心 筋 虚 血 に 対 す る HSP 誘 導 の 効 果 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し て い る た め ， 心 筋 虚 血 前 ， す な わ ち 心 筋 梗 塞 発 症 前 に 予 め 遺 伝 子 操 作 に よ る HSP の 過 剰 発 現 ， あ る い は 高 熱 負 荷 (heat-shock, HS) の よ う な 操 作 に よ り HSP を 誘 導 さ せ た も の で あ る ． つ ま り ， 心 臓 が 心 不 全 に 陥 る 過 程 で の HSP の 役 割 に つ い て 検 討 さ れ た 報 告 は ほ と ん ど な い ． そ こ で ，本 研 究 で は ラ ッ ト の 心 臓 の 左 冠 状 動 脈 を 結 紮 す る (CAL) こ と で 心 筋 梗 塞 モ デ ル を 作 製 し ， 心 筋 梗 塞 後 か ら 心 不 全 に 至 る 過 程 で の 心 筋 組 織 の こ れ ら 4 つ の HSP の 変 化 に つ い て 把 握 す る と と も に ，心 筋 梗 塞 後 の HSP 誘 導 の 効 果 に つ い て 検 討 し た ． 第 一 章 心 筋 梗 塞 後 の HSP の 変 化 第 一 章 で は ， 心 筋 梗 塞 後 に 慢 性 心 不 全 に 陥 る 過 程 で の 心 筋 組 織 の ス ト レ ス 応 答 性 HSP (HSP72， HSPB1， HSPB5 お よ び HSPB8) 含 量 お よ び こ れ ら の HSP の 発 現
を 制 御 す る HSP 転 写 因 子 heat-shock transcription factor 1 (HSF1) の 細 胞 内 局 在
存 在 し ， 熱 シ ョ ッ ク な ど の ス ト レ ス に 応 答 し て 活 性 化 さ れ る ． こ の 活 性 化 さ れ た HSF1 は 核 に 移 行 し ， DNA の 熱 シ ョ ッ ク 応 答 配 列 に 結 合 し て HSP 遺 伝 子 の 転 写 を 開 始 さ せ る ．活 性 化 さ れ る 前 の 状 態 に あ る HSF1 は ，HSP90 お よ び HSP40 な ど の 分 子 シ ャ ペ ロ ン と multichaperone complex と 呼 ば れ る 活 性 抑 制 複 合 体 を 形 成 し 細 胞 質 に 留 ま る ． し か し な が ら ， 心 筋 梗 塞 後 不 全 心 で の HSF1 の 細 胞 内 局 在 お よ び そ の 修 飾 の 状 態 に つ い て は 未 だ 明 ら か に さ れ て い な い ． そ こ で ， 心 筋 梗 塞 後 不 全 心 で の HSP 誘 導 能 低 下 の 機 序 を 検 討 す る た め ， 不 全 心 で の HSF1 の 細 胞 内 局 在 お よ び multichaperone complex の 形 成 を 把 握 し た ． そ の 結 果 ， 心 筋 梗 塞 後 2 週 目 で は 熱 シ ョ ッ ク 負 荷 後 の 核 画 分 で HSF1 が 増 加 し た の に 対 し て ， 不 全 心 で の そ れ ら は 増 加 し な か っ た ． さ ら に ， 不 全 心 で は HSP90-HSF1 間 相 互 作 用 つ ま り HSF1 の 活 性 を 抑 制 す る multichaperone complex が 増 加 し て い る こ と を 見 出 し た ．つ ま り ，不 全 心 の HSF1 は ，熱 シ ョ ッ ク 負 荷 後 で も 不 活 性 な 状 態 に あ る こ と が 示 さ れ ，こ れ が 不 全 心 の HSP 誘 導 能 低 下 の 一 因 と 考 え ら れ た ． HSF1 は multichaperone complex 内 で HSP90 と 直 接 結 合 し て い る と 考 え ら れ て い る ． そ こ で ， 心 筋 梗 塞 後 心 不 全 ラ ッ ト へ の HSP90 阻 害 薬 17-allylamino-17-demethoxygeldanamycin (17-AAG) の 投 与 が ，不 全 心 の HSF1 の 活 性 化 お よ び HSP の 誘 導 に 及 ぼ す 効 果 に つ い て 検 討 し た ． そ の 結 果 ， 心 不 全 ラ ッ ト
へ の 17-AAG 投 与 は multichaperone complex か ら の HSF1 の 解 離 を 惹 起 し
(Figure 1A)， 熱 シ ョ ッ ク 負 荷 後 の HSF1 の 核 へ の 移 行 (Figure 1B) お よ び HSP72
誘 導 能 (Figure 1C) を 回 復 さ せ た ．こ れ ら の 結 果 か ら ，不 全 心 の HSP 誘 導 能 低 下 に
HSF1 の multichaperone complex 形 成 促 進 が 関 与 す る 可 能 性 を 示 し た ．さ ら に ，心
