2016 年 7 月 4 日受理 連作責任者：奥本 裕（[email protected]）
イネ
Wx 座における遺伝的組換え頻度簡易計測法の画像解析による簡便化
上野山亜楠
1）*・小出陽平
1,2,3）*・築山拓司
1,4）・寺石政義
1）・奥本 裕
1） 1）京都大学大学院農学研究科 （〒 606-8502 京都市左京区北白川追分町） 2）京都大学白眉センター （〒 606-8501 京都市左京区吉田本町） 3）現北海道大学農学研究院（〒 060-8589 札幌市北区北 9 条西 9 丁目） 4）現近畿大学農学部（〒 631-8505 奈良県奈良市中町 3327-204） * 複数筆頭著者 要旨 : 作物の育種とは遺伝的組換えにより創出された多様な遺伝子組合せを持つ個体から有益な個体を選抜する ことであるため，組換え頻度の理解は育種にとって重要な課題である．本研究では，イネ Wx 座をモデルとし，大 規模な分離集団の代わりに花粉を用いた組換え頻度計測法を画像解析によって更に簡便にし，この方法を用いて レトロトランスポゾン（RT）挿入がイネの組換え頻度に与える影響を評価した．測定法の開発には Wx 遺伝子座 内の異なる部位に変異を持つ 2 種類のイネ系統（T65wx および 73wx1）の交雑 F1を用いた．この F1個体は変異部 位間の組換えにより低頻度でウルチ型花粉を産出するため，ウルチ型花粉の出現頻度から組換え頻度を測定する ことができる．本研究では，F1個体の花粉を画像解析ソフトを用いて計数することで，組換え頻度を簡便かつ高 い精度で測定することが可能となった．さらに，Wx 遺伝子座第 9 エキソンに約 7kb の RT 挿入を持つヒメノモチ を用いて組換え頻度を調査したところ，RT 挿入は周辺の組換え頻度に影響を与えることが示唆された． キーワード：イネ，Wx，組換え頻度，レトロトランスポゾン緒言
作物の交雑育種では，目的とする優良形質を持つ個体を 交配し，遺伝的組換えによって得られる多様な遺伝変異の 中から望ましい遺伝子型を持つ個体を得ることが基本とな る．したがって遺伝的組換えのメカニズムを解明し，組換 え頻度の人為的な操作を可能にすることは，育種的に有意 義である． 遺伝的組換えのメカニズムを解明するために，植物では これまでに F2集団や組換え自殖系統群を用いて染色体領 域毎の組換え頻度が調査されている（Salome et al. 2011, Colomé-Tatché et al. 2012）．しかしながら，F2集団や組換 え自殖系統群を用いた組換え頻度計測法では遺伝子型が分 離する多数の個体を扱う必要があり，詳細な組換え頻度の 解析を行うためには，より多くの労力が必要となる．そこ で，特定の遺伝子座をモデルとし，種子または花粉を用い ることで，組換え頻度測定に必要な労力を軽減する手法が 考案されている．トウモロコシでは種子の表現型の分離を 用い，染色体の微細な領域における組換え頻度が解析され ており（Brown and Sundaresan 1991, Civardi et al. 1994），レ トロトランスポゾン（RT）が挿入された領域近傍の組換 え 頻 度 が 低 下 す る こ と が 示 さ れ て い る（He and Dooner 2009）．また，シロイヌナズナでは花粉が四分子の状態で 離れないようになる qrt1 変異体を利用し，組換えが生じ た花粉を蛍光顕微鏡により観察し組換え頻度を計測する手 法が考案されている（Francis et al. 2007）．この手法では 200 個から 300 個の花粉四分子を約 1 時間で観察すること ができる（Francis et al. 2007）．イネにおいてもデンプン合 成酵素をコードする Wx 座をモデルとし，花粉を用いて遺 伝的組換え頻度を計測する手法が利用されている（Inukai et al. 2000）．機能型 Wx 対立遺伝子を持つ花粉はウルチ型 となり，I2-KI 水溶液により濃青色に染色される（第 1 図）． 