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二価鉄誘導脂質過酸化反応 に関す る研究

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Academic year: 2022

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(1)二価鉄誘導脂質過酸化反応 に関す る研究 第. 二. 編. 二 価 鉄 誘 導 脂 質 過 酸 化 反 応 に お け る誘 導 期(lag)の 二価 鉄 の 消長 に よる解 析 岡 山 大 学 医 学 部 放 射 線 医 学 教 室(主 橋. 本. 啓. (昭 和56年12月9日. Key. 任:山. words:ミ. 本 道 夫 教 授). 二 受 稿). トコ ン ド リア 脂 質 脂 質 過 酸 化 反 応,鉄. 緒. 言. 材 料 及 び実 験 方法. 近 年 脂 質 過 酸 化 反 応 は 生 体 膜 の 機 能 と構 造 の 両 面 か ら,生. 材料. 体 内 に お け る種 々 の 重 要 な役 割 が. 動 物:市. 販 の オ リエ ン タ ル 固 型 飼 料(MF). 注 目 され て い る1)〜10).著 者 の 教 室 で は,放 射 線. を 用 い て 飼 育 した 呑 竜 系 ラ ッ ト8‑12週. 障 害 の 観 点 よ り組 織,オ. 用 し た.. トガ ネ ラ に お け る 脂 質. 過 酸 化 反 応 に 関 す る研 究 が 続 け ら れ9)〜12),特 に. 試 薬: Fe(II)は. ミ ト コ ン ド リア に お け る 二 価 鉄(Fe(II))誘 導 脂 質 過 酸 化 反 応 は,脂. ソ ー ダ(TBA)は(半 Fe(II)呈. 析 の 一 助 と して 究 明 さ れ て い る9)〜13).ミ トコ ン ド リア に お け るFe(II)誘. 導 脂 質 過 酸 化 反 応 は,. 鉄 濃 度 に 応 じて 誘 導 期(lag)が が,ミ. 導 期(lag)が. 度 が,三. は蒸 溜 脱 イ オ. 方法 肝 ミ トコ ン ド リア の 分 離:ラ. 応 溶 液 中 のFe(II)濃. 導 脂 質過 酸 化 反. ド リア はHogeboomの. 価 鉄(Fe(III)). 脂 質 の 抽 出:分. ッ ト肝 ミ トコ ン. 方 法 に 準 じて分 離 した13). 離 し た ミ トコ ン ド リア か ら. の 共 存 下 で も選 択 的 に 定 量 可 能 で あ る こ と を 明. Folchら. 告 か に し た16).そ こ で 第 二 編 で は そ の 事 実 を も. 出 後 蒸 発 乾 固 し た総 脂 質 試 料 に99.5%エ. と に し,ラ. ル を加 え,テ. ッ ト肝 ミ ト コ ン ド リア か ら抽 出 し た. 脂 質 を用 い て, Fe(II)誘 お け るFe(II)の つ い て,経. 導 脂質 過 酸化 反 応に. 経 時 的 消 長 とlagと. 時 的 実 験 を行 な い,そ. 光純薬. ン 水 を用 い た.. み られ る こ と が わ か っ. 一 編 でFe(II)誘. phe. ー タ イ ト試 薬,和. 工 業K.K.)そ の 他 の 試 薬 は 特 級,水. た. 著 者 は,第. 又,. 色 試 薬 と して はNitroso‑PSAP(2‑. nolhydrochloride,,ド. る 条 件 下 で は ミ トコ ン ド リア の そ れ と. 同 様 に,誘. オバ ル ビツー ル 酸. 井 化 学 薬 品K.K.製)を. nitroso‑5‑N‑propyl‑N‑sulfopropylamino. 存 在 す る13)〜15). トコ ン ド リア よ り抽 出 さ れ た 脂 質 に お い. て も,あ. 硫 酸 第 一 鉄 ア ン モ ニ ウ ム(片. 山 化 学 工 業K.K.)を 用 い た.チ. 質過 酸 化 反応 機構 の解. 令 を使. 解,冷. の関 係 に. の 方 法 に 準 じて 脂 質 を 抽 出 した17).抽. 凍 室 に 保 存 し実 験 に 供 した.. 脂 質 過 酸 化 反 応 の 測 定:脂. の 結果 を も と. ℃ でFe(II)濃. 度0.05mMを. 質 過 酸 化 反 応 は25 用 い て 誘 導 し た.. に脂 質過 酸化 反 応開 始 の メ カニ ズム につ いて考. 実 験 は 次 の 反 応 系 に つ い て 施 行 し た.即. 察 した の で 報 告 す る.. KT液(0.15MKCl, PH 359. タ ノー. フ ロ ンホ モゲ ナ イザ ー を用 い て溶. 7.4)で. 0.01M. Tris‑HCl緩. の 反 応 を 基 準 にK‑リ. ン 酸(PH. ちi) 衝 液, 7.4).

