糖の疎水結合クロマトグラフィー

昭 和63年11月(1988年) 一 1

総

説

糖 の 疎 水 結 合 ク ロ マ トグ ラ フ ィー

矢 野

由起,田

中 敬 子*,染

矢 裕 子*

The Hydrophobic Chromatography of Sugars

Yuki YANG, Keiko TANAKA and Yuko SOMEYA

は じ め に こ の小 文 は,「疎 水 性 相 互 作 用 に基 づ く糖 の分 離 」と 「多 糖 ゲ ル の 疎 水 性 を 利 用 す る疎 水性 物 質 の 分 離 」 の 2つ の 内容 か ら成 る が,先 ず 始 め に 「糖 の疎 水 性 」 に つ い て 幾 つ か の実 験 デ ー タ を 示 して お き た い 。 1.糖 の 疎 水 性 筆 者 ら は,一 連 の 実 験 デ ー タ か ら,糖 に は そ のCH 基 に 基 づ く 疎 水 性 が 内 在 す る こ と を 示 し たb2)。 た と え ば,(1)糖 は そ の 立 体 配 座 や コ ン ポ メ ー シ ョ ンの ち が い に よ って,水 溶 液 中 の ポ リス チ レ ン ・ゲ ル(Bio・Beads SM-4)に 対 して そ れ ぞ れ 独 自 の 分 配 係 数(Kav)を 示 す こ と,更 に こ のKa vの 値 が,水 の 構 造 形 成 を 促 進 す るNaCI水 溶 液 中 で は 大 き く な り,逆 の 作 用 を 持 つ NaSCN水 溶 液 中 で は 小 さ く な る こ と(Table 1)33, (2)糖 の 水 か らn一 ブ タ ノ ー ル へ の 移 行 自 由 エ ネ ル ギ ー (dFt)とBio-Beadsに 対 す る 親 和 性 ま た は 吸 着 の 自 由 エ ネ ル ギ ー(-RT ln[Kav-K。av]/K。av,こ こ でK。 ω は 吸 着 が な い 条 件 下 で の 分 配 係 数)の 間 に 直 線 関 係 が 成 立 す る こ と(Fig・1)3),(3)糖 は 炭 化 水 素 の 水 溶 解 度 を 高 め る共 溶 媒 効 果 を 示 す が4'5),そ の 序 列 は 上 記 の KaUの 序 列 と 概 ね 一 致 す る こ と,(4)水 溶 液 中 で 膨 潤 さ 皇 学 館 大 学 文 学 部 教 育 学 科,伊 勢 市 神 田 久 志 本 町1704 Department of Education, Kogakkan University, Ise-shi 516

*京 都 女 子 大 学 家 政 学 部 食 物 学 科 栄 養 学 第3研 究 室_, 京 都 市 東 山 区 今 熊 野 北 日吉 町35

Department of Food Science, Kyoto Women's University, Higashiyama-ku, Kyoto 605

せ た 多 糖 ゲ ル 中 に疎 水 性 物 質 が 高 濃 度 に 溶 解 す る こ と6-8),な どが そ れ で あ る 。 糖 のBio-Beadsへ の 吸 着 は わ ず か に 発 熱 的 で あ り, 典 型 的 な エ ン トロ ピ ー駆 動 の 過 程 で は な い が,Bio-Beadsへ の 吸 着 自 由 エ ネ ルギ ー の 序 列 とdFt(H20 →n一ブ タ ノ ー ル)の 序 列 が 一 致 す る こ と は,糖 のBio・ Beadsへ の 吸着 に い わ ゆ る 疎 水 性 相 互 作 用 が 関与 して い る こ と を 示 唆 す る も の で あ る。 そ う い う意 味 で, Kavま た はIn(-Kav-K。aの/K。//と,水 分 子 が接 近 可 能 なCH基 の 占 め る表 面 積 と の 関 係 を 調 べ る こと は 糖 の 疎 水 性 を 知 る上 で 必 要 な こ とで あ る 。宮 嶋 ら9)は, 糖 の 疎 水 性 の 指 標 と してCH, CH2の 占 め る 表 面 積 と OH及 び0の 占あ る表 面 積 の 比(lndex A)を と り, そ れ と単 糖 類 のBio-Beadsに 対 す るKaUと の 関係 を 調 べ た。 そ の 結 果,両 者 間 に密 接 な相 関 が あ る こ とを 見 出 した 。 筆者 らは,単 糖 類 の他 に メ チ ル 配 糖 体,グ