一方，機能欠失型である wx 対立遺伝子を持つ花粉はモチ 型となり，I2-KI 水溶液により赤褐色に染色される（Sano1984）．異なる部位に変異を持つ wx 対立遺伝子をヘテロ で持つ個体は，変異部位間の組換えにより，低頻度でウル チ型花粉を産出する．したがって，このウルチ型花粉の出 現頻度から，組換え頻度を測定することができる（第 1 図）． 本研究ではこの手法に画像解析を新たに組み合わせること で，さらに簡便化した組換え頻度測定法を開発した．また， 開発した手法を用いてトウモロコシで見いだされた RT 挿 入による組換え頻度の低下が，イネ Wx 座において見られ るか調査した． 第 1 図 組換え頻度の簡易測定法の概要．
短 報
材料および方法
供試材料 簡易測定法の開発には Inukai et al.（2000）による花粉 を用いた組換え頻度測定法と同様に日本型イネ品種台中 65 号（T65）の準同質遺伝子系統である T65wx と 73wx1 との交雑 F1個体を用いた．これら 2 つの準同質遺伝子系 統は機能欠失型 wx 対立遺伝子を持っており，T65wx は Wx 遺伝子の第 2 エキソンに 23bp の重複が存在し，73wx1 は第 13 エキソンに一塩基置換が存在する．さらに，Wx 遺 伝子座内の RT 挿入による組換え頻度への影響を評価する ために，第 9 エキソンに約 7.8kb の RT 挿入を持つ日本型 イネ品種ヒメノモチ（岸根・奥西 2011）と T65wx もしく は 73wx1 との交雑 F1個体を用い，組換え頻度の測定を行っ た．T65wx および 73wx1 は北海道大学農学研究院植物育 種学研究室より分譲された．また，ヒメノモチは農業生物 資源研究所ジーンバンクより分譲された．各遺伝子型 2 個 体を供試し，各個体から 9 から 10 個の頴花をサンプリン グし解析に利用した． 画像解析 T65wx と 73wx1 の交雑 F1個体の花粉を I2-KI 水溶液で染 色し，濃青色に染まっているウルチ型花粉の個数を肉眼に より計数した後，全ての花粉が収まるようにカメラで撮影 し た． 次 に， 画 像 解 析 ソ フ ト ImageJ, version1.48（NIH, https://imagej.nih.gov/）を用いて穎花ごとの花粉数を計測 した．初めに画像を 8bit 化によるモノクロ化を行い，0 か ら 255 までの明度によって表示した．次に，設定した明度 閾値に基づいて白色にする明度範囲を決定し，画像の二値 化を行った．画像の二値化を行う際に，分水嶺分割法によ り，重なり合う花粉粒の像を分割した．なお，分水嶺分割 法は明度や輝度を用いて画像の重なり合う領域を分割する ために利用される手法である． そ の 後，ImageJ の 解 析 ツ ー ル の 一 つ で あ る 粒 子 分 析 （Analyze Particles）により花粉の総数を計測した．粒子分 析の際，粒子サイズおよび粒子円形度の設定を行い，特定 の粒子サイズおよび粒子円形度を持つ粒子像を計数した． なお，粒子円形度は粒子の真円からの近さを表す（円形度 1.0 の時に真円となる）ため，円形である花粉を画像から 効果的に抽出するために必要なパラメーターである．画像 解析の際の測定誤差を小さくするために，明度閾値，粒子 サイズ，粒子円形度において最適な値を決定する必要があ る．そこで，ランダムに選んだ 10 枚の花粉画像を用い， 肉眼での計数による実測値から ImageJ で計数した値を引 いた数値（測定誤差）が最も小さくなる値を決定した．こ の値に基づき，各遺伝子型において 19 個から 20 個の頴花 中の全ての花粉を計数した．測定した花粉の数に基づき， ウルチ型花粉の出現頻度，遺伝距離，組換え頻度（遺伝距 離 / 物理距離）を算出した．結果
