の30 % になるように加え た。この IMP-1 溶液に MOPS-NaOH 緩衝液(50 mM, pH 6.5, 1.0 M NaCl, 200 mM EDTA·2Na)をEDTA·2Naの濃度が50 mMになるようにごく少量ずつ加え、30 ºCで試 験管にセラムキャップを付し、Ar を通じたあと封じ 15 時間置いた。その後、遠心 (20,000×g, 4 ºC, 40 min) して沈殿を取り除き、PD-10カラム (φ 15 mm × 50 mm) にア プライし、室温において脱メタル水で調製したMOPS-NaOH緩衝液(50 mM, pH 6.5, 1.0 M NaCl, 30 % glycerol)で溶出し、タンパク分画を回収した。100 µMのセファロリジン の加水分解活性をMOPS-NaOH緩衝液(50 mM, pH 6.5, 1.0 M NaCl, 2 µM EDTA·Na)で 測定し活性が5 % 以下であることを確認し、これをアポ酵素溶液(apo IMP-1)とした。

フレーム式原子吸光から7.6 %のZn(II)を含有していることが分かった。

謝辞

本研究を行うに際し、また闘病中も最期まで御指導、御鞭撻を賜りました熊本大学 大学院医学薬学研究部 構造機能物理化学分野 （故）後藤正文教授に深甚なる感謝 の意を表します。

本研究を行うに際し、終始御懇篤なる御指導、御鞭撻を賜りました熊本大学大学院 医学薬学研究部 構造機能物理化学分野 黒崎博雅助教授に深甚なる感謝の意を表 します。

本論文の審査にあたり、有益な御助言と御校閲を賜りました熊本大学大学院医学薬 学研究部 細胞機能分子解析学分野 中山 仁教授、熊本大学大学院医学薬学研究部 生体機能分子合成学分野 大塚雅巳教授、熊本大学大学院医学薬学研究部 機能分子 構造解析学分野 山縣ゆり子教授に心から感謝いたします。

本研究に際し、終始有益な御助言と御協力、御指導を賜りました国立感染症研究所 細菌第二部 荒川宜親部長に深く感謝いたします。

本研究の遂行に際し、Echericha coli JM109 (pSMBNU24)を提供していただいた名古 屋大学医学系研究科 分子病原細菌学分野 太田美智男教授に心から感謝いたしま す。

本研究の実施に際し、御助言、御協力を惜しまれなかった大阪大学大学院薬学研究 科 分子反応解析学分野 宇野公之教授に深く感謝いたします。

本研究の遂行に際し、MALDI-TOF MS による分子量を測定頂いた熊本大学大学院 医学薬学研究部 薬学生化学分野 三隅将吾助教授に深く感謝します。

本研究の実施に際し、X線結晶構造解析において御指導、御協力を惜しまれなかっ た熊本大学大学院医学薬学研究部 機能分子構造解析学分野 池水信二助教授、藤間 祥子助手に心から感謝いたします。

本研究の遂行に際し、御協力、御指導を頂きました森 弘正博士、原田久美子博士 に深く感謝いたします。

本研究の遂行に際し、原子吸光分光計を使わせて頂きました熊本大学大学院医学薬 学研究部 環境分子保健学分野 高濱和夫教授、Rapid-scan 分光光度計を使わせて頂 きました熊本大学大学院医学薬学研究部 分子生理学分野 志賀 潔教授に深く感 謝いたします。

共に研究を遂行し、多大なる御協力をいただきました御舩紫保氏、黒木隆浩氏、曽 我公孝氏、川浪明子氏、保澤寿美氏、金 万春氏、高城知子氏、松枝 聖氏、湯本陽 香氏をはじめ、熊本大学大学院薬学研究科 薬品物理化学教室ならびに熊本大学大学 院薬学教育部 構造機能物理化学分野の諸氏に心から感謝申し上げます。

本研究の実施に際し、御助言、御協力を惜しまれなかった山下 沢博士、中村照也 氏をはじめ熊本大学大学院医学薬学研究部 生命分析化学分野の諸氏、機能分子構造 解析学分野の諸氏、薬物活性学分野の諸氏に深く感謝申し上げます。

核磁気共鳴スペクトル、元素分析および質量分析を測定頂いた熊本大学生命資源研 究・支援センター（旧機器分析センター）武田勝士氏、白木邦子氏、西山麻砂美氏、

入口利之氏に感謝いたします。

本研究の実施の際に、数々の相談に乗って頂き、有益な助言を頂きました城野博史 博士、ならびに苦楽を共にした山口幸輝博士、東 俊博氏に心より感謝いたします。

最後に暖かく見守ってくれた友人、両親に深く感謝します。

平成17年10月20日

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