関す る遺伝子工学

リン ゴ果 実 の エ チ レ ン生 合 成 制 御 に

関す る遺伝子工学

(研究課題番号 :

09

660001 )

平成

9

1 1

(C) (2)

研究成果報告書平成

12 年 3 月

研究代表者:原(弘前大 田 竹 雄

リン ゴ果実 のエ チ レン生 合 成制御 に関す る遺伝 子工 学

研 究組 織

研 究 代 表 者 :原 田竹 雄 (弘 前 大 学 農 学 生 命 科 学 部 助 教 授 ) 研 究 分 担 者 :な し

研 究 経 費 :

平 成 9年 度 平 成

1 0

11

計

1,700

600

800

3,1 00

研 究 発 表 等

(1) 学 会 誌 等

Suna koT

Sa kur a baW, Se ndaM

AkadaS,I s hi ka waR

Ni i ze kiM a ndHa r adaT:

Ana l l el eoft her l pe nl ng‑ S pe ci f i c1‑ a mi noc yc l opr opa ne1‑ c a r boxyl i ca ci ds ynt ha s e gene( ACSl )i na ppl ef r ui twi t hal ongs t or a gel i f e. Pl antPh ys i o

.1 19:1 2971 1303 1999.

Ha r adaT

Suna koT

Wa ka s a

Soe J l ma

Sa t ohT

Ni i ze ki

Ana l l el eof t he1‑ a mi noc yc l opr opa ne ‑ l l Ca r boxyl a t es ynt ha s ege ne

a cc ount sf or t hel ow l e velofe t hyl e ne pr oduc t i oni nc l i ma c t e r i cf r ui t sofs omea ppl ec ul t i va r s . The o r . Appl .Ge ne t . i npr e s s2000･

Suna koT

I s hi ka waR

Se nda

Aka daS

Ni i ze ki

a ndHa r a daT ( 2000) MdACS‑ 5A ( Ac c e s s i onNot ABO34992)a nd5B ( Ac c e s s i onNo. ABO34993)

Two Wound‑ Re s pons i veGe ne sEnc odi ng1 ‑ Ami noc yc l opr opa ne ‑

‑ Ca r boxyl a t e Synt ha s ei nAppl e . ( PGR00‑ 030) Pl antPh ys i o

･1 22:620.2000.

( 2)

桜 庭 和 歌 子 ･砂 子 智 美 ･原 田竹 雄 ･千 田 峰生 ･赤 田辰 治 ･石 川 隆 二 ･新 関 稔 : リ ン ゴ

ACC

5'

sI NE

92

1 997

9

砂子智美 ･原田竹雄 ･千 田峰生 ･赤 田辰治 ･石川隆二 ･新関 稔 :リンゴ果実内の

A C C

A CS )

93

1 9 97

4 月.

∴' ; : : . , ; ･7

/′‑r† /*′‑一一一一̲I

∫)㌔

原田竹雄 ･砂子智美 ･佐久間智宏 ･千田峰生 ･赤田辰治 ･石川隆二 ･新関 稔 :リ ンゴ栽培品種の

A C S l

(横浜市立大学)1997年

4

砂子智美 ･石川隆二 ･千田峰生 ･赤田辰治 ･新関 稔 ･原田竹雄 :リンゴ各組織 に お ける

A C C

(岩手大学) 1998年9月.

桜 庭 和 歌子 ･神 修 平 ･石川 隆二 ･千 田峰生 ･赤 田辰 治 ･新 関 稔 ･原 田竹 雄 :リ ン ゴに見 出 され た レ トロポ ゾ ン Md‑SINElにつ い て. 日本 育種 学 会 第 94回講 演会 (岩手 大 学 ) 1998年 9月.