ル コ2糖 類 お よ び デ オ キ シ糖 に つ い て,In(Kav_K。av) /K。avとCH Indexと の 相 関 を 調 べ て み た(Fig・2)1011)。 (CH Indexは 基 本 的 に はIndex Aと 同 様 に定 義 さ れ る 量 で あ るが,Index Aの 計 算 で はOH基 の 自 由 回 転 が仮 定 され て い るの に対 し,CH Indexは 結 晶座 標 の デ ー タ(CAM)を そ の ま ま 使 って 計 算 さ れ た もの で あ る 。)Fig・2か ら明 らか な よ う に,単 糖 類 に つ い て はln(ノ 『σグκ 。av)/K。avとCH Indexと の 間 に ほぼ 直 線 関係 が み られ る が,他 の糖 につ い て はそ うで は な い ◎ しか し,Fig・2は 全 体 と して み れ ば,こ れ ら2つ のパ ラ メー タの 間 に 密 接 な 相 関 が あ る こ とを 示 して お り11),従 って 糖 一(Bio-Beads)間 の 相 互 作 用 にCH基 に基 づ く疎 水 性 が 関 与 して い る こ と は 確 だ と 思 わ れ る。

- 2ー 食物学会誌・第43号

Table 1. K~1 of Monosaccharides for Polystyrene Gel in Water and Salt Solutions at 250 C3) 民10nosaccharide H2

0

2MNaCl Galactose 0.55 0.61 Glucose 0.56 0.62 Mannose 0.62 0.68 Fucose 0.90

1

.

33 Arabinose 0.68 0.74 Xylose 0.68 O.74 Ribose O.75 0.88 Deoxyribose

1

.

07

1

.

47 a) Units of Kav: (mol-l-1solvent)-(mol-l-1gel)-1. ただ，メチル配糖体や2糖類の Kavについて， α-metyl D-man }>α-methyl D-glc

，

α-methyl D-gal α一配糖体>戸一配糖体 Laminaribiose (s-l

，

3)}>他のグノレコ 2糖 となる結果を CH lndex だけで説明するととはでき ない (Fig.2)。従って， CH表面積は重要な要素には ちがいないが，それ自体で充分ではない乙とがわかるo 脂肪族アルコーノレの場合， O H基に近接した CH2基 の疎水性効果は皆無か極めて小さいことが知られてい る。同様な考え方をメチノレ配糖体に適応するならば， C-2の OHから空間的により大きく分離された Methyl α・D圃mannosideの CH3基の疎水性効果が大 。言

1

1

す o

x

c 、-副..， 主、一1 c 坤F d Q) C ~ _〉、

虫

、

ε

Gal

4MNaCl 2MNaSCN 2MLiSCN 0.67 0.54 0.51 0.69 0.54 0.52 0.74 0.57 0.55 2.00 0.80 0.60 0.60 0.80 0.58 0.57

1

.

07 0.74 0.63 0.82 きくなるであろうことは容易に予想される (Fig.3)。 また， α配糖体の O 原子の水接触表面積が戸のそれ に比して全 す程度小さいととを考えれば， α-CH3 の疎水性効果が βCH3 のそれより大きくなることも 理解できる。ラミナリビオースは，結晶座標のデータ に基づくコンピュータ・グラフィック・イメージによ れば，比較的かたい平面構造をとっている口もし，乙 の構造が溶液中でもある程度維持されるとすれば，ポ リスチレン鎖との接触面が他と比較して大きく，それ だけ相互作用も強くなると考えられるo 以上のことから，糖と Bio-Beadsの相互作用を決め る要因は

，

(1)CHjOH表面積比， (2)主たる疎水d性サイ

-Fuc Deoxyrib /

•

-3 0 1000 2000 3000

-

o

(

d

.F

t

)

(

∞I

-

m

o

l

-

I )

Fig.

1

.

Correlation between the polystyrene affinity and LJFt (H20jBuOH) for

monosaccharides. 8 (LJFt) refers to the transfer free energy for transfer

of sugars from water to n-butanol relative to that of galactose

，

i. e.

，

昭和63年11

月

(1988年) Methylglycosides 3ト

•

•

19 20

・

.

