代謝制御によるポリ−γ−グルタミン酸生産の最適化＊１

(1)

代謝制御によるポリ−γ−グルタミン酸生産の最適化

廣藤祐史

＊１

Optimization of the poly-gamma-glutamic acid production by metabolic pathway control

Yushi Hirofuji

液体培地におけるポリ−γ−グルタミン酸（PGA）の生産が非常に不安定である納豆菌を対象として，培養条件によって代謝を制御し，PGAの生産安定性を向上させることを試みた。養分の枯渇と再投与，温度変動などのストレスを与えることでPGAの収量が大幅に向上することを見出し，この現象はPGA分解酵素群の抑制によってもたらされていることが，γ−グルタミルトランスペプチダーゼ活性の変化から示唆された。

1 はじめに

ポリ-γ-グルタミン酸（以下PGAと略記する）は193 7年に Bacillus anthracis の菌体表面を覆う夾膜の構成成分として発見された。その後，PGAは納豆菌を

^{１）}

Bacillus Bacillus

含むある種の属細菌とその近縁種（

subtilis ， Bacillus licheniformis ， Bacillus mega など）によって生産されることが数多く報告さ terium

れてきた。これらのPGAの多くは数十万から200万程

^２）

度の分子量を有するのに対して，本研究が対象とした納豆菌はD− グルタミン酸と L−グルタミン酸からなる，分子量が300万を超える極めて巨大なPGAを生産する。

PGAは化粧品，医薬品，食品の他に，水質浄化剤，

，，

コンクリートのひび割れ防止剤砂漠緑化用保水材料結露防止剤など幅広い用途が提案されており，近年注目を集めている。これらの用途の多くにおいて，分

^２）

子量が大きいことは機能性の強化に繋がるうえに，納豆菌由来のPGAは食経験に裏打ちされた安全性の点で

，。，

も他菌種が生産するPGAよりも優れているしかし納豆菌を用いた液体大量培養によるPGA生産は，他菌種を用いたPGA生産と比較して極めて不安定であり，

実用的な生産方法が確立されていなかった。

PGAはPgsBCAと呼ばれる膜結合酵素系によって生産されており，PgsBCAをコードする遺伝子は pgsBCA である。 pgsBCA はComPフェロモンによるQuorum Sensingの制御下にあり，対数増殖期の終期から定常期の初期に発現することが報告されている。

^３）

pgsBCA の直下には D−グルタミン酸とL−グルタミン酸の結合を切断して分子量１０万から５０万に断片化するγ−ＰＧＡ分解

酵素YwtDをコードする遺伝子， ywtD が存在することが報告されており，PGAの生産安定性は様々なPGA分解

^４）

酵素群が生成することによって損なわれているものと ywtD 考えられる。これに対処することを目的として，

とγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）の生産に係わる遺伝子 ggt を破壊し，PGA高生産株を得る方法が特許として公開されている。また，YwtD以外の

^５）

分解酵素に着目し，PGAを分子量１０万に断片化する酵素ポリグルタミン酸ハイドラーゼ（PghA）の生産に係わる遺伝子 pghA と ggt を同様に破壊してPGA高生産株を得る方法も特許として公開されている。本研究は

^６）

納豆菌内部の代謝を制御する培養条件を見出すことによってPGA分解酵素群の発現を抑制し，遺伝子破壊等によらず，納豆菌を用いた高分子量PGAの安定生産手法を確立することを目的として検討を行った。

2 研究，実験方法 2-1 使用菌株

Bacillus subti 本研究が検討の対象とした納豆菌は

に分類され，PGAの生産に培地中のグルタミン酸と lis

ビオチンを要求することを特徴とする食用発酵細菌である。納豆製造業者の間では，納豆菌は遺伝的に不

^７）

安定であり，継代培養によって粘質物生産能を容易に喪失することが古くから知られている。このため，

^３）

一部の大手業者を除き，国内における納豆生産には種菌業者（成瀬発酵化学研究所，高橋祐蔵研究所，宮城野納豆菌製造所など）が供給する種菌が使用されている。本テーマでは，市販納豆から分離した保存菌株の胞子を使用し，10

⁶

cfu ml / となるように，PGA生産培地に接種した。

＊１生物食品研究所

(2)

2-2 培養装置

丸菱バイオエンジMDL300型（槽容積3 ）及びMSJ-U2 l -50L型（槽容積50 ）ファーメンターを用いた。 l 2-3 培地組成

PGA生産培地組成を表−１に示した。メイラード反応による培地の褐変を防止するため，A培地とB培地を別々に加圧蒸気滅菌（121℃，20分間）したものを無菌的に混和して生産培地とした。納豆菌によるPGAの生産は，炭素源を原料としてTCA回路のα−ケトグルタル酸から生成したグルタミン酸が使われ，培地中の