ImageJ の計測パラメーターの決定 画像解析の際の測定誤差を小さくするために，明度閾値， 粒子サイズ，粒子円形度において最適な値を決定する必要 がある．そこで，画像解析の際の明度閾値，粒子サイズお よび粒子円形度の値を変化させて測定誤差を計測した（第 2 図）．その結果，明度閾値については下限 40 上限 150 で 測定誤差が最も小さくなった．粒子サイズについては下限 0 上限 30 で測定誤差が最も小さくなった．粒子円形度に ついては下限 0.5 上限 1.0 で測定誤差が最も小さくなった． そこで，測定誤差が最も小さくなる明度閾値，粒子サイズ および粒子円形度の値を用い，自動で画像内の花粉数を計 数できるマクロを ImageJ で構築し，以後の解析に利用し た（第 1 表）． 䝟䝷䝯䞊䝍䞊ྡ ᩘ್ ᙧᗘ 0.5-1.0 ⢏Ꮚ䝃䜲䝈 0-30 ᫂ᗘ㜈್ 40-150 第１表 画像解析に用いたパラメーター名および数値 . 第 2 図 画像解析におけるパラメーター値と測定誤差 の変化．A から E はそれぞれ異なるパラメー ターの変化を示す．A 明度閾値の上限， B 明 度閾値の下限， C 粒子サイズの上限， D 粒 子サイズの下限， E 円形度． ᐃㄗᕪ ᐃㄗᕪ ᐃㄗᕪ ᐃㄗᕪ ᐃㄗᕪ ᫂ᗘ㜈್ ᫂ᗘ㜈್ ⢏Ꮚ䝃䜲䝈 ⢏Ꮚ䝃䜲䝈 ⢏Ꮚᙧᗘ B A D C E画像解析による組換え頻度の計測 作成した ImageJ のマクロを用いて，交雑 F1個体におけ る花粉の計数を行った．T65wx × 73wx1 F1個体において 観察したウルチ型花粉は 61 個であり，全花粉数は 165,388 個であった（第 3 図）．T65wx × ヒメノモチ F1個体におい て 観 察 し た ウ ル チ 型 花 粉 は 20 個 で あ り， 全 花 粉 数 は 157,172 個であった（第 3 図）．73wx1 × ヒメノモチ F1個 体において観察したウルチ型花粉は 8 個であり，全花粉数 は 154,118 個であった（第 3 図）．ウルチ型花粉の出現頻 度に対する RT 挿入の影響を調べるため，T65wx × ヒメノ モチ F1個体および 73wx1 × ヒメノモチ F1個体におけるウ ルチ型花粉と全花粉の数をそれぞれ合計し，RT 挿入があ る場合のウルチ型花粉の出現頻度を算出した．その結果， ウルチ型花粉の出現頻度は RT 挿入により有意に減少する ことが示された． ウルチ型花粉の出現頻度を用いて両親系統における変異 箇所間の遺伝距離を算出したところ，T65wx × 73wx1 F1 個体では 0.074 cM であった（第 3 図）．また T65wx × ヒ メノモチ F1個体および 73wx1 × ヒメノモチ F1個体におけ る変異箇所間の遺伝距離はそれぞれ 0.025 cM および 0.010 cM であった（第 3 図）．
考察
本研究では従来，肉眼で行っていた花粉の計数を画像解 析ソフトにより自動化し，Wx 座をモデルとした組換え頻 度測定のさらなる簡便化を図った．今回，開発した手法を 用いて測定したイネ Wx 座の組換え頻度は 0.0259cM/kb で あった．この値はイネゲノム全体の組換え頻度の平均値 （0.0039cM/kb, Wu et al. 2003）に比べ高く，イネ Wx 座が遺 伝的組換えのホットスポットであるというこれまでの報告 と一致する（Inukai et al. 2000）．一方，この値は，従来の 花粉を用いた組換え頻度計測法の結果に基づき算出した Wx 座の組換え頻度（0.0439 cM/kb，Inukai et al. 2000）に 比べ低い．この原因は，従来の計測法では，ランダムに選 んだ 3 つの葯の平均値を葯あたりの総花粉数として組換え 頻度の計測が行なわれていたのに対し，本研究では画像解 析を用いることにより，頴花内のすべての花粉数をより正 確に計数することが可能となったことに起因する可能性が ある．その他の原因として栽培を行った環境条件の違い（温 度，日長等）に起因する可能性もあり，今後の検討が必要 である． 一方，作業の簡便性については，本研究で新た に開発した測定法を用いることで，花粉の染色および撮影 は 1 穎花あたり 10 から 15 分，画像処理は 1 個体あたり（10 穎花×画像 3 枚）1 分弱で実行することができ，従来法に 比べ組換え頻度の測定を短時間で大量に行うことができ る．