不 全 ラ ッ ト へ の 17-AAG 投 与 は multichaperone complex か ら HSF1 を 離 脱 さ せ ，
熱 シ ョ ッ ク 負 荷 後 の HSP 誘 導 能 を 回 復 さ せ る こ と を 示 し た ． 第 三 章 心 筋 梗 塞 後 か ら の HSP 誘 導 薬 geranylgeranylacetone 投 与 の 効 果 第 一 章 で ， 心 筋 梗 塞 後 の HSP 誘 導 障 害 が 心 機 能 低 下 ， つ ま り 心 不 全 へ の 進 展 に 関 8W-Sham 20 mm HSF1 A B C
Figure 1. Effects of 17 -All yl amino -17-Demethoxygeldanamycin (17 -AAG) treat ment on the
interaction between HSF1 and HSP90 (A) and nuclear localization of HSF1 ( B, arrow) at the end of heat-shock treat ment (HS), and HSP72 expression at 24 hr follo wing an exposure to HS (C) in the Sham (open colu mns) and CAL (closed colu mns) rats at 8th (8W) weeks aft er surger y. Each valu e represents the mean ± S.E.M. of 4 -6 independent experiments. *p<0.05 vs. the
与 す る こ と を 示 唆 し た ． さ ら に 第 二 章 で は ， 心 筋 梗 塞 後 不 全 心 で の HSP 誘 導 能 低 下 が HSP90 阻 害 薬 の 投 与 で 改 善 さ れ る こ と を 示 し た ． し か し な が ら ， HSP90 も 分 子 シ ャ ペ ロ ン の 一 つ で あ り 様 々 な タ ン パ ク 質 と 相 互 作 用 し ， そ の 機 能 発 揮 に 寄 与 し て い る こ と か ら ，心 不 全 治 療 薬 と し て HSP90 阻 害 薬 を 長 期 に 投 与 す る こ と は 困 難 で あ る ． そ こ で 第 三 章 で は ， 第 一 章 お よ び 第 二 章 の 実 験 結 果 を 鑑 み て ， 心 筋 梗 塞 後 ま だ ス ト レ ス 応 答 性 が 低 下 し て い な い 代 償 期 (心 筋 梗 塞 後 2 週 目 ) か ら の HSP 誘 導 の 効 果 に つ い て 検 討 し た ． 本 実 験 で は ， 長 期 的 に 投 与 が 可 能 な HSP 誘 導 薬 と し て ， 重 篤 な 有
害 作 用 の 少 な い geranylgeranylacetone (GGA) の 経 口 投 与 を 行 っ た ．GGA は HSF1
の 活 性 化 を 介 し て HSP の 発 現 を 誘 導 す る と 推 測 さ れ て い る ．そ こ で ， HSF1 に よ っ
て 発 現 が 制 御 さ れ て い る HSP の HSP72， HSPB1， HSPB5 お よ び HSPB8 の 左 心
室 心 筋 組 織 で の 含 量 に 対 す る GGA 投 与 の 効 果 を 評 価 し た ． そ の 結 果 ， 術 後 8 週 目
の CAL-GGA 群 で は ， HSP72， HSPB1， お よ び HSPB8 含 量 の 術 後 2 週 目 か ら の
減 少 が 抑 制 さ れ た (Figure 2A-C)． 次 に ， GGA 投 与 後 の 心 機 能 の 評 価 を 行 っ た ． 術
後 8 週 目 の CAL-GGA 群 で は ，CAL-Vehicle 群 で 観 察 さ れ た 心 機 能 低 下 が 改 善 さ れ
た (Figure 3A)． す な わ ち ， CAL 群 で は ， GGA 投 与 に よ り 代 償 期 の 心 機 能 が 維 持 さ
れ ， 心 筋 梗 塞 後 の 心 不 全 へ の 進 展 が 抑 制 さ れ た と 考 え ら れ た ． さ ら に ，GGA の 心 保 護 機 序 を 明 ら か に す る た め に ，心 筋 梗 塞 後 の 心 機 能 低 下 の 一 因 と 考 え ら れ て い る 心 筋 組 織 の ミ ト コ ン ド リ ア エ ネ ル ギ ー 産 生 能 の 低 下 に 及 ぼ す GGA 投 与 の 効 果 に つ い て 検 討 し た ．Small HSP の HSPB1，HSPB5 お よ び HSPB8 は 細 胞 へ の ス ト レ ス に 応 答 し て ミ ト コ ン ド リ ア に 移 行 し ， ス ト レ ス か ら ミ ト コ ン ド リ ア を 保 護 す る と 推 測 さ れ て い る ．