原 田竹 雄 ･砂 子 智美 ･佐 藤 耕 ･副 島淳一 ･新 関 稔 :リ ン ゴにお け る

A C C

合 成 酵 素 遺 伝 子 (Md‑

A CS l )

砂 子 智 美 ･石 川 隆二 ･千 田峰生 ･赤 田辰 治 ･新 関 稔 ･原 田竹 雄 :リン ゴ

A C C

合 成酵 素 遺伝 子

( A C S )

Harada,T,SunakoT,SoeJlma∫,SatoT,NiizekiM∴Low ethyleneproductionin thefruitofsomeapplecultivarsiscausedbyamutationintherlpenlngSpecific ACCsynthasegene.XVIInternationalBotanicalCongressAbstracts,604,

(St.Rouis),1999･

若 佐 雄 也 ･神 修平 ･石川 隆 二 ･赤 田辰 治 ･新 関 稔 ･原 田竹 雄 :リン ゴ果 皮 赤色 化 遺伝 子 Rfに連鎖 す る DNAマ ー カー に兄 い だ された トラ ンス ポ ゾ ン Md‑Tnlにつ い て. 日本 育種 学会 第 96回講演会 (岡山大 学 )1999年 9 月 .

(3) 出版 物

原 田竹 雄 :リ ン ゴの貯 蔵 性 を高 め る

A C C

HaradaT,SunakoT,SakurabaW,SendaM,AkadaS,IshikawaRandNiizekiM:

Md‑ACSl,afruitripenlng1‑aminocylopropane‑1‑carboxylatesynthasegeneof apple･BreedingandBiotechnologyforFruitTrees･NIFTS/CISROp42‑45･1998

は じめ に

リンゴは世界 にお ける生産高が約

4 0 0 0

1 0 0

5

1 9 9 8 ).

一方,長 い もの は常 温貯蔵 ,冷蔵 ,

c A

ら, リンゴで は周年 に近い出荷体制がで きている.

ライブニ ングは果実の肥大生長が止 まってか らの有機酸の消失 ,細胞 の軟弱 化 な どの生理現象 をい う. リンゴの成熟 はライブニ ングに伴 って呼吸量が急激 に上昇す るク リマ クテ リック型であ り,エチ レンが ライブニ ング過程へ の プロ グラムス イ ッチであることが判 ってい ることか ら, リンゴの成熟や貯蔵性 はエ チ レンの生合成 と密接 な関係 にある と思われる｣実際に,品種 に よ りライブニ ング過程 でのエチ レン生成量 はか な り異 な り, ライブニ ングが ゆっ くりと進行 す る品種 で はエチ レン生成量 が比較 的少量 である とい う報告 が あ る こ とか ら

( c h u1 9 8 8

G es s ma ne tal .1 9 9 3

1 9 9 7 )

については不 明であ った.

エ チ レンの生合成 は,メチオニ ン

‑S‑

( S A M )‑1‑

1

( A C C )

( Y a n g a n dH of f ma n1 9 8 4 )

S A M

A C C

A C C

( S‑ a d e n o s yl ‑ L一 m et h yl t hi o a de n osi nel y a s e

E C 4. 4. 1 . 1 4 )

明 らか にされている.エチ レンは果実の ライブニ ングのみな らず,植物生 長の 多 くの過程 を調節 しているホルモ ンである.その生成 は,時期 お よび組織特異 的に行 われ, また,傷害,病原菌の感染,高温 などのス トレス に よって も一過 的に活性化す る

( Ya n ga n dH of f ma n1 9 8 4 ).

A C C

( A C S )

8

( S hi ue ta l .1 9 9 8 )

5

( Li a n geta l .1 9 9 6 )

の

A C S

M d‑ A C S l ( D o n ge ta l . 1 9 91

L a y‑ Y e ea n dK ni g ht o n1 9 9 5 )

M d‑ A C S 2

M d‑ A C S 3 ( R os e nfi el de tal .1 9 9 6 )

M d‑ A C S 4 ( Ki neta l . 1 9 9 2 )

4

A C S

c D N A

, M d‑ A C S l

D N A

( H a r a dae t a l . 1 9 9 7 )

M d‑ A C S

本研 究では, リンゴの ライブニ ング果実での これ ら

M d‑ A C S

‑ 1‑

解析 を進 めた. また, これ らの解析 結 果 とライブニ ング時のエ チ レン生成量 の 関係 につ いて も詳細 に検討 した. さ らに,本研 究 を通 して新 た に単 離 された Md‑ACSに関す る特徴 づ け を進 めた.