本手法はイネだけでなく，Wx 座の変異によって花粉 のアミロース含量が変化する他の植物にも応用できると考 えられる．本研究では頴花あたりのウルチ型花粉数が 0 個 から 11 個と小数であったため肉眼によりウルチ型花粉の 計数を行ったが，吸光スペクトルの違いを利用して，ウル チ型，モチ型花粉を自動的に判別する手法も開発が可能で あると考えられる．このような手法を開発することでさら なる簡便化が期待される． 今回開発した手法を用いてウルチ型花粉の出現頻度に対 する RT 挿入の影響を調べたところ，RT 挿入によりウル チ型花粉の出現頻度が減少することが明らかとなった．こ のことから，RT 挿入により組換え頻度が減少することが 示唆された．組換え頻度の減少傾向は T65wx × ヒメノモ チ F1個体および 73wx1 × ヒメノモチ F1個体の両方で認め られた（第 3 図）ことからヒメノモチの RT 挿入は周辺の 組換え頻度に影響を与える可能性が示唆された．これまで に RT 挿入により組換え頻度が変化するという現象はトウ モロコシの組換えホットスポットである Stc1 遺伝子の上 流にレトロトランスポゾン Tekay が挿入されることでも起 きることが知られており（He and Dooner 2009），イネにお いても同様の現象が観察されたと考えられる．RT 挿入は 高 メ チ ル 化 状 態 に あ る 事 が 多 い た め（He and Dooner 2009），そのメチル化状態が周辺領域の組換え頻度に影響 している可能性がある．または RT の挿入が組換えにおけ る染色体の動態を物理的に阻害し，組換え頻度を減少させ ている可能性がある． 今回，イネ Wx 座をモデルとし，組換え頻度をより簡便 かつ正確に計測できる手法を開発することができた．本手 法を用いることで，花粉を含む細胞レベルで画像解析が可 能な形質を支配する遺伝子座における組換え頻度の制御に 関わる遺伝変異や組換え頻度に影響を及ぼす外的環境要因 の解析をより容易に行うことができる．したがって，本研 究はこれまでに解析が困難であった組換え頻度の制御機構 T65wx X 73wx1 T65wx X 䝠䝯䝜䝰䝏 X 䝠䝯䝜䝰䝏73wx1 0.074cM (61/165,388) 0.025cM (20/157,172) 0.010cM (8/154,118) 23bp㔜」 7.8kb RTᤄධ SNP p b 0 0 3 1 p b 4 1 6 1 ≀⌮㊥㞳 㑇ఏ㊥㞳 第 3 図 Wx 座の物理距離および遺伝距離．黒色およ び白色の三角形はそれぞれ T65wx に存在す る 23bp の重複およびヒメノモチに存在する 約 7.8kb の RT 挿入を示す．物理距離の下部 の数値はそれぞれの変異の間の塩基数を示 す．遺伝距離上部には算出に利用した遺伝子 型をそれぞれ示し，下部に遺伝距離を示した． 括弧内の数値は観察したウルチ型花粉 / 全花 粉数を示す．の研究を通じて育種学に貢献すると考えられる．
引用文献
Brown, J. and V. Sundaresan （1991） A recombination hotspot in the maize A1 intergenic region. Theor. Appl. Genet. 81: 185-188.
Civaldi, L., Y. Xia, K. J. Edwards, P. S. Schnable and B. J. Nikolau （1994） The relationship between genetic and physical distances in the cloned al-sh interval of the Zea mays L. genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91: 8268-8272. Colomé-Tatché M., S. Cortijo, R. Wardenaar, L. Morgado, B.