(2) 360. 橋. 2mM存. 在 下 で の 反 応,. 0.01M. Na‑K‑リ. の 反 応, 濃 度)存 (II)濃 v). 二. 7.4と6.0で. でFe(III)が0.1mM(最. 在 す る 条 件 で の 反 応, 度 を0.1mM(最. KT液. 啓. ii) KP液(0.15MKCl,. ン酸 緩 衝 液)でPH. iii) KT液. 本. 終. iv) KT液. 終 濃 度)に. でFe. して の 反 応,. で脂 質過 酸 化 反応 の 経時 測 定 中 に. EDTA(0.5mM)を. 加 え た 条 件 下 で の 反 応,の. 5系 で あ る. 前 も っ て25℃ に 保 っ た 各 反 応 液39.8mlに (4mg/ml)0.1mlを ち, Fe(II)溶. 液0.1mlを. 加 え,総. て 反 応 測 定 を開 始 し た.経 採 取 し,氷. 量40mlと. 塩 化 酢 酸(T. 加 え 氷 中 に 保 存 し た.各. 品 採 取 後TBA反. 経時標. 応 分 析 で は 更 に5NHCl. TBA. 0.5mlず. 0.25. つ 加 え 混 合 し,沸 盪 水. 中 で15分 間 処 理 した 後,冷 清 に つ い て,島. し. 時 的 に そ の2.0mlを. 冷 反 応 停 止 液(40%三. CA)0.5ml)に. mlと2%. 脂質. 加 え て10分 間 温 置 し た の. 却,遠. 沈 し,そ. 津 分 光 光 度 計(UV200)を. 吸 光 度 を 測 定 し, TBA値. はOD532‑OD600で. 示 し た.. TBA値. Fe(II). consumption. 0.15M. in. KCl-0.01M. 7.4),. with. the. medium. Tris-HCl. (•£-•£). or. of. buffer. without. (pH (•¢-•¢). Pi. 度 の 測 定:. 測 定 と 同 一 反 応 系 で 同 時 操 作 を行 な い,. 経 時 的 に2.0mlを CA. 1.. 用い. て532nmと600nmの. 脂 質 過 酸 化 反 応 液 中 のFe(II)濃. Fig.. の上. 0.5ml)を. 採 取 し,反. 応 停 止 液(40%. 加 え 遠 心 し,そ. 第 一 報 の 方 法 に よ り測 定 し た16).即 troso‑PSAP. 0.5ml,. 1N. 0.6ml,水0.4mlを,こ. NaOH. 0.2Mリ. 4mlそ. し,そ れ をA液. 1mlを. と り,そ れ をA液. T. の 上 清 を 標 品 と し, ち1mM. Ni. ン 酸 緩 衝 液2.5ml, の順 に加 え. とす る.上. 記 の標 品 か ら. に 加 え 総 量5mlと. す ば や く混 和 し, 752nmでOD測. し,. 定 を行 な いFe‑. 値 と し た. 実 反 応 系i)で に, Fe(II)の. 験. 結. のFe(II)の. 果 減 少 の し方 を 図1. 減 少 とTBA値. の 関 係 を 図2に. 示 す.反 応 系ii), iii), iv)で のFe(II)の TBA値. の 関 係 を そ れ ぞ れ 図3,. 4,. 変化 と 5に 示 す.. Fig.. 2.. Effect and under The. 反 応 系v)で. のFe(II)の. 変 化 とEDTAを. え た 時 期 な ら び にTBA値 KT液. 中(基. 質 不 添 加)で. with. はFe(II)で. はFe. Fe(II)-value. 著 明 な 減 少 が み ら れ,. そ の 後 漸 減 し一 定 値 を 示 し た.一. 方 リ ン酸 の 存. •¢-•¢ vely.. consumption of. or. with carried. Tris-HCl without. and •›-•›. or. Fe(II) lipid. without. out. in. buffer. 2mM and. as •£-•£. of. mitochondrial. condition. KCl-0.01M. sed. on. incubations. 示 す.. 加. Pi. the. の 変 化 を 図6に. (II)の 減 少 が 認 め られ た.(図1)Fe(II)添 混 合 直 後 よ りFe(II)の. 加. of. peroxidation. Pi. (pH (PH. TBA-value. and •œ-•œ without. 7.4) 7.4).. are with Pi,. Pi.. 0.15M. Pi,. expres and. respecti.

(3) 二 価 鉄誘 導 脂質 過酸 化 反 応に 関す る研 究 在 下 で は, Fe(II)は. 非 添 加 の 場 合 よ り も急 激. な 減 少 を示 し,そ の 後 漸 減 し,一 脂 質 量10μg/mlを. 定 値 を示 した.. 用 いて の脂 質過 酸 化 反応 に. お い て(図2)Fe(II)減. 少 に 伴 うTBA値. 変 化 を み る と, KT液. 中 で は,混. 度 がOD0.04と15%に. TBA値. の 上 昇 は ほ とん どみ ら れ ず,そ. 低下 す るまでは. 分 後 か ら40分 後 に か け,急. の 後30. 激 な 上 昇 が み ら れ,. 40分 後 以 降 で は 一 定 値 を示 した.こ. れ に 対 し,. 示 す 如 く リ ン酸 の 存 在 下 で は, Fe(II). の 減 少 は 脂 質 存 在 下 で も 急 激 な 曲 線 と して 示 さ れ,こ. れ に 伴 っ てFe(II)濃. す る 混 合 後5分. 度 が 約15%に. ま で はTBA値. 7.4で は 混 合 直 後 よ りFe(II)の. 値 の 急 激 な 上 昇 が み ち れ, 10分 後 に ピー ク に 達. し,以. 後 わ ず か に 漸 減 し た.一. は, Fe(II)は の の,そ. み ら れ る ほ ど急 激 減 少 しその 後わ ず. か に 減 少 し一 定 値 を と っ た.こ. のFe(II)の. 少 に 伴 うTBA値. 合15分 後 ま で ほ. の 変 化 は,混. 減. 低下. と ん ど み られ ず, 15分 〜20分 後 に か け 急 激 な 上. は わずか な上 昇. 昇 が み られ, 20分 後 以 降 は わ ず か に 漸 増 す る も. 値 の 急 激 な上 昇,即. ちlagの. 値 はPHに. 短 縮 が 認 め ら れ,. 20分 後 の ピ ー ク は そ の 後 わ ず か に 漸 減 が み られ リン酸 の共 存下 い. 度 が 同 程 度(約15%)に. っ て か ら,急 激 なTBA値. で. 7.4に. の の,ほ. 独, Fe(II)と. 6.0系. で は な く, 15分 後 に 約10%に. 後 か ら20分 後 に か けTBA. ず れ で も, Fe(II)濃. 方PH. 混 合 直 後 よ り著 明 に 減 少 す る も. の 程 度 はPH. に と ど ま っ た が5分. た. Fe(II)単. 著 明 な減 少. が み られ, 5分 後 に は 約8%に 減 少 し,そ の 後 一 定値 を とっ た .こ れ に 対 し てTBA値 の 変化 は,混 合 直 後 よ りlagが ほ とん どみ ら れ ずTBA. 合30分 後 にFe. (II)濃. 