Ⅰ リ ン ゴ果 実 内 の

ACC

( ACS)

リンゴ果実の ク リマ クテ リック型 ライブニ ングにおけるエチ レンの 関与 は古 くか ら知 られてお り,果実の貯 蔵性 とエチ レンに関す る様 々な研 究が精力 的 に 進 め られて きた

( c h u1 9 8 8

G e s s ma netal .1 9 9 3

1 9 9 7 ).

( S a y m o u reta l . 1 9 9 3 ).

A C S

c D N A

3

報

( D o n getal .1 9 9 1

L a y‑ Y e ea n dK ni g ht o n1 9 9 5

R os e nfi el de t a l . 1 9 9 6 ).

我 々は Md‑ACSlの ゲ ノ ミック構 造解析 を通 して,Md‑ACSlには基本 型 であ る

1‑ 1

1 6 2 b p

M d‑ SI N El

1‑ 2

2

つ の対 立 遺伝 子 が存在 す る こ とを明 らか に した

( H a r a d ae ta l . 1 9 9 8 ).

c D N A

( D o n geta l .1 9 9 1

L a y‑ Y e ea n dX ni g ht o n1 9 9 5 )

は遺伝子型が

1‑ 1 / 1‑ 2

c D N A も 1‑ 1

1‑ 1

1‑ 2

そ こで本 章で は これ らの遺伝 子 の発現様 式 につ いて詳 しく検 討 した.す なわ

ち

,1‑ 2/ 1‑ 2

のホモ型 である ̀ふ じ' と

1‑ 1 / 1‑ 2

1‑ 2

R T‑ P C R

材料お よび方法

1 .

弘前大 学農学部付属藤崎農場 よ りサ ンプ リング された, リンゴ栽培 品種 ̀ゴ ールデ ンデ リシ ャス'お よび ̀ふ じ'の プ レク リマ クテ リック とク リマ クテ リ

ックの果実 を用 いた.

2 .

I E C )

果実内エチ レン濃度 は,果実 の陽光面 とその反対側か ら果実 を切 り取 り,水 の入 ったデシケー ター内で果実内の気体 を回収 し,注射器で採取 した 1

ml

( S HI M A D Z UG C‑ 8 AG A SC H R O M A T O G R A P H )

り測定 した.測定値 は

5

3.

ゲノ ミック

D N A

v a r a d a r aj a ne ta l . ( 1 9 91 )

C s Cl 2 ‑ Et Br

D N A5F Lg

1 0 0F Ll

0. 8%

2 3 V 1 5

時 間行 った.泳動終 了後 ,

Al k al it r a ns f e rb uf f e r ( 0 . ̀ 4NN a O H )

‑ 3I

メ ンブ レンフィル ター

( H y b o n d

N + ;A me r s h a m )

2 4

5×S S C

5

2×S S C

5

した.ハ イブ リダイゼーシ ョンは,

H y b ri di z ati o nb uf f e r ( 6×S S C

2m ME D T A p H8. 0

1 0m MTri s‑ H Clp H7 . 5

5×D e n h a r d s

0 . 2m gS al m o nS p e r m a r yD N A

1 0m MN a 3 P

｡ , 1

N aN‑ L a u r o ylS al c o si n a t e )

P ri me‑ I tⅡR a n d o mP ri me r La b el i n gKi t( S T R A T A G E N E )

3 2 p

D N A

( 2 0 0n g )

6 5℃1 2

w a s hi n gb uf f e r( 2×S S C

0 . 1 %S D S )

2 0

2

( 0. 2×S S C

0 . 1 0 / O S I ) S )

6 5o C

2 0

分 間 2 回洗浄 した.その後,オー トラジオグラフィーに よるシグナル検 出 を行 った.