Lahouze, A. Sarazin, M. Etcheverry, A. Martin, S. Feng, E. Duvernois-Berthet, K. Labadie, P. Wincker, S. E. Jacobsen, R. C. Jansen, V. Colot and, F. Johannes （2012） Features of the Arabidopsis recombination landscape resulting from the combined loss of sequence variation and DNA methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109: 16240-16245.
Francis, K. E., S. Y. Lam, B. D. Harrison, A. L. Bey, L. E. Berchowitz and, G. P. Copenhaver （2007） Pollen tetrad-based visual assay for meiotic recombination in Arabidopsis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104: 3913-3918.
He, L., and H. K. Dooner （2009） Haplotype structure strongly
affects recombination in a maize genetic interval polymorphic for Helitron and retrotransposon insertions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106: 8410-8416.
Inukai, T., A. Sako, H.-Y. Hirano and Y. Sano （2000） Analysis of intragenic recombination at wx in rice: correlation between the molecular and genetic maps within the locus. Genome 43: 589-596.
岸根雅宏・奥西智也 （2011） DNA マーカーによる糯米検出 法．日本食品科学工学会誌 58:26-29.
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Wu, J., H. Mizuno, M. Hayashi-Tsugane, Y. Ito, Y. Chiden, M. Fujisawa, S. Katagiri, S. Saji, S. Yoshiki, W. Karasawa, R. Yoshihara, A. Hayashi, H. Kobayashi, K. Ito, M. Hamada, M. Okamoto, M. Ikeno, Y. Ichikawa, Y. Katayose, M. Yano, T. Matsumoto and, T. Sasaki （2003） Physical maps and recombination frequency of six rice chromosomes. Plant J. 36:720-730.
Development of a high-throughput method for examining the intra-genic
recombination frequency in Wx locus in rice using an image analysis
Anan Uenoyama1）*, Yohei Koide1,2,3） *, Takuji Tsukiyama1,4）, Masayoshi Teraishi1）, Yutaka Okumoto1） 1） Graduate School of Agriculture, Kyoto University（Kitashirakawa-Oiwake-cho, Sakyo-ku, Kyoto, 606-8502, Japan）
2） Hakubi Center for Advanced Research, Kyoto University
（Yoshida-honmachi, Sakyo-ku, Kyoto 606-8501, Japan）
3） Present address: Research Faculty of Agriculture, Hokkaido University
（Kita 9 Nishi 9, Kita-ku, Sapporo, 060-8589, Japan）
4） Present address: Faculty of Agriculture, Kindai University
（3327-204 Nakamachi, Nara City, Nara, 631-8505, Japan） *Equally contributed
Summary: Plant breeding is to select agronomically valuable genotypes from a diverse set of gene combinations established through hybridizations and subsequent genetic recombinations. Therefore, it is important for the breeding science to understand how to control the recombination frequency. In the present study, we developed a new high-throughput method for analyzing the recombination frequency within wx locus in rice using an image processing software （ImageJ） and analyzed the effect of a retrotransposon （RT） on the recombination frequency around it. To develop the method, we used two near-isogenic rice lines, T65wx and 73wx1. These lines have different mutations on Wx gene, which controls starch synthesis in rice. Although these two lines produce only wx type pollen, F1 plants developed from a cross between them produce Wx type pollen in a low
frequency because of an intra-genic recombination between the two mutations on Wx locus. Therefore, it is possible to analyze the recombination frequency from a frequency of Wx type pollen. In this study, we used an image processing techniques for counting the total number of pollen grains. This enabled us to count the number of pollen grains more effi ciently and precisely. By using the method described in this report, we also examined the effect of RT-insertion and found that an RT insertion on Wx gene reduces the intra-genic recombination frequency around the insertion.
Key Words：rice, Wx, recombination frequency, retrotransposon
Journal of Crop Research 61:45-49（2016） Correspondence: Yutaka Okumoto （[email protected]）