そ こ で ，GGA 投 与 後 の ミ ト コ ン ド リ ア small HSP 含 量 を 測 定 し た ． そ の 結 果 ，GGA 投 与 に よ り ， 心 筋 梗 塞 後 の ミ ト コ ン ド リ ア 画 分 で の HSPB1， 活 性 型 HSPB5 お よ び HSPB8 含 量 の 減 少 が 抑 制 さ れ (Figure 4A-C)， 同 時 に ミ ト コ ン ド リ ア エ ネ ル ギ ー 産 生 能 が 保 持 さ れ る こ と が 示 さ れ た (Figure 3B)． こ れ ら の こ と か ら ， 心 筋 梗 塞 後 2 週 目 か ら の GGA 投 与 の 効 果 の 一 つ と し て ， 心 筋 梗 塞 後 の ミ ト コ ン ド リ ア で の small HSP の 減 少 抑 制 に よ る ミ ト コ ン ド リ ア エ ネ ル ギ ー 産 生 能 の 保 持 が 示 唆 さ れ た ． * *# * # * #
Fi gu re 2 . Effec t of gera n ylge ran yla c et on e (GGA) t rea t men t on ch an ges in th e left ven t ric u la r HSP 72 (A), HSPB1 (B ) and HSPB8 (C ) c on t en t s of th e Sh am (op en c olu mns) and C AL (h at ch ed c olu mn s) rat s a t 2nd (2 W) and 8 th (8 W) week s a ft er su rger y. Ea ch va lu e rep res en t s th e mea n ± S. E.M . of 6 an i ma ls . *p <0. 05 vs. th e c orresp on din g Sha m group s. # p< 0. 05 vs. C AL -Veh i c le grou p.
本 研 究 の 結 果 か ら ， 心 筋 梗 塞 後 の HSP 誘 導 障 害 が 心 不 全 へ の 進 展 に 関 与 す る こ と
が 示 唆 さ れ た ．そ し て ，こ の 不 全 心 の HSP 誘 導 能 低 下 に は multichaperone complex
形 成 促 進 に よ る HSF1 の 不 活 性 化 が 関 与 す る 可 能 性 を 示 し ， HSF1 の
multichaperone complex 形 成 を 阻 害 す る 17-AAG 投 与 で HSP72 誘 導 能 が 回 復 す る こ と を 示 し た ． さ ら に ， 本 研 究 で は ま だ ス ト レ ス 応 答 性 が 低 下 し て い な い 心 筋 梗 塞 後 2 週 目 の 代 償 期 か ら の GGA 投 与 で ， 心 筋 梗 塞 後 の 心 不 全 へ の 進 展 が 抑 制 さ れ る こ と を 示 し た ． こ の 一 因 と し て ， 心 筋 梗 塞 後 の ミ ト コ ン ド リ ア で の small HSP の 減 少 抑 制 に よ る ミ ト コ ン ド リ ア エ ネ ル ギ ー 産 生 能 の 保 持 が 関 与 す る こ と を 示 唆 し た ． 以 上 ， 本 研 究 は 心 筋 梗 塞 後 の 心 筋 組 織 で の HSP の 変 化 を 明 ら か に す る と と も に ， 心 筋 梗 塞 後 で の HSP 誘 導 の 効 果 に つ い て 新 た な 知 見 を 提 示 す る こ と が 出 来 た ． 【 研 究 結 果 の 掲 載 誌 】
1) Biol. Pharm. Bull., 36:529-539, (2013). 2) Biol. Pharm. Bull., 36:1332-1340, (2013). 3) J. Pharmacol. Sci., 123:336-346, (2013). 4) Eur. J. Pharmacol., 730:140-147, (2014).
Fi gu re 3. Effec t of gera n yl ge ran yla c et on e (GGA) t rea t ment on c ha n ges i n c a rd i ac ou tpu t i nd ex (A) an d lef t ven t ri cu la r mi t oc h on d ri a l ox y gen c onsu mpt i on rat e (OC R ) (B ) of th e Sh a m (op en c olu mns) an d C A L (h a tch ed c olu mn s) rat s. Ea c h va lu e rep res en ts th e mea n± S.E.M . of 6 an i ma ls. *p< 0.0 5 vs. th e c orresp ond in g Sh a m. # p<0 .0 5 vs. C AL -V eh ic le gr oup .