4.R N A

D o n geta l . ( 1 9 9 1 )

R N A

5g

4 0ml

. 0 Mg u a ni di n e i s ot hi o d y a n a t e

1 0m ME D T A

3 0 0m MTri sp H 7 . 5

1% 2‑ me r c a pt o et h a n ol

0. 5% s o di u ml a t l r O yls a r c o si n e )

1 0

p ol y vi n yl p yr r ol i d o n e( 1 / 1 0F W )

2

4℃

8 , 0 0 0r p m

で

1 5

C s C1 2

2 0℃

2 5 , 0 0 0r p m

で

2 4

R N A

5.

全

R N A2 0〃g

R N A

( 1×M O P S

5 0% f or m a mi d e

2 . 2M f or mal d e h y d e

1 0m ME D T A )

6 5℃ 1 5

( 0 . 01 % B P B

0. 0 2 5% X C

0 . 0 5m g / mlEt B r )

1 . 2%

( 1

M O P S

0 . 6 6Mf or mal d e h y d e

1 . 2%

4 0 V

2. 5

1 0×S S C

2 0

2

2 0×S S C

R N A

( H y b o n d‑ N )

U v

5 0% f or ma mi d e

5×D e n h a r dt ' ss ol uti o n

0. 5%S D S

5×S S P E

2 0〃g/ mls al m o n s p e r mD N A

3 2 p

D N A

4 2℃

2×S S C / 0 . 1 % S D S

5

2

0. 2×S S C / 0 . 1 % S D S

1 0

0. 2×S S C / 0 . 1 % S D S

6 5℃

1

6.R T‑ P C R

T ot alR N AI O〃g

2 0〃1

( 5 0m MK C

1 0 m MTri s‑ H Clp H8 ･ 3

5m M M g Cl

im Md N T P s

lF LM Ol i g o( d T ) p ri m e r

5 0 u ni t sM u L V r e v e r s e

t r a ns ｡ ri pt a s e;P E R KI NE L M E R , 2 0 u ni t sR N a s el n hi bi t or;P E R KI NE L … E R )

4 2℃

1

‑9 4℃

5

c D N A

c D N A

1 0 0〃1

P C R

( 5 0m MK C

1 0m M

Tri s‑ H Clp H8. 3

2 . 5

MM g C1 2

2 0 0〃Md N T P s

0 . 4〃Mp ri me r s( A C S 1‑ 3 ' A )

5unitsTaq polymerase)中で,94℃,2分‑45℃,1分‑72℃,3分 の反応 を 30サ イクル継続す るこ とに よ り,cDNA の増 幅 を行 った.増幅 した DNA は さ ら

に内側 の プ ライマ ー (ACS1‑3'B)を用 いて PCR 反応 を行 った.

7.PCR反応

ACSトA,ACS1‑Bの両 プローブはプラス ミ ド pAP1‑6を,ACS3プローブは リン ゴ品種 ̀旭 'の葉か ら抽 出 した DNAをテ ンプ レー トとした pcRの増 幅産物 を利 用 した. これ らの DNAは pcR反応 液 (10mMTris‑HCl pH8.3,50mMKCl,12.5 mMMgC12,0.2mMdNTPs,0.5FLMprimers,2unitsAmpliTaqGoldT";PERXINELMER)

中で 94℃,1分 反応 させた後 ,94℃ 1分 ,55℃ 2分 ,72℃ 3分 のサ イクル を 40回行 った.pcRと RT‑PCRに用 いた プ ライマ ーを下記 に示 す.尚,数値 は ACSl

に関す る もの は AccessionNo.U89156,ACS3に関す る もの は U73816に対応 す る番号 であ

ACS1‑AF ACS1‑AR ACSl‑BF ACSトBR ACS3‑F ACS3‑R ACSL3'AF ACS1‑3'AR ACSll3'BF ACS1‑3'BR

結果

る.

