液体クロマトグラフィー

HPLC法は、Fig. 4-8に示す構成からなる分析装置を用いる。GC法と異なり、水溶性の試料

を直接導入することができるため取り扱う試料との親和性が高く、近年様々な分野で広く 普及している。ここでは、HPLC で用いられる分離モード、分離カラム、検出器について、

その概要を述べる。

Detector Detectable Compound

Thermal conductivity detector (TCD) All compounds other than the carrier gas Flame ionization detector (FID) Organic compounds

Electron capture detector (ECD) Organic halogen compounds

Flame photometric detector (FPD) Inorganic and organic sulfur compounds Inorganic and organic phosphorus compounds Mass Spectrometry (MS) ionizable compounds by ionization techniques

Table 4-2 Types of GC detector

fg pg ng µg mg

TCD FID

ECD FPD GC/MS (SIM)

Fig. 4-7 Comparison of sensitivity of GC detectors and GC/MS⁷⁵⁾

Fig. 4-8 Configuration of HPLC system

Pump Injector Column Detector

Sample Data processing unit

Electric signal

Solvent

（１）LC の分離モード

LC法で用いられる分離モードと分離原理を、Table 4-3に示す⁷⁶⁾。また、各分離モードに 適用できる測定対象成分の特性をFig. 4-8に示す。低分子化合物を測定する場合は、測定上 の安定性から一般的に、逆相の分離モード（RPLC）が第一に選択される。移動相には、用 いる分離モードに対応した有機溶媒と水系溶媒（緩衝液）が用いられるが、LC/MS の場合 は不揮発性の塩を用いることができないため、揮発性の塩であるギ酸アンモニウムや酢酸 アンモニウムなどが用いられる。

Table 4-3 Types and mechanisms of LC separation mode⁷⁶⁾ Type of separation mode Separation mechanism Taget compounds

Rversed-Phase LC (RPLC)

Sample is separated by the solubility to mobile phase and stationary phase by using non-polar stationary phase

Low molecular weight compounds

Normal Phase LC (NPLC)

Polar stationary phase and non-polar mobile phase is used.Sample is separated by the adsorption to the stationary phase.

Hydrophilic compounds

Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography

HILIC works same mechanism as NPLC.

Organic solvent is use for highly polar

componds, and which is separated by adsorption and partition to stationary phase

Polar compounds

Ion Exchange Chromatography

Sample is separated by the electron affinity of the analyte by using the stationary phase containing ion-exchange functional group

Ionic compounds, inorganic ions

Size Exclusion Chromatography Sample is separated by molecular sieve of porus

particle of stationary phase High molecular weight compounds

第4章 CNP及びCNP－アミノ体の物性と試験法原理

（２）分離カラム

LC法で用いられる分離カラムの充填剤の種類とその特徴をFig. 4-9に示す。RPLC では、

は、シルカゲル担体にオクタデシルシリル基（ODS基、C18基）を化学結合した充填剤が一 般的に用いられる。今日では、小粒径の充填剤と高圧のLC装置条件を用いて、高効率、高 分離かつ高速な測定が行われており、これを高速液体クロマトグラフィー（HPLC）又は超 高速液体クロマトグラフィー（UHPLC）と呼んでいる。

Hydrophobic Hydrophilic

Charge

The other

C8, C18, C30 Si-OH Diol

Phenyl CN

NH₂ Ion Exchange

Fig. 4-9 Features of functional group of LC column⁷⁷⁾ Fig. 4-8 Features and applications of separation modes⁷⁷⁾

Polarity

Low High

Molecular Weight

100k

10k

1k

100

10

Size Exclusion

RPLC

IC NPLC

GC

HILIC

（３）検出器

LCで用いられる検出器の種類とその特性をTable 4-4に示す。用いる検出器は、測定対象化 合物の構造によって使い分けられるが、ppmオーダーでの分析にはコスト面に優れるUVD が用いられることが多い。より高感度かつ高選択性の測定が求められる場面では、MSが用 いられる。