図2に. の. PH. 361. な. ぼ 一 定 の 値 を示 し た.又,最. 高TBA. よ っ て 異 な る こ と が 認 め られ た.. Fe(III)存. 在 下,反. 応 系iii)のFe(II)脂. 過 酸 化 反 応 とFe(II)の. 質. 消 長(図4)で. (III)存在 条 件 で のFe(II)は. は, Fe. 混 合 直 後 よ り著 明. の 上 昇 が み ら れ,そ. の 立 ち上 が りは 同 程 度 で あ り,最 高TBA値. に. も有 意 差 は み ら れ な か っ た. 反 応 系ii)で. の0.01Mリ. ン酸 緩 衝 液 中 で の 脂. 質 過 酸 化 反 応 とFe(II)濃. 度 変 化(図3)で. は,. Fig.. 4.. Effect. of. (II). and. lipid. of. Fig.. 3.. Consumption mitochondrial. of. 0.15M. - value •£-•£ •¢-•¢. of. of. and •›-•›. and. Fe(II) lipid. and. the. KCl-10mM. Pi-buffer.. TBA-value. are. and •œ-•œ at. at pH. 6.0,. pH. conditions. 7. .4,. respectively.. and. (II). the. addition. M. KCl-0.01M. ssed of. Fe(II). expressed. (III). on. as •£-•£ Fe(III).. consumption. peroxidation. of. Measurement. Fe. Fe(II)-value. peroxidations. under. Fe. started. (0.05mM) of. Fe. (III). after in. buffer. (pH. TBA-value in of. Fe. addition. (0.1mM). and •œ-•œ TBA-value. by. immediately. Tris-HCl and. of. mitochondrial. 0.15 7.4).. are. expre. the. presence. control. is. o-o.. as. に 減 少 し5分. 後 に27%に,. 20分 後 に は8%に. 10分 後 に は12%に,. な り,以 下 わ ず か に 漸 減 し一.

(4) 362. 橋. 定 値 を と っ た. Fe(II)の の 変 化 は,混 れ,. 合5分. 本. 啓. 二. 減 少 に 伴 うTBA値. 後 か ら わ ず か な上 昇 が み ら. 10分 か ら15分 に か け 急 激 な 上 昇 が み ら れ た. が,対. 照 と して のFe(II)単. 独 系 で は,混. 合20. 分 後 ま で 変 化 が み られ ず, 20分 か ら30分 に か け 急 激 な 上 昇 が み ら れ, Fe(III)に 縮 が 明 ら か に 認 め られ た.最. よ るlagの. 高TBA値. 短. は,両. 者 と も同 じ で あ っ た. Fe(II)濃. 度(0.05mM)を. に し て,誘 5)で. 高 濃 度(0.1mM). 起 した 反 応(反. は, Fe(II)値. 応 糸iv)で. は,混. の 結 果(図. 合 直 後 か ら減 少 し,. Fig.. 6.. Effect. of. EDTA. xidation. of. mM). are. in. Fig.. is. expressed. added. by. •œ-•œ Fig.. 5.. Fe(II). (0.1mM)-induced. lipid. peroxidation. with. Fe(II). 0.15M. of. after. EDTA. incubation. time. Fe(II)-value. EDTA. first,. EDTA. pero. lipid.. of. and. control. second. (•›-•›),. accompanied. after down. and. and. third. are • -• , •¡-•¡,. addition. and. Tris-HCl. buffer. の上 昇 は み られ なか った.TBA. 値 が,誘 導期 の 終 わ りで わず か な上 昇 がみ られ,. (pH. 急 激 な上 昇 のみ られ る直 前 にEDTAを と, TBA値. 40分 で12%,. 50分 で5%に. 減 少 し た.こ. れ に対. し てTBA値. も混 合40分 後 ま で は ほ と ん ど 上 昇. の 急 激 な上昇 は全 くみ られ なか っ た.誘 導 反応 開 始後20分,す. なわ ち, TBA値. の急 激 な上昇. が 終 わ り漸 増期 へ移 行 す る時 にEDTAを. れ,そ. る と,そ れ 以後 のTBA値. の 後 一 定 の 値 を示 した.反. 応 系i)と. 対. 比 し て 明 らか に, Fe(II)濃. 度の 上昇 に と もな. うlagの. れ がFe(II)の. 延 長 が 認 め ら れ,そ. 消. 費 と関 連 が あ る こ とが 示 さ れ た. Fe(II)誘. み で は(反. 後 よ りFe(II)の. 線(図6)で. 応 系i)と. 伴 い15分 か ら20分 後 に か けTBA値. 混 合 後10分,す. な わ ちTBA値. られ な い 誘 導 期 中 にEDTAを. の変 化 はみ られなか. れ ら の こ とか ら,反. あ ろ う と, EDTAを. 応 が どのStageで. 加 え る とTBA値. は,そ. よ. こ とが 示 き れ た が, Fe(II)値. は,三. は,. もEDTAの. を 記 録 し た.. 同 じ),混 合 直. 著 明 な 減 少 が み ら れ,そ. 昇 と, 20分 以 後 のTBA値. っ た.こ. 加え. の. 時 の 値 の ま ま一 定 値 を と り,変 化 は み ら れ な い. 導 脂 質 過 酸 化 反 応 時 のEDTAに 応 系v)曲. 加 える. は ほ とん ど上 昇 が み られ ず,以 後. は み ら れ ず, 40分 か ら50分 で 著 明 な上 昇 が み ら. る 反 応 停 止 実 験(反. to. is •›-•›,. respectively.. 以 後 のTBA値 in. 7.4).. Fe(II)の. control. those. immediately of. (0.5 shown. mitochondrial. consumption (•¢-•¢),. KCl-0.01M. Fe(II)-induced. by •¢-•¢. TBA-value. that of. at. arrow.. additions zero. on. mitochondrial. 考 れに. の急 激 な上. の 漸 増 が み ら れ た. の 上 昇 の 全 くみ 加 え る と,そ. れ. 添 加 と 同 時 に0値 察. 脂 質 過 酸 化 反 応 の 生 成 物 は,マ ヒ ド(MDA)と. 実験 群 と. ロン ジア ルデ. き れ18)〜20),こ のMDAがTBA. と結 合 発 色 す る とい わ れ て お り21),最 近 脂 質 過 酸 化 物 の 定 量 と して のTBA反. 応 は,生. 成 され.