5'TACCATGAGGTCCACAACAC3' 5'GGTGAGCACTAAGTGGTTGGG3' 5'GATGAAAGGTAGCCTGGTCTGA3' 5'TACACTAATCACATTGTATAGAATC3I

5'GACAAATAGAAAGAGACCTGAGGACG3' 5'ccATCGATTATACAAACTGATTGTG3' 5'TCCACAACACAAACGGGATTATTCA3' 5'AGGCTACCTTTCATCTACCGGGA3' 5'ATCTTCTCGAGTCATGGCTGGC3'

5'TTTCATCTACCGGGAATAGGACCGCGG3'

2302‑2321 2813‑2793 4056‑4077 4513‑4489 1086‑1110

1573‑1549 3312‑3336 4070‑4048 2489‑2510 4062‑4036

1.Md‑ACSlお よび Md‑ACS3に対す る特 異的なプローブの作 製

pcRに よ り ACS1‑A,ACS1‑B,ACS3の DNA プローブの調製 を試 み た.ACSlプ ローブは Md‑ACSlが挿入 されているプ ラス ミ ド (pAP116)を, また,ACS3プロ ーブは品種 ̀旭 'の葉 か ら抽 出 した全 DNAをテ ンプ レー トとした pcRに よる増 幅産物 を用 いた.ACS3の PCR産物 は プラス ミ ドに挿入 し, シークエ ンスす るこ とで Md‑ACS3の一部 で あることを確 か めた.また,Md‑ACS2 (Rosanfieldeta

l .

なか った.

作 製 された プ ローブはその特異性 を調べ るため に, リンゴ品種 ̀ふ じ', ̀ゴ ールデ ンデ リシ ャス', ̀印度'か ら抽 出 した全 DNAを

Ec o R I

‑ 5‑

バ ン ド以外 に もシグナルが見 られた. また,

3 '

A C S 1‑ B

2 . 1 k b

Md‑ACS3では Md‑ACSlお よび Md‑ACS3に対 し,比較的相 同性 の低 い

3'

21 2 ) .

A C S 3

2.

先 ず ,Md‑ACSlの対 立遺伝子 間の発現の違 い を検討 した (図 213).Md‑ACSl には基本 型の

1‑ 1

5 '

SI N E

1‑ 2

ト2/ 1‑ 2

1‑ 1 / 1‑ 2

̀ふ じ'の内部エチ レン濃度

( I E C )

1 6/ ∠1/1

0 . 7

〃1/1

2 0℃

1 2

2 9 8/ ∠1/1

5 7〃1/1

1 2

R N A

A C S l

一方, ク リマ クテ リツク果実で は ̀ゴールデ ンデ リシ ャス'では強い発現がみ られ たが , ̀ふ じ'で は極微弱の シグナルが認 め られた. この メ ンブ レンを用 い て

A C S 3

A C S

A C S 3

次 に, ̀ふ じ'で得 られたシグナルが実際に ACSl‑2型由来の ものであるか を 確 か め るた め に

R T‑ P C R

4 )

4 A

( A C S 1‑ 3' B F

A C S 1‑ 3 ' B R )

I

1‑ 1

5 2 2 b p

1‑ 2

3 '

I

4 4 7 b p

7 5 b p

Ⅲ

D N A

1 0 5 2 b p

c D N A

7 4 5 b p

R T‑ P C R

D N A

4B

1‑ 1

1‑ 2

これ らの結果か ら,

1‑ 2

1‑ 1

デ ンデ リシ ャス'の ように発現が認 め られない場合 もあるこ とが判 明 した.

考 察

リンゴ栽培 品種 ̀ゴールデ ンデ リシャス'には ライブニ ング時 に発現す る

A C S l

が

1

R T‑ P C R

1‑ 1

1‑ 2

R T‑ P C R

( H a r a d aeta l .1 9 9 8 ) .D o n ge ta l . ( 1 9 9 1 )

L a y‑ Y e e a n dK ni g ht o n ( 1 9 9 7 )

c D N A

1‑ 1

良 T‑ P C R

1‑ 2

1‑ 2

ト2

ト1

Md‑ACSl12にはプロモーター領域 に

M d‑ SI N El

‑ 7 81 b p

1 6 2 b p

5'

A C O ( Bl u mee ta l . 1 9 9 7 )

A C S ( S hi net a l . 1 9 9 8 )

ない こ とか ら挿入‑ の影響 は不 明であ る.両対立遺伝 子 間には 5'上 流域 に塩 基 置換が複数あ ることか ら, シス因子の 1塩基変異 に よって転写活性が異 なる こ とも予想 され る.