# * # * # * # * A B
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Fi gu re 4 . Effec t of gera n ylge ran yla c et on e (GGA) t rea t men t on ch an ges in th e mi t och ond ria l HSPB1 (A), ph osph or yla t ed HSPB5 ( B ) an d HSPB 8 ( C ) c ont en t s of th e Sh am (op en c olu mn s) and C AL (h at ch ed c olu mn s) ra t s. Ea ch va lu e rep resen t s th e mea n± S. E. M. of 6 a ni ma ls. *p< 0.0 5 vs. t h e c orresp ondi n g Sh a m group s. #p <0 .05 vs. C AL -V eh i c le grou p.
論 文 審 査 の結 果 の要 旨 丸 ノ内 徹 郎 氏 の論 文 は、ラット心 筋 梗 塞 後 不 全 心 での熱 ショックタンパク質 の変 化 お よびその 誘 導 が心 機 能 に及 ぼす 効 果 について検 討 したも のである。熱 ショックタンパク質 は、様 々な障 害 か ら の 細 胞 防 御 に 中 心 的 な 役 割 を 果 た す タ ン パ ク 質 と 考 え ら れ て い る 。 特 に 分 子 量 40 kDa 未 満 の低 分 子 量 熱 ショックタンパク質 (small HSP) ファミリーの HSPB1、HSPB5 と HSPB8 および分 子 量 約 70 kDa の HSP70 ファミリーの HSP72 は、心 筋 組 織 での発 現 量 が多 いことが知 られている。しかしながら、心 筋 梗 塞 後 心 不 全 発 症 の過 程 でのこれら熱 ショッ クタンパク質 の変 化 については未 だ不 明 な点 が多 い。 第 1 章 では、心 筋 梗 塞 後の心 筋 small HSP (HSPB1、HSPB5、 HSPB8) と HSP72 の 含 量 変 化 について検 討 した。その結 果 、心 機 能 が保 持 される心 筋 梗 塞 後 2 週 目 では、これら HSP 含 量 は増 加 あるいは増 加 する傾 向 にあるものの、心 筋 梗 塞 後 8 週 目 の不 全 心 では正 常 心 筋 と同 じレベルとなり、HSP 発 現 の亢 進 した状 態 が維 持 されないことを示 した。この不 全 心 での HSP 発 現 低 下 には、HSP の転 写 因 子 HSF-1 の活 性 化 能 の低 下 に起 因 する可 能 性 を示 した。 第 2 章 では、心 筋 梗 塞 後 不 全 心 でのストレスに対 する HSF-1 の機 能 低 下 の機 序 について検 討 した。典 型 的 な HSP 誘 導 刺 激 として高 温 暴 露 （熱 ショック）を行 い、HSP 誘 導 の指 標 とし て、心 筋 HSP72 含 量 を測 定 した。その結 果 、不 全 心 では熱 ショック負 荷 後 の HSP72 発 現 量 の増 加 が観 察 されなかった。不 全 心 では、HSF-1 が HSP90 との複 合 体 を形 成 しており、 細 胞 質 から核 には移 行 しない状 態 にあることを見 出 した。そこで、HSP90 阻 害 薬 のゲルナダマ イシン誘 導 体 17-AAG を熱 ショック前 に投 与 した。その結 果 、薬 物 処 置 群 では、熱 ショック後 に心 筋 梗 塞 後 不 全 心 で も正 常 心 臓 と 同 等 のレベルの HSP72 誘 導 が観 察 された。これらの 結 果 から、心 筋 梗 塞 後 不 全 心 では、HSF-1 の細 胞 質 から核 への移 行 を妨 げる HSP90 複 合 体 形 成 が促 進 され、HSP 誘 導 能 が低 下 するという新 たな知 見 を提 示 した。 第 3 章 では、HSP 誘 導 能 を有 するゲラニルゲラニルアセトン (GGA) 投 与が、心 筋 HSP 発 現 および心 機 能 に及 ぼす効 果 について検 討 した。HSP 誘 導 能 が保 持 されている心 筋 梗 塞 後 2 週 目 から GGA を投 与 したところ、心 筋 梗 塞 後 8 週 目 でも、GGA 投 与により心 筋 梗 塞 後 2
週 目 の small HSP と HSP72 発 現 レベルが維 持 された。GGA 投 与 群 では small HSP