(5) 二 価鉄 誘 導 脂質 過酸 化 反応 に 関す る研 究. 363. たMDA量. と して の そ の 妥 当 性 が 再 考 慮 さ れ て. 物 の 挙 動 及 び そ の 中 間 生 成 物 か ら のMDAま. い る が,少. な く と もTBAと. の 分 解 の 二 段 階 の 反 応 形 式 を考 え な くて は な ら. 酸 化 脂 質 と し てTBA分. 反 応 す る物 質 を過. 析 法 は 常 用 さ れ て い る.. 脂 質 過 酸 化 反 応 の 機 構 は 脂 質 の 自動 酸 化 の 研. な い47).又,反. 応 途 中 でFeの. 剤 で あ るEDTAを. 強 力 な キ レー ト. 加 え る と,そ れ が 反 応 過 程 の. 究 に よ り論 議 さ れ 明 ら か に さ れ て 来 た18)〜20).脂. ど の 段 階 で あ っ て も,そ. 質 過 酸 化 反 応 は 各 種 の 基 質,反. 加 は み られ な か っ た こ とか ら, MDA形. 質,及. 応 を促 進 す る物. び 反 応 を 阻 害 す る物 質 即 ち 抗 酸 化 物 質 の. Fe(II)の. れ 以 後 のTBA値. 有 無 に つ い て,反 応 過 程 が 討 論 さ れ て い る9),22) 〜28) .更 に,生 体 膜 に お い て は, TBA発 色 を利. とが 示 唆 さ れ る.. 用 して, NAD. よ る 脂 質 過 酸 化 反 応 式(レ. PH依. 存29),30), super. 存31)〜34)等の 酵 素 的 反 応 や, ADP‑Fe誘 ス コル ビ ン酸 誘 導36), Fe(II)誘. oxide依 導35),ア. 導14),37)等の 非. の増 成に は. 変 化 の み で な くFe(III)が. Tappelら. で. 必要 な こ. に よ る と48)金 属 イ オ ン と 脂 肪 酸 に ド ッ ク ス 反 応)(1)(2). ROOH+M+n→RO・+OH‑+M+(n+1)‑(1) ROOH+M+(nH)ROO・+H++M+n‑(2). 酵 素 的 反 応 に よ る 脂 質 過 酸 化 反 応 が 知 られ て お. の う ち,ア. り.そ の 反 応 過 程 に つ い て 研 究 が 続 け られ て い. で は リ ノー ル 酸 や ア ラ キ ドン 酸 が 自動 酸 化 を お. て,い. ず れ の 反 応 で も,微. 量 で は あ る が,鉄. が. そ の 反 応 に 必 須 で あ る と さ れ て い る28),38)〜40). 本 実 験 で は,ミ. トコ ン ド リア のFe(II)誘. 導. ス コ ル ビ ン酸 誘 導 の 脂 質 過 酸 化 反 応. こ しペ ン タ ンに な る こ とか ら,そ の 際(2)式 が優 位 に 進 行 す る と報 告 し て い る.し. か し,レ. ドッ ク. ス反 応(1)又 は(2),又 は 両 者 の う ち ど れ が 優 先 的. 脂 質 過 酸 化 反 応 を例 に と り,単 純 化 の 目的 で ミ. に 起 こ る か は,金. ト コ ン ド リア か ら 抽 出 し た 脂 質 に お い て,脂. 周 囲 環 境 に 左 右 さ れ る とい わ れ て い る46).空 気. 質. 過 酸 化 反 応 の 検 討 を行 な っ た.. 中(O2存. 今 ま で ミ トコ ン ド リア のFe(II)誘. 属 触 媒 の 種 類 に 依 存 し,そ. 在 下)で は, Fe(II)が. の. 強 力な還 元 剤. 導 脂 質過. で あ る た め(1)の 反 応 が(2)の 反 応 よ り も は る か に. 酸化 反応 に つ いて の解 析 に関 す る研 究 は 多いが 9),12)〜15),20),37),42) ,そ の 反 応 機 構 に つ い て は 不 明. 優 先 す る と さ れ て い る46).い ず れ に せ よ こ れ ら. の 点 も 多 い.そ. 程 が 続 く は ず で あ る.. の 反 応 は 熱 処 理 し た ミ トコ ン ド. リア に お い て もみ られ る こ と か ら,主. として非. の 反 応 開 始 が 起 こ っ 後 は 一 連 の 自動 酸 化 反 応 過. 脂 質 の 自動 酸 化 で は,諸. 種 の説 が論 ぜ られ て. 酵 素 的 反 応 と考 え られ て い る13),14).も ち ろ ん,. い る21),46),49),50)が,一般 的 に そ の 反 応 は 次 の4. 膜 に お け るFe(II)誘. つ の 連 鎖 過 程 に 分 け ら れ て い る50).. 導脂 質過 酸 化 反応 は 酵素. 的 要 因 を考 慮 しな け れ ば な ら な い10).. 第 一 過 程:反. ミ ト コ ン ド リア の 脂 質 過 酸 化 反 応 に は,誘 時 間(lag)が. 認 め ら れlagの. 導. 有無 につ いて 多 く. の 報 告 が な され て い る43)〜45).油脂 の 自動 酸 化 に お い て もlagは. そ の 特 徴 と さ れ46), lagの. 延 長,. 短縮 は過 酸化 反 応 の活性 の 度 合 を あ らわ して い る もの と考 え ら れ9),そ. の 短 縮 は 反 応 の促 進 と. み る こ とが で き る.又,. lag内. に起 る変 化 が連. 応 の開 始. (基 質 脂 質RHよ 第 二 過 程:ヒ. ドロ ペ ル オ キ シ ドの 連 鎖 生 成. (過 酸 化 物 価 の 上 昇) 第 三 過 程:ヒ. ドロ ペ ル オ キ シ ドの 分 解. (過 酸 化 物 価 の 減 少 と カ ル ボ ニ ル 価 の 上 昇) 第 四 過 程:反. 応 の終 結. (二 量 体 の 生 成 に よ る 分 子 量 の 増 加). 鎖 反 応 の 重 要 な 因 子 を 握 っ て い る と考 え られ 10) , lagの 起 因 を究 明 す る こ と は,脂 質 過 酸 化. に 相 当 し, TBA値. 反 応 の 機 構 の 解 析 に つ な が る と考 え ら れ る.. 解 物 で あ る,カ. 本 実 験 で は,種 (II)減. して 観 察 さ れ, Fe(II)濃 か ら,. TBA値. 発 色 は み ら れ ずlagと. 化 中のFe,並. の. び に 中間生 成. は 第一 過 程. は脂 質 過 酸 化 反 応 に お け る 分 ル ボ ニ ル 即 ちMDAを. 測定 して. 三 過 程 に 相 当 して い る .. 量 の 減 少 はlag期. 度 が充 分 に減 少 して. の 急 激 な 上 昇 が み ら れ た.こ. こ とか ら, Fe(II)変. 本 実 験 を 中 心 に 考 え る と, lag期. い る た め,第. 々 の 条 件 下 い ず れ に で もFe. 少 中 に はTBAの. り遊 離 基 の 生 成). Fe(II). 間 中 に み ら れ る こ とか ら,少. な く と も 基 質 に(1)(2)の反 応 の い ず れ に せ よ 遊 離 基 の 生 成 が 継 続 進 行 し て い る と思 わ れ る がlag 中 は こ の 基 質 ラ ジ カ ル の 生 成 の み に,と. どまっ.