1‑ 2

ト2

sI N E

を除去 した際の プロモー ター活性 を測定す る解析 が必要 となるだろ う.

トマ トでは8つある ACSファミリーの 中で 2つが ライブニ ング時 に発現 して い る

( Li nc ol ne tal .1 9 9 3

N a k at s u k ae tal .1 9 9 8 ).

3

( R o s e nfi el deta l . 1 9 9 6 )

らの 中で Md‑ACSlのみ ノーザ ンハ イブ リダイゼ ーシ ョンに よる転写解析 が行 わ れている

( D o n ge ta l .1 9 9 1 ).

D o n get a l . ( 1 9 91 )

きなか ったため, この遺伝子 の発現 については検討 しなか った.

‑ 7‑

Ⅲ

Md‑ ACSl

リンゴ栽培 品種 ^̀ゴールデ ンデ リシ ャス'の ライブニ ング時 に発現 す る

A C C

合成酵素遺伝子

( A C S l )

ト1

5'

Md‑ SI NEl

ト2

ト1

ト2

1‑ 2

1‑ 2

2

A C Sl

リンゴ果実のエ チ レン生成量 は品種 に よってか な り異 なるこ とが知 られてい る

( C h u1 9 8 8

G e s s ma netal .1 9 9 3

1 9 9 7 ).

pcR

Md‑ SI NEl

M d‑ A C S l

1‑

1

1‑ 2

3

M d‑ A C S l

との関係 につ いて検 討 す るため,熟期 が異 なる

3 0

A C S l

×

材料 お よび方法

1.

弘前大学 農学部 附属藤 崎農場 お よび青森県 りん ご試験場 で栽植 されてい る リ ンゴ栽培種 を材料 と して使用 した.また, ̀王林 '

×

F

1 9 8 9

2 0℃

1 2

1 9 9 8

,1 9 9 7

4℃

1 9 9 7

1 2 月 8

2 0℃

1 2

2 .

ク リマ クテ リック果実 の内部エチ レン濃度の測定 は果実 の陽光面 とその反対 側 よ り果 肉の一部 を包丁 で切 り取 り (約

3 0 g)

内の充分 に脱気 された蒸 留水 中 に沈 め,逆 さに したガ ラス製の ロー トを用 いて 減圧下 で回収 された果 肉内の ガス を注 射器 で

1ml

5

3.Md‑ ACSl

各個 体 の成業 か ら全 DNA を抽 出 し (Varadarajam eta

l .

ACS1‑F 5'AGAGAGATGCCAm TTGTTCGTAC3' 861‑887 ACSLR 5'CcTACAAACTTGCGTGGGGATTATAAGTGT3' 1379‑1350

数値 は AccessionNo.U89156の塩基配列番号 に対応 す る.反応 液 の電気 泳動 像 よ り,増 幅産物 のサ イズの違 いか ら 1‑1型 ,1‑2型 を判定 し,各個体の

ACS l

結果

1.ACSl

Md‑ ACSl‑ 1

Md‑ ACSl1 2

sINElが挿入 されてい る) の前後 に設定 した プ ライマ ー (ACS1‑F,ACS1‑氏)を 用 いた pcR 実験 に よ り, リン ゴ栽培 品種 お よび野生種 の

ACSl

2.

ACSl

( 7

1 1

ACS l

1‑ 2

1‑ 1

‑ 9‑

3.F

̀王林'× ̀グラニース ミス'の

F

p c R

1 6

1 3

図

3‑ 5

1‑ 2

ト1

F

1‑ 2

1‑ 1

考察

エチ レ㌢生合成系の

A C C

( M d‑ A C S l )

A C S l‑ 2

Md‑ SI N El

A C S l1 2

しか し, ̀ゴールデ ンデ リシャス'や ̀ふ じ' による

1‑ 2

sI N E

1‑ 2

5'

sI N E

1‑ 1

A C S l‑ 2

SI N E

う.

果実 内エチ レン量の測定はリンゴの栽培品種 とFl個体群 を対照 とした. リン ゴは他殖 性 であ るため様 々な遺伝子の変異が蓄積 してい る.そ こで, ̀王林 '

× ̀グラニース ミス'の

F

1‑ 2

3‑ 6).

