DNASIS Pro では、任意のシーケンスから、お客様自身の手によって簡単に、特異性の 高い siRNA 設計を行うことができます。今回は Local Blast と Internet Blast の両方を 使う方法について、ご紹介します。 本マニュアルでは、お客様の PC に DNASIS ProV2.7 トライアル版がインストールされ、ファ イルが読み込めることと、インターネットに接続できることを前提としてご説明しております。 ワンペーパーマニュアルシリーズ入門編＜０＞と＜１＞と＜５＞をご参照下さい。 １．Local Blast 検索用データベースの構築 siRNA 設計機能では、siRNA ターゲット領域の特 異性を高めるため Blast 検索機能を使用します。 この際に Local Blast を実行するためには、あら かじめ Blast 検索の対象とするデータベースを構 築 す る 必 要 が あ り ま す 。 今 回 は 、 NCBI Reference Sequences(RefSeq)の Homo sapiens RNA のデータベースを作成します。 ①お手持ちのインターネット・ブラウザを開い て下さい。 ※本マニュアルでは Internet Explorer を利用しま す。 ②NCBI の RefSeq の FTP サイトにアクセスし て下さい。（図１) FTP サイト： ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/ Homo sapiens（H_sapiens）の RNA のディレク トリ（図１)に移動し、「rna.fa.gz」というファイル 名をクリックします。 図１ NCBI の RefSeq の FTP サイト ヒトの場合： ftp://ftp.ncbi.nih.gov/refseq/H_sapiens/H_sapie ns/RNA/ ③「rna.fa.gz」ファイルをダウンロードし、PC の 適当なディレクトリに保存します。 ④ダウンロードしたファイルを、解凍ソフトで解 凍します。 ※ファイルは gz 形式で圧縮されていますので、 解凍には、「解凍レンジ」 (http://www.vector.co.jp/soft/win95/util/se0 94501.html)や「Lhaplus」 (http://www.vector.co.jp/soft/win95/util/se1 69348.html)などをご利用下さい。 ⑤DNASIS Pro を起動し、解析ボタンビューの 下から２番目「データベース」タブを開いて下さ い。図２に示す解析ボタンが含まれています。 ⑥上から３番目にある「シーケンスデータベー ス」ボタンを押して下さい。図３に示すダイアロ グが表示されます。 図２ 解析ボタンビューの 「データベース」タブ、 上から３番目に「シーケンス データベース」ボタンがあり ます。
DNASIS Pro ワンペーパーマニュアルシリーズ
ー基礎編＜２０＞siRNA設計－
図３ Sequence Database Manager ダイアログ DNASIS Pro 内にある配列データベースを管理 するダイアログです。 ⑦右上の「New」ボタンを押して下さい。 ⑧表示されたダイアログの In-house タブを選 択して下さい。図４のようになります。 図４ New Database ダイアログ In-house タブを表示した状態 ⑨ 「 Name 」 に 、 「 human_rna 」 と 入 力 し ま す 。 「Data Source」は、fasta file(Nucleotide)を選 択し、右の…ボタンを押して、先ほど解凍した 「rna.fa」ファイルを指定します。
図５ New Database ダイアログ 「rna.fa」ファイルを指定した状態
⑩「OK」ボタンを押して下さい。
Sequence Database Manager ダイアログに 「human_rna」が追加されていれば成功です。 図６ リストにhuman_rna が追加 ⑪「OK」ボタンを押して、Sequence Database Manager ダイアログを閉じて下さい。 ⑫登録したデータベースを Local Blast 検索用 に変換します。解析ボタンビューの下から２番 目「データベース」タブを開いて下さい。図７に 示す解析ボタンが含まれています。 ⑬上から４番目にある「Blast 検索専用データ ベース」ボタンを押して下さい。図８に示すダイ アログが表示されます。
図８ Blast Database Manager ダイアログ 図７ 解析ボタンビューの 「データベース」タブ、 上から４番目に「Blast 検索 専用データベース」ボタンが あります。
⑭右上の「New」ボタンを押して下さい。
⑮Select Sequence Database ダイアログ（図 ９）が開くので、先ほど登録した「human_rna」 データベースを選択します。
図９ Select Sequence Database ダイアログ
⑯右下の「Make」ボタンを押して下さい。 Blast Database Manager ダイアログ（図１０）に 「human_rna」が追加されています。
図１０ Blast Database Manager ダイアログ リストにhuman_rna が追加された状態
⑰右の「Update」ボタンを押して下さい。 Blast Database Manager ダイアログの 「human_rna」の Status が Empty から Updated に更新されていれば成功です。
図１１ human_rna の Status が Updated に更新