(6) 364. 橋. 本. ,抽. 二 lagとFe(II)濃. て い る こ とが 示 唆 され る. 一方. 啓. 出 脂 質 のFe(II)誘. 導脂 質 過酸 化 反. 度 の 関 係 は 更 に 詳 細 なFe(II). 濃 度 の 定 量 が 求 め ら れ, Fe(III)と. の量 的 関係. 応 を オ キ シ メー タ ー で 酸 素 の 消 費 を 測 定 す る と. を考 慮 す る14)と と も に 反 応 式 を含 め て 種 々 の 点. lag中 僅 か の 酸 素 消 費 が み ら れ た の ち, MDA形. よ り究 明 が 必 要 で あ る.. 成 の 際 に 急 激 な 酸 素 消 費 が み と め られ る.(未 発 表)ミ. トコ ン ド リア に お い て も 同 様,酸. 費 とMDAの. 結. 素の消 ラ ッ ト肝 ミ トコ ン ド リ ア よ り抽 出 し た 脂 質 で,. 形 成 が 時 間 的 に 一 致 し て い る15).. こ の こ とか ら,第 二 段 階 の 反 応 は,一 部 分 はlag. Fe(II)誘. に あ る と して も,大 部 分 は,第. っ て 測 定 し,同. 三段 階 の 反応 と. 導 脂 質 過 酸 化 反 応 を, TBA反. を定 量 し,そ. 同 時 に 進 行 して い る と考 え て よ い. こ れ ら の こ と を基 準 に 考 え れ ば,本. 実 験 の結. 論. 応によ. 時 に 反 応 溶 液 中 のFe(II)濃. 度. の 消 長 と 反 応 に お け るlagと. の関. 係 に つ い て 考 察 し た.. 果 は 主 と し て 第 一 過 程 と第 三 過 程 を表 して い る. 1)ミ. ト コ ン ドリ ア よ り抽 出 し た 脂 質 に お い て. が,加. も,ミ. ト コ ン ドリ ア と 同 様 にFe(II)誘. え ら れ たFe(II)がFe(III)に. 化 し き ら な い とTBA値 特 に 実 験2で はFe(II)の. ほ とん ど変. が 上 昇 し な い こ と か ら,. 示 さ れ た 如 く, Fe(II)高. 濃度で. 減 少 が ア ル カ リ溶 液(PH. お け るFe(II)の. 自 動 酸 化,も. 過 酸 化 反 応 で は,反 2)反. しくは 基 質 と して. 応 の 初 期 にlagが. 応 溶 液 中 のFe(II)濃. い とTBA発. 7.4)に. 色 は み ら れ ず,そ. れ ま で はlagが. 観 察 さ れ る.. 間 的に 遅 く. 3)リ. な る た めlagが. れ らの こ と. な り,又,リ. ン 酸 存 在 下 で のlagの. ら れ た が,い. ず れ の 場 合 も2)と. 延 長 さ れ て い る.こ. ジ カ ル 発 生 の 第 一 過 程 の 反 応 と次 の 過. み ら れ る.. 度が 微 量 に な らな. の 脂 質 との 反 応 に よ る と し て も,時. か ら,ラ. 導脂 質. ン 酸 に よ るlagの. 変 化 はPHに. よって 異 短縮 が 認め. 同 様 のFe(II). 濃 度 とlagの. 関 係 が 認 め ら れ た.. う何 ら か の 反 応 が 強 い ポ テ ン シ ャ ル を も っ て,. 4). 反 応 途 中 で 添 加 す る と, Fe(II). 第 二,第. は0値. 程 との 連 鎖 反 応 に お い て,. Fe(II)減 少 変 化 に 伴. 三 過 程 の 反 応(MDAの. 形 成)を. 阻止. 更 に リン 酸 存 在 下 のFe(II)誘. 在 下 の 急 激 なTBA値. を示 し,そ. れ 以 後 のTBA値. に は変動 が. み ら れ な い.. し て い る可 能 性 が あ る.. 反 応 で は, lagの. EDTAを. 導 脂 質過 酸 化. 短 縮 が み られ,又,リ. ン酸 存. 増 加 時 のFe(II)の. 量 に は 対 照 に 比 し て 有 意 差 が み ら れ ず,反. は 主 と し てFe(II)と. (III)と し て 反 応 開 始,な. して,一. 部 はFe. らび に一 連 の連 鎖反 応. 最終. に 関 与 し て い る と思 わ れ る が, Fe(II)の. 対の. MDAの. lagは リ ン酸 の 有 無 な か か わ らずFe(II)が 定 濃 度 に 低 下 す る ま で み ら れ た.リ. 5)鉄. 一. ン酸 に よ る. 存 在 は,. 形 成 に 阻 害 的 に 働 く こ とに よ りlagを. 維 持 し,又,. MDA形. 成 にFe(III)と. して 関 与. し て い る と思 わ れ る.. lagの 短 縮 は 高 濃 度 で 著 明 で あ っ た が, TBA値. 6)こ. は リ ン 酸 の 有 無 や 濃 度 に よ る影 響 は み ら れ な か. 誘導 脂 質過 酸 化 反 応の 初 期 の メ カニ ズムに討 論. っ た.こ. を加 え た.. れ ら の 結 果 は,ミ. トコン ドリアに お い. て の 報 告12),13)と一 致 して い る が,リ (II)の. 変 化 を促 進 す る 結 果lagの. も の と 考 え ら れ る.又,リ PHに. 謝. 辞. 短縮 を きたす. ン酸 存 在 下 の 反 応 は. よ っ て 影 響 を受 け た が い ず れ の 場 合 も,. Fe(II)の れ た.. ン酸 はFe. れ らの 実 験 結 果 を も とに し て, Fe(II). 減 少 とlagの 相 関 は 同 じ傾 向 が 認 め ら. 稿 を終 わ る に 当 り,御 懇切 な る御 指 導 御 校 閲 を頂 い た,山 本 道 夫 教 授,並. び に直 接 実 験 の 御 指 導 を頂. い た,山 本 剛禧 博 士,及. び放 射 線医 学 教 室 の 各 位 に. 深 甚 な る謝 意 を 表 し ます..