1‑ 1 /1‑ 2

上1

A C S l

トマ トでは

8

ACS

2

( L EI A C S 2

L E‑ A C S 4 )

( O eti ke reta1 .1 9 97 ).

A C S

A C S 2

A C S 3

の

c D NA

( La y‑ Ye ea n dX ni gt h o n1 9 9 6

Ros e nfi el d

etal .1 9 97 ). RN A

A C S l

A C S 3

A C S 2

ACS

A C S

AC S l

,A C S l

主要 な酵素 はであることを示 している.

トマ トでは

A C S

A C O( A C C

R N A

( ° el l e reta l . 1 9 91 ).

1 9 9 9 ).

3‑ 3

A C S l‑ 2

ト1

A C S

遺伝子型 を分類 した とき (表

1 )

1‑ 1

,ト1 / 1‑ 2

へ テ ロ型 は

3

1‑ 2

A C S l

,A C S l

T ) N A

D N A

‑ ll‑

Ⅲ リ ン ゴ各 組 織 にお け る

ACS

Md‑ ACS5 A , Md‑ ACS5 B

エチ レンは植 物 の さまざまな成長 を調節す るホルモ ンで あ り, また,傷害 や オーキシ ンな どの処理 に よ り,その生成量が一過的 に増加 す る. さ らに果実 の 追熟 (ライブニ ング) を促進す る作用 は古 くよ り知 られてい る現象 で ある.エ チ レン生 成系 の律 速酵 素 は 1‑ア ミノシ ク ロ プ ロパ ン‑1‑カル ボ ン酸 合 成酵 素

( A C S )

3

A C S

( A C S

AC S 2

AC S 3 )

c D N A

1

A C S 4 )

I A A

A C S 3

が クライマ クテ リックの前後で比較 的構成的 に発現す るの に対 し

,A C S l

A C S l

AC S 3

の両

A C S

A C S

d e g e n e r a t ep ri m e r

A C S

( M d‑ A C S S A

M d‑ A C S 5 B )

材料及 び方法

1 .

リンゴ栽培 品種 ̀王林 'の培 養 シュー トを用 いた. シュー トは継代培 地

( M S

培 地,

3 %s u c r o s e

0 . 7m g /16‑ b e nz yl a mi n o p u ri n e

1 0 0m g/1i n o si t ol

0. 8

a g a rp H5 . 8 )

3

2ml

b u f f e r ( 5m MM ES

0. 5 5M

p H5 . 8 )

2 5℃

にて静置 させ た.

2

1 ml

( n l / g / h r )

2 .5 ' R A C E

前章 と同様 の方法で,エ リシター処理 した成業か ら

R N A

1〃g

T ot alR N A1 5〃1

7 0℃

1 0

2 0〃1

の逆転 写反応液

( 5 0m MT ri s‑ H Clp H8. 3

6m MM g C

4 0m MK C

1m MD T T

1/ JMr e v e r s ep ri m e r , 1m Md N T P , 5 0u ni t sM u L Vr e v e r s et r a ns c ri pt a s e;P E R KI N E L … E R )

4 2℃

1

c D N A

7 0℃

1 5

を停止 した. この合成 された

c D N A

6 0u ni t s /〃1

R N a s e H ( T a K a R a )

1〃

1

R N A‑ D N A

R N A

QI A G E N

P C R

p u ri fi c ati o nKi t

D N A

2 5/ ∠1

T d T

( 0. 1M

ジル酸 ナ トリウム,

0 . 1m MD T T

2m MM n C1

0 . 4m Md C T P

1 3u ni t sTe r mi n al D e o x y nu cl e oti d ylTr a ns f e r a s e;Ta K a R a )

3 7℃

1 5

‑6 5℃

1 0

させ

c D N A

5 '