⑱ 「 Close 」 ボ タ ン を 押 し て 、 Blast Database Manager ダイアログを閉じて下さい。 以上で Local Blast 検索用データベースの構 築は完了です。他の生物種のシーケンスに対 して Local Blast 検索を行いたい場合は、対象 となる配列ファイルをダウンロードし、上記の ①～⑱の手順を繰り返して下さい。 ２．siRNA 設計
⑲DNASIS Pro を起動し、Tutorial Data ディレ クトリから Tutorial4.fsa ファイルを開いて下さ い。図１２に示す表示となります。 図１２ DNASISPro メイン画面 DNA 配列データを読み込んだ状態 ⑳解析ボタンビューの 1 番下の「DNA-検索」 タブを開いて下さい。図１３に示す解析ボタン が含まれています。 図１３ 解析ボタンビュー の「DNA-検索」タブ、 １番下に「siRNA 設計」ボ タンがあります。
「siRNA 設計」のボタンを押して下さい。 図１４のようなダイアログが表示されます。
図１４ Analysis ダイアログ
「Parameter」ボタンを押して下さい。図１５に 示すダイアログボックスが表示されます。
図１５ siRNA Design Parameter ダイアログ
パ ラ メ ー タ 設 定 領 域 の 、 「 Pick up top…results」チェックボックスをオンにし、取 得 し た い 配 列 数 に １ ０ を 入 力 し ま す 。 ま た 「Pick up all results with same score」のチェッ クボックスをオフにします。
さ ら に Blast 検 索 設 定 領 域 の 「 Blast Search(Optional)」チェックボックスをオンにし、
今回は Local Blast 検索を実行するため、 「Use the Local Blast」 を選択します。
「Use the Local Blast」の右の「Setting 」ボ タンを押して下さい。図１６に示すダイアログ ボックスが表示されます。 図１６ Blast Parameters ダイアログ 「Nucleotide Database」で⑰で作成した 「human_rna」を選択して下さい。 設定が終了しましたら、「OK」ボタンを押し て、Blast Parameters ダイアログを閉じて下さ い。設定を破棄する場合は、Cancel ボタンを 押して下さい。１つ前の Analysis ダイアログに 戻ります。 の Analysis ダイアログで、「Execute」ボ タンを押して下さい。解析が実行され、結果が 図１７のように別ウィンドウで表示されます。 ※解析に利用する配列の長さや設定したパラメ ータによって、解析に非常に時間がかかるこ とがあります。 Blast 検索設定領域 パラメータ設定領域 21 21 22 22 23 23 24 24 25 25 26 26 27 27 2121
図１７ siRNA Design Results Viewer siRNA Design Results Viewer は 4 つのフィー ルドに分かれており、上からコメントビュー、マ ップビュー、グラフビュー、リストビューと呼び ます。 コメントビューには、解析に利用した配列の名 前やヒットした siRNA 数が表示されます。 マップビューには、解析に利用した配列に対 する、得られた siRNA のターゲット領域の位置 が表示されます。 グラフビューには siRNA ターゲット領域の GC％および Tm 値がグラフで表示されます。 リストビューには、得られた siRNA 設計結果が リストで表示されます。Blast 検索を実行した 場合は、siRNA ターゲット領域の Blast 検索結 果がリストの右側に表示されます。
siRNA Design Results Viewer のツールバーよ り 、 View メ ニ ュ ー か ら Show Blast Search Result を選択すると、リストビューで選択され ている全ての siRNA ターゲット領域の Blast 検 索結果が Homology Search Results Viewer で 表示されます。
３．siRNA 設計結果のエクスポート
注意：Trial 版では結果のエクスポートは行えません。 siRNA 設計の結果は tab 区切りの text 形式 のファイルでエクスポートすることができます。 siRNA Design Results Viewer のツールバーよ り、File メニューから Export list…を選択します。 すると、名前をつけて保存ウィンドウが開き、 siRNA 設計結果をエクスポートすることができ ます。
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ここまでは Local Blast を用いた siRNA 設計の 方法を紹介しましたが、Local Blast 検索用デ ータベースを構築せず、Internet Blast を使用 して siRNA 設計を行うことも可能です。ただし、 回線の状況や解析に利用する配列の長さに よって、解析に非常に時間がかかることがあり ます。 パラメータ設定の手順は[２．siRNA 設計]⑲～ をご覧下さい。
手順 において、siRNA Design Parameter 領 域の設定後、Blast 検索 設定領域の「Blast Search(Optional)」チェックボックスをオンにし、 「Use the Internet Blast」 を選択します。
図１８ siRNA Design Results Viewer 設定が終了しましたら、「OK」ボタンを押して、 Blast Parameters ダイアログを閉じて下さい。
解析実行手順は[２．siRNA 設計] ～ をご 覧下さい。
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