(7) 二 価 鉄誘 導 脂質 過酸 化 反応 に 関す る研 究 文 1.. Packer, L. and Smith, J. R.:. Extension. 献. of the lifespan of cultured normal human diploid cells by vi. tamin E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 71, 4763-4767, 2.. Barbar, A. A. and Bernheim, F.: Wills, E. D.:. Effect of unsaturated. 7,. 1961.. 7-16,. 1968.. Lipid peroxidation;. in animal tissues, Adv. Geront. Res. 2, 4.. 1974.. Harman, D.: Free radical theory of aging; Effect of free radical reaction inhibitors on the mortality rate of male LAF, mice, J. Gerontol. 23, 476-482,. 3.. 365. 355-403,. its measurement,. occurrence and significance. 1967.. fatty acids and their peroxides on enzymes, Biochem. Pharmacol.. 5. Packer, L., Deamer, D.W. and Meath, R. L.: Regulation and deterioration Adv. Geront. Res. 2,. 77-120,. 6. Cortes, R. and Privett, O.S.:. 8.. in membrane,. Toxicity of fatty ozonides and peroxides. Lipids. 7,. 7. Wills, E.D., and Wilkinson, A.E.: fractions.. of structure. 1967. 715-721,. 1972.. The effect of irradiation on lipid peroxide formation in subcellular. Radiat. Res. 31, 732-747,. 1967.. Horgan, V.J., Philpot, J. S., Porter, B. W. and Roddyn, D.S.:. Toxicity of autoxidized squaleus as and. linoleic acid, and of simpler peroxides, in relation to toxicity of radiation.. Biochem. J. 67, 551-558,. 1957. 9.. 渡 辺 節 生:ラ. ッ ト臓 器 の 脂 質 過 酸 化 反 応 に お よ ぼ す 放 射 線 照 射 の 影 響,岡. 山 医 学 会 雑 誌,. 85,. 129‑150,. 1973. 10.. 若林 誌,. 11.. 弘: 88,. 青野. X線. 全 身 照 射 の ラ ッ ト肝 ミ ト コ ン ド リア に お け る 脂 質 過 酸 化 反 応 に 関 す る 研 究,岡. 185‑196,. 要,山. 本 道 夫,飯. 田 荘 介,内. 海 耕 〓:放. 射 線 障 害 に お け る ス ー パ ー オ キ サ イ ド生 成 系(O2*‑)と. ー パ ー オ キ サ イ ド ・デ ィ ス ム タ ー ゼ(SOD)及 1297‑1308, 12.. 山医 学 会 雑. 1976.. び ビ タ ミ ンEの. 関 与 に 関 す る 考 察,岡. 本 道 夫,田. 辺 正 忠,青. 野. 要,山. 本 剛 禧:ラ. ッ ト腹 水 肝 癌 細 胞(AH. 130)並. び に その ミ ト. コ ン ド リ ア に お け る 二 価 鉄 お よ び ア ス コ ル ビ ン 酸 誘 導 脂 質 過 酸 化 反 応 に 及 ぼ す リ ン 酸 の 効 果,岡 88,. 90,. 1978.. 橋 本 郷 之 助,山. 雑 誌,. ス. 山 医 学 会 雑 誌,. 931‑939,. 山医 学 会. 1976.. 13. G. Yamamoto, M. Tanabe,. H. Wakabayashi,. ion induced lipid peroxidation Okayama. 28, 299-310,. G. Hashimoto,. of rat liver mitochondria,. and M. Yamamoto:. I. Effect of inorganic phosphate, Acta Med.. 1974.. 14. F. Edmund Hunter, Jr., J. M. Gebicki, P. E. Hoffsten, J. Weinstein, and A. Scott: of rat liver mitochondria. Studies on ferrous. induced by ferrous ions. J. Biol. chem. 238, 828-835,. 15. K. Utsumi, G. Yamamoto, and K. Inada:. Swelling and lysis 1963.. Failure of Fe2+-induced lipid peroxidation. and swelling in. the mitochondria isolated from ascites tumor cells. Biochim, Biophys. Acta. 105, 368-371,. 1965.. 16. 橋 本 啓 二:二 価 鉄 誘 導 脂 質 過 酸 化 反 応 に 関す る研 究 。 第一 編,二 価 鉄 誘 導 脂 質過 酸 化 反応 液 中 の二 価 鉄 の 定 量,岡 山 医学 会 雑 誌,投 稿 中.. 17. Folch, J., Lees, M. and Stanley, G.H. S.:. A simple method for the isolation and purification of total. lipids from animal tissue. J. Biol. Chem. 226, 497-509, 18. Dahle, L.K., Hill, E.G., and Holman, R. T.: of polyunsaturated. fatty. 1957.. The thiobarbituric. acid reaction and the autoxidations. acid methyl esters. Arch. Biochem. Biophys. 98, 253-261,. 19. Saslaw, L. D., and Waravdeker,. V. S.,:. Behavior of unsaturated. test often radiolysis. Radiat. Res. 24, 375-389,. 1965.. 1962.. fatty acid in the thiobarbituric. acid.