18 2卜 17 15126 02ζ8 Glucodisaccharides X =-

，

。

Xき .11

_•

10 12 c 9

・

k 6空8

一

1ト _.4.5 .3

一

2ト

I~

Monosaccharides .1 -3 斗 0.3 0.4 0.6 0.8 1.0 CH Index

Fig. 2. Correlation between the polystyrene affinity and C H Index.1D _{C H Index=latio}

of total surface area of CH

，

CH2 and CH3 groups to total surface area of O H

and 0 groups. 1: galactose

，

2: glucose

，

3: mannose

，

4: xylose

，

5: arabinose

，

6: ribose

，

7: cellobiose

，

8: maltose

，

9: trehalose

，

10: gentiobiose

，

11: laminaribiose

，

12: deoxyribose

，

13: methyl

戸

-D-galactoside

，

14: methyl α-D-galactoside

，

15: methyl s-D-glucoside

，

16: methylα-D-glucoside

，

17: methyl

s

・D-xyloside

，

18:

methylβD-arabinoside

，

19: methylα・D-mannoside

，

20: methyl α・D-xyloside.

methyl αーD-mannoside _{methylα-D-glucoside} methylαーD-galactoside Fi昌.3. The C・2O H o CH3 segregation in methyl α ・・D-glycosides

。

。

1.0 0.5

J

0 0.5

。

50 Methyl xylosi de Methylmannoside Column size: lx26cm Elution・2MNaCI at 1 .7ml/cm2 _hr Temp.: 250_C 100 150 200 250 Elution volume (ml)

Fi岳.4. Separation of αand

s

anomers on a Bio-Beads SM-4 column1₂₎

4

-トまたはグルーフ。の近接 O H基からの空間的分離の 度合， (3)分子の平面性やかたさなどであると考えられ る。

1

1

.

糖の疎水結合クロマトグラフィー 各糖の疎水性を決定する要素の差異を利用して，糖 をBio-Beadsによって分離するととができる。 Fig.4， 5はその2，3の例を示したものである。 Fig.6a及 び6bには，それぞれシクロデキストリン及びアミロ ースの Octyl-SepharoseCL・4Bによるクロマトグラ 食物学会誌・第43号 ムを示しである。乙れらの糖の Octyl基への結合は， Bio-Beadsの場合と同様に発熱的であるが， NaCl中 で強められ，尿素や SCN塩中では弱められる。

I

I

I.多糖ゲル(Sephadex

，

Cellulofineな ど)の疎水性を利用するクロマトグラ フィー

疎水性の溶質は高濃度のデキストラン・ゲノレ (Se -phadex G-I0， G-25)に対して異常に大きい Kauを示

す6印。疎水性溶質の水溶媒からゲ、ル中への移行は殆

D

i saccharide Column : 2，5 x 49cm Elution: 2M NaCI - 1，0

E

C 0 0'> 寸 4 0，5

。

Lactose _{T emp}， : room temp， 200 350 400 450

V

_e (g) Fi邑.5. Separation of lactose and sucrose on a Bio-Beads SM・4col umn 12)• 1，0

3

0 4 0 (J) 守 4 1，0

。

0.4 0，2

。

(b) 50 Cyclodextrins Amylose A (M=2900) Column : Octyl-Sepharose CL -48 (1，1 x 26cm) Elution : 2M NaCIト 一 )

H

2U(一一) Temp.: 50_C Temp: 250_C Octyl group-amylose

B

interaction parameters: t:J.FO₌ ー10kcal/mol t:J.HO_{= 5kcal/mol} t:J.SO

=

_{51 e.u.} 100 150 200 250 300 日utionvolume (ml)

Fig. 6. Separation ofα・

，

s

-

and γ-cyclodextrins (a) and amylose fraction

昭和63年11

月

(1988年)

5

-a. Entropic Hydrophobicity b. Enthalpic Hydrophobicity _2.0 ('， V ( ¥ ¥: 0 ¥ I Enthalpy rich water with incomplete complement of Q) O 1.6 E 1.2

、

、

H bonding (e. g.

，

Cyclodextrin) o u

.

/

.

/

/

c. Enthalpic Hydrophobicity Interstices formed by dextran matrices in swollen gel and in dextran釦lution .:s:. _ 0.8 LL d

/

0

4

[

/

。

l I 3 4 5 6 7 8 No. of the alkyl carbon atoms (SephadexG-10) (Condensed dextran solu↑ion) Fig. 8. LJFt (H20jG-10) of alcohols as the function of the alkyl chain length8). Fi昌.7. Implications of the

“

H ydropho bicity" ど例外なくエントロピー有利に基づくものであり，疎 水性相互作用の関与を示唆するものであるが，その詳 細は明らかにされていない。「疎水結合」ゃ「疎水性」 の概念は，近年むしろ，だんだん暖昧になってきたよ うに思われるが，