C

5〃1

5 0〃1

P C R

反応 液

( 1 0m MTri s‑ H Clp H8 . 3

5 0m MX C

1 . 5m MM g C1

0 . 2m Md N T P

0 . 4 F LMOl i g o‑ d Gpri me r , 0 ･ 4

Mr e v e r s epri m e r , 2 ･ 5u ni t sA m pl iT a qG ol d T " ; P E R KI N E L M E R )

P C R

D N A

いて

P C R

3. T A

増 幅 した

p c R

p C RP u ri f i c ati o nKi t( QI A G E N )

T A

T A

p Bl u e s c ri ptⅡK S 十

Ec o RV

これ を

4 9〃1

( 1 0m MTri s‑ H Clp H8 ･ 3

5 0m MX C

1 ･ 5m MM g C1

1m M d T TP

2 . 5u ni t sA m pl iT a qG ol d

;P E R XI NE L M E R )

7 5℃

2

T

p c R

D N ALi g a ti o nXi tⅡ

( Ta Xa R a )

1 6o C

s o c

液体培 地

( 2%

0 . 5%

1 0m M Na C

2 . 5m MX C

1 0m MM g C1

1 0m MM g S

2 0m M

3 7

1

5 0/ ∠g/ ml )

X‑ G al

2 0 0F Lg/ ml )

I P T G

2 0 0F Lg/ m

L B

( 1 . 00 / .

トリプ トン,

0 . 5%

1 . 0% N a C

0. 8%

3 7℃

4.

D N A

目的の プラス ミ ドの入 った大腸菌 を

L B

5 0〃g/ ml

3 7℃

8 , 0 0 0r p m

5

T E G ( 2 5m MTri s‑ H Clp H8. 0

1 0m ME D T A

5 0m M

I T E G ( l on g / ml

した. アルカ リ

S D S

( 0 . 2NN a O H

1 0 / O S D S )

3M

bH 4. 5 )

1 0 , 0 0 0r p m1 0

ール を加 えて,

‑ 2 0℃

2 0

1 5

0 0 0r p m

1 0

D N A

T Eb uf f e r( 1 0m MTri s‑ H Clp H8 . 0

1m M ED T A)

R N a s e ( 0 . 1m g / ml )

3 7℃ 3 0

R N A

ェ ノー ル/ク ロロフォルム処理 して,上層 を回収 し,エ タノール沈殿 させ ,

D N A

を

T Eb uf f e r

5.

‑1 31

プ ラス ミ ド

D N A

Se qui Ther m

Mc ycl eSe que nci ng Ki t‑ LC ( f orLトCO R s e que nci ng) ( Epi c e nt erTec h nol ogi es )

シークエ ンス反応物 を

D NA s e que nc erM odel40 00 L ( LI‑ CO R)

Base I ma ge I RS oft war eVer si on 2. 1 0 ( LトCO R)

6.

RT‑ P CR

サザ ン解析 , ノーザ ン解析 及 び

RTI P CR

2

A C S 5

R N A

R TI P CR

,

A C S 5 A

p cR

PC R

R T‑ P CR

de ge ner at e

図

4‑ 3

A C S 5 ノ

de ge ner at eF 5' TTYC ARG AYTA Y CAYGG3' de ge ner at eR 5' ACN ARNCC RAARC TNG AC AT3' ACS5 F 5' AC A TCG A A TG C AAC CG CA ACC TTA3' A CS5 R 5' TC TA AG TG G C TCG A AC AAG AG G 3'

pri mer

7 9‑ 95

7 37‑ 71 8 5 92‑ 61 6 1 27 6‑ 1 255

結果

1.ACS

A C S l

A C S 3

ACS

R NA

4‑ 1 )

7 0

ケ月後 の離層形成が認め られた果柄 をそれぞれ,果実,成葉,梶 ,茎 ,幼葉 , 離層 として解析 を行 った.その結果,

A C S l

A C S 3

次 に,成業 をみ じん切 りに した もの を傷害処理 ,細胞壁分解酵 素溶液 (セル ラーゼオノズ カ

RS

R‑ 1 0

Y‑ 2 3

4‑ 2

6

4

2 05 nl / g/ hr

8 3 nl / g/ hr

RNA

A C S l

A C S 3

2 .A C S 5 A , A C S 5 B