(8) 366. 橋. 20. E. D. Wills:. 啓. 二. The effect of inorganic iron on the determination. Acta. 84, 475-477, 21.. 本. 小 沢 高 将,浅. 井 淳 平,内. 22. Recknagel, R. O.:. of lipid peroxides.. Biochim, Biophys.. 1964. 海 耕 〓:ミ. ト コ ン ド リ ア(南 江 堂),. Carbon tetrachloride. 23. DiLuzio, N. R. and Hartman, A.D.:. hepatotoxicity.. Role of lipid peroxidation. duced fatty liver, Fed. Proc. 26, 1436-1442, 24. Thiele, E. H. and Huff J. W.:. 1971.. Pharmacol. Rev. 19, 145-208, in the pathogenesis. 1967.. of the ethanol-in. 1967.. Lipid peroxide production and inhbition by tumor mitochondria,. Biochem, Biophys. 88, 208-211,. Arch.. 1960.. 25. Utsumi, K., Yamamoto, G., Yamamoto, peroxidation and swelling of mitochondria. M. and Tanabe, M.:. Effect of x-ray irradiation. on the lipid. induced by ferrous ions. Nippon Acta Radiol. 26, 345-350,. 1966. 26. Patton, S: Malonaldehyde,. Lipid oxidation, and the thiobarbituric. acid test. J. Am. Oil chem. Soc. 51,. 114, 1974. 27.. 西 風 桂 子:腹. 水 癌 細 胞 の エ ネ ル ギ ー 代 謝 に 関 す る 研 究,岡. 28. Wills, E. D.:. 山 医 学 会 雑 誌,. 78,. 633‑654,. 1966.. Mechanism of lipid peroxide formation in tissues role of metals and haematine proteins. in the catalysis of the oxidation of unsaturated. fatty acids. Biochim. Biophys. Acta.. 98,. 238-251,. 1965. 29. May, M. E. and Mc Cay P. B.:. Reduced triphosphopyridine. nucleotide oxidase-catalyzed. of membrane phospholipids. J. Biol. Chem. 243, 2288-2305, 30. Pfeifer, P. M. and Mc Cay P. B.::. alterations. 1968.. Reduced triphosphopyridine. nucleotide oxidase-catalyzed. altera. tions of membrane phospholipids. VI. Structural changes in mitochondria J. Biol. chem. 247, 6763-6769,. associated with inactivation. of electron transport. 1972.. 31. Zimmermann, R., Flohe, L., Wester, U, and Hartmann, H. J.:. Inhibition of lipid peroxidation. lated inner membrane of rat liver mitochondria by superoxide dismutase, Soc.) Lett. 29, 117-120,. in iso. FEBS, (Fed. Eur. Biochem.. 1973.. 32. R. M. Kaschnitz and Y. Hatefi: 292-304,. activity.. Lipid oxidation in biological membranes.. Arch. Biochem. Biophys. 171,. 1975.. 33. E.W. Kellogg, III and I. Fridovich:. Superoxide, hydrogen peroxide, and singlet oxygen in lipid pero. xidation by a xanthine oxidase system. J. Biol. chem. 250, 8812-8817, 34. Tyler, D.D.:. Role of surperoxide radicals in the lipid peroxidation. (Fed. Eur. Biochem. Soc.) Lett. 51, 180-183,. 1975.. of intracellular. membranes,. FEBS. 1975.. 35. Kuo-Lan Fang, Paul B. Mc Cay and J. Lee Poyer:. Evidence that peroxidation. of lysosomal memb. ranes is initiated by hydroxyl free radicals produced during flavin enzyme activity. J. Biol. chem. 248, 7792-7797,. 1973.. 36. F. E. Hunter, Jr., A. Scott, P. E. Hoffsten, F. Guerra, J. Weinstein, A. Schneider, L. Ford, and E. Smith: liver mitochondria.. Studies on the mechanism of ascorbate-induced. J. Biol. Chem. 239, 604-613,. 38.. 山 本 剛 禧,田. mitochondrial. membrane ghosts produced by. induced by ferrous ion. J. Biol. Chem. 240, 3439-3446 , 1965.. 辺 正 忠,若. る リ ン 酸 の 関 与,生. swellig and lysis of isolated. 1964.. 37. R. C. Mc Knight, F. E. Hunter, Jr., and W. H. Oehlert: lipid peroxidation. B. Schutz, J. Fink,. 林. 化 学,. 弘,橋 44,. 526,. 39. Fortney, S. R. and Lynn, W. S. Jr.:. 本 郷 之 助,山. 本 道 夫:ラ. ッ ト肝 ミ ト コ ン ド リ ア 脂 質 過 酸 化 反 応 に お け. 1972.. Role of ascorbate and cysteine on swelling and lipid peroxidition in.