i

水の中へ挿入することによって水 の自由エネルギーを増加させる溶質を疎水性である」 というととが許されるならば，少なくとも

2

つのケー スが考えられる。 1つは，いわゆる Entropicな疎水 性 (Fig.7a)であり，いま 1つは，環の中に蒸気に近 い状態の水分子を取り込んでいると考えられている シクロデキストリンにみられる Enthalpicな疎水性 (Fig.7b)である。シクロデキストリン環内と似たよう な状況は高濃度の多糖ゲ、jレや水溶液中 (Fig.7c)にお いても容易に生じうることであり (Table2)1ペ従って シクロデキストリンの包接化合物形成を疎水性相互作 用に基づくものとするならば，溶質の高濃度多糖ゲソレ への移行も同様にみなすことができる。事実， n-ア ルコールの水溶媒から SephadexG-10への移行自 由エネノレギーは炭素数の増加とともに直線的に減少 し(Fig.8)， CH2当たりでは LJFt 0 = -330 caljmole (LJH/=500caljmole， LJS/=3 e.u.)である。 との値 は， 炭素4以上の n-アノレコーノレを 1X23cm程度の カラムで分離するのに充分であり，溶媒中の NaCI濃 度と温度を上げることによって，更に改善するととが できる (Fig.9)。 Sephadex G-10 に対する吸着が更に強い芳香族化 合物の場合は，濃度匂配をもたせたメタノーJレ水溶液 を溶出溶媒として用いることによって，分離すること が可能である (Fig.10)。

Table 2. Number of Water Molecule per Cavitary Glucosidic Oxygen in Cyclodextrins (CA) and in Dextran Gel14>

CA C6A C7A C8A No. 1

1

.

57 2.13 Sephadex G-10 G-15 G-25 G-50 G-100 Dextran _No. Concn. (%) 57.4

1

.

87 45.6 2.66 29.2 4.50 12.9 14.0 5.8 25.4

- 6

ー

。 一

0 0 ω 万 m w 忠 一

o

E

﹄ O Z )

- c

o c

o o

30 50 70 90

E

l

u

t

i

o

n

v

o

l

u

m

e

(

m

l

)

110 130 150 食物学会誌・第43号 Eluent : 0.1 M NaCI Temp. : 200_C Eluent : 0.1 M NaCI Temp.: 400C Eluent: 2.0M NaCI Temp.: 400_C Ca Fi昌.9. Effect of temperature and salt on the chromatographic resolution of n-aliphatic alcohols on a Sephadex G・10column (1x23cm)8l. 4 2 0 0

E C

ω

寸 寸 ﹂ OON 向 ) 4 む す び 0.6

[0

問。]

。

15 30 Column: 0.8x 2.5cm 日ution:0-80% methanol gradient Temp. : room temp. 率

三

豊

[

Q

-

N=N

ぢ

]

45

V

.

(

m

l

)

75 60

Fi昌.10. Separation of hydrophobic dyes on a Sephadex G-10 column15₎

ととに示した疎水結合クロマトグラフィーの例は糖 の疎水性に基づくものであり，分析手段としての一般 的応用は限られているが，原理的には興味深い。さら にメチル配糖体やアルコーJレの分離の例にみられるよ うに工業的な規模での応用も十分に考えられる。

文 献

1) Y. Yano: 本誌， 40， 1 (1985)

2) M. Janado: in Aqueous Size-Exclusion Chro・

matography

，

P. L. Dubin ed.

，

(Elsevier

，

Amster-dam

，

1988)

，

Chap. 2.

3) M. Janado and Y. Yano:

ノ.

Soluti・'onChem.

，

14

，

891 (1985).

4) M. Janado and T. Nishida:

ノ.

Solution Chem.

，

10

，

489 (1981).

5) M. Janado and Y. Yano: Bull. Chem. Soc.

ノ

'pn.

，

58

，

1913 (1985)・

6) A.C. Haglund and N.V.B. Marsden:

ノ.

Polym. Scz'.Polym. Lett. Ed.

，

18

，

217 (1980).

7) M. Janado

，

K. Takenaka

，

H. Nakamori and Y. Yano:

ノ.

Biochem.

，

87

，

57 (1980).

8) Y. Yano and M. Janado:

J

.

Chromatogr

，

・

， 200

，

125 (1980).

昭和63年11月(1988年)

Bull. Chem. Soc. Jpn.

，

58

，

2595 (1985).

10) Y. Yano

，

K. Tanaka

，

Y. Doi and M. Janado:

J

.

Solution Chem-

，

17

，

347 (1988).

11) Y. Yano

，

K. Tanaka

，

Y. Doi and M. Janado:

βull. Chem. Soc.

ノ

pn.

，

61

，

2963 (1988)・

12)K. Tanaka: 未発表データ

7

-13)Y. Someya: 京都女子大学食物学科卒業論文(昭 和62年度)

14)R. P. Bywater and N. V. B. Marsden: Chro・

matograPhy Librar}' Ser-ies

，

22A

，

(Elsevier

，

Am-sterdam

，

1983)

，

Chap. 8.