(9) 二価 鉄 誘導 脂 質過 酸化 反応 に関 す る研 究. 367. rat liver mitochondria,. Arch. Biochem. Biophys. 104, 241-247 , 1964. 40. M. Margaret King, Edward K. Lai, and Paul B. Mc Cay: Singlet oxygen production associated with enzyme-catalyzed 41. G. Yamamoto, peroxidation. lipid peroxidation in liver microsomes, J. Biol. Chem. 250, 6495-6502,. M. Tanabe,. G. Hashimoto. and M. Yamamoto,:. Biochem. Pharmacol. 21, 239-247,. 43. Recknagel, R. O., and Ghoshal, A.K.,: toxicity, Lab. Invest. 15, 132-146,. Lipoperoxidation. Peroxidation. E. Arch. Biochem. Biophys. 90, 105-110, 45. Tappel, A. L., and Zalkin, H.:. L. and. Stivala. 47. T. C. Pederson. and S. D. Aust:. ted by xanthine 48. Erich E. Dumelin polyunsaturated. 50.. oxidase.. The. Biochem.. hepato. of lipids in tissue homogenates as related to vitamin. 1960.. 崎. 生 化 学 実 験 講 座3脂. 啓,大. 沢 善 次 郎 共 訳,丸. role of superoxide. and singlet. Biophys. Res. Commun. Hydrocarbon. acid and Decomposition. 品 と過 酸 化 脂 質,最. as a vector in carbon tetrachloride. by vitamin E. Arch.. 1959. 動 酸 化(松. and Al. L. Tappel: fatty. 日本 生 化 学 会 編 金 田 尚 志:食. S.S.:自. by the. 1972.. Inhibition of lipide peroxidation in mitochondria. Biochem. Biophys. 80, 333-336,. 49.. 1976.. 1966.. 44. Bieri, J. G., and Anderson, H.A.:. Reich,. Acta Med. Okayama. 30, 291-301,. Effect of iron overload on lipid peroxide formation and oxidative demethylation. liver endoplasmic reticulum.. 46.. Studies on ferrous ion induced lipid. of rat liver mitochondria.. II. Relationship to incubation temperature. 42. E. D. Wills:. 1975.. gases. of preformed. 質 の 化 学(東. 新 医 学,. 33,. 52,. 善).. oxygen. 1071-1079,. produced. during. hydroperoxides,. 677‑681,. 京 化 学 同 人K. K.)1974. 1978.. 1972.. in lipid peroxidation. promo. 1973. in vitro peroxidation Lipid.. 12, 894-900,. of 1977..

(10) 368. 橋. Studies on ferrous. 本. ion-induced Part. Analysis. ion-induced Keizi. 二. lipid peroxidation. II. of the induction. ferrous. Department. 啓. period. of. lipid peroxidation. HASHIMOTO. of Radiation. Medicine, Okayama. Medical School, Okayama, (Director:. (lag). University. Japan. Prof. M. Yamamoto). The author measured simultaneously Fe(II)-induced peroxidation of lipid extracted from rat liver mitochondria by the TBA method and the concentration of Fe(II) added to the medium quantitatively using Nitoroso-PSAP reagent. 1) An induction period (lag) at the early phase of the reaction of Fe(II)-induced lipid peroxidation was observed as well as in mitochondria. 2) After most of the Fe(II) concentration had decreased, the TBA-value, after lag time, increased sharply. 3) Phosphate added to the medium shortened the lag-time. The lag-time in the presence of phosphate varied with the concentration and pH. However, in each case, there was a correlation between the decrement of Fe(II) concentration and the length of lag time as described above. 4) By adding EDTA for various reaction times, Fe was chelated immediately, then the TBA value did not increase. 5) The results suggest: iron interacted with the chain reaction of lipid peroxidation, mainly as Fe(II) and/or partially Fe(III); Fe(II) maintains the lag as a inhibitory action to the resolution into malondialdehyde (MDA) from lipid peroxide; Fe(III) was required for the formation of MDA. 6) Using these results, the author discussed the mechanisms of Fe(II)-induced lipid peroxidation..

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