，グルタミン酸はPGAの生成に直接は関与しないものの

。 PGAの合成を大幅に促進することが報告されている

^８）

本研究が採用した培地組成も，同様の理由でPGAの生産原料であるグルコースとPGAの生産を促進するグルタミン酸を含む構成とした。

表−１培地1 当たりの組成 l

A培地（900ml）

g

グルタミン酸ナトリウム１水和物 20.0

g

リン酸２水素カリウム 2.5

g

リン酸水素２ナトリウム１２水和物 1.7

g

塩化ナトリウム 0.5

B培地（100ml）

g

グルコース 20.0

g

硫酸マグネシウム７水和物 0.5

mg

ビオチン 0.1

2-4 培地粘度の測定

培地中のPGA蓄積量の指標として培地の見掛け粘度を測定した。粘度はB型粘度計（東京計器，BL型）によって測定し，測定回転数は30 rpm に固定してNo.2ローターを使用した。No.2ローターの測定限界を超える粘度の培養液についてはNo.3ローターを用いた。

2-5 培養に伴う培地組成の時間変化の検討

MSJ-U2-50L型ファーメンターを用いて，培養温度37

℃におけるグルコースとグルタミン酸ナトリウムの濃度変化を検討した。グルコース濃度はグルコースCⅡ

−テストワコー，グルタミン酸濃度はヤマサL−グルタミン酸測定キットを用いて測定した。攪拌翼には２

，，

段６枚羽根ディスクタービンを採用し培養液量35 l 攪拌回転数110 rpm ，通気速度30 l/min の条件で80時間に渡って培養を行った（pH制御は行っていない。） 2-6 流加培養の検討

MSJ-U2-50L型ファーメンターを使用して，流加培養がPGA生産に与える影響を検討した。培養の進行に伴って消費されるグルコースを補給するために29時間経過時点で濃度2.0％相当量のグルコースを流加した。

攪拌翼には２段６枚羽根ディスクタービンを採用し，

培養液量35 ，培養温度は37℃，攪拌回転数120 l rpm ，通気速度30 / l min の条件で培養を行った（pH制御は行っていない。）

また，炭素源がPGA生産に与える影響を検討するため，同様の培養条件においてグルコースが完全に枯渇しpHが上昇した状態 65時間30分及び137時間で 2. （）， 0％相当のグルコースを流加した。

2-7 納豆菌の至適培養条件の検討

属細菌によるPGAの生産は37℃で行われる Bacillus

のが通例であるが，市販納豆の製造は40℃前後の高温で行われる。納豆菌の至適培養条件を定めることは培養効率を向上させるために重要であるため，納豆菌の至適生育温度を検討した。至適生育温度の検討はMDL3 00型ファーメンターによって行い，攪拌翼には２段６枚羽根ディスクタービンを使用して培養液量2 ，攪拌 l

，，，，

回転数120 rpm 通気速度2 / l min の培養条件で 35 40 45，50℃の培養温度において，培養開始からpHが低下を始めるまでの経過時間を調べた。

2-8 ストレスの組み合わせがPGA生産に与える影響納豆菌の至適培養条件を検討したところ，生育至適温度とPGA生産至適温度が相違していたことから，PGA の生産が開始される対数増殖期後期から定常期初期までは至適生育温度である45℃で培養し，その後培養温度を37℃に変更することによって，PGA分解酵素群の生成を抑制することを試みた。また，合わせてグルコース流加とpH制御を行い，PGA生産量と生産速度の改善を試みた。培養はMSJ-U2-50L型ファーメンターで行い，攪拌翼はフルゾーン翼を使用して培養液量35 ， l 攪拌速度80 rpm ，通気速度30 / l min の条件で行った。pH 制御はアルカリの流加のみで行い，1 N NaOH水溶液によりpH=6.9に制御した。

2-9 ストレスが分解酵素活性に与える影響の検討

炭素源の枯渇と再投与や温度変動などの外的ストレ

スが，実際にPGA分解酵素の活性に影響を与えている

かを確認するため，酵素活性を測定した。納豆菌が有

するPGA分解酵素としてはYwtD，PghAとGGTの３種が報

告されている。YwtDとPghAは膜結合型酵素であり，単

離・精製に成功した例がなく，測定が困難である。GG

Tは培地中に分泌される酵素であり測定が容易である

ため，培地中のGGT活性で分解酵素活性の変化を検討

した。GGT活性はγ−グルタミル−p−ニトロアニリド

基質法によって測定した。

^９）

(3)

3 結果と考察

3-1 培養に伴う培地組成の時間変化

図 − １に培養の進行に伴うグルコースの濃度変化を，図−２にグルタミン酸ナトリウムの濃度変化を示した。グルコース濃度は対数増殖期後期にあたる12時間経過時点から低下を始め，約70時間で全量が消費された。グルタミン酸ナトリウムは対数増殖期後期に急減するものの，以後消費されず一定の濃度を保った。

グルコースが枯渇するとグルタミン酸の消費が開始され，pHの上昇を伴いながら濃度が低下した。

図−１培養の進行に伴うグルコース濃度の変化

図−２培養の進行に伴うグルタミン酸濃度の変化これらの結果は， Bacillus subtilis IFO3555は炭素源の存在下ではグルタミン酸を消費しないが，グルタミン酸の存在がPGAの生産量を著しく増強するというKuniokaの報告と一致する。Kuniokaはまた，PGA

^{８）}

が培地中のグルタミン酸からではなく，炭素源から菌体内で合成されたグルタミン酸を原料として合成されることを報告しており，納豆菌についても同様の機序

。，でPGAの生産が行われていることが推察されるなお 80時間経過時点の培養液の見掛け粘度は80 mPa･s であった。

3-2 流加培養がPGAの生産に与える影響

グルコース濃度を維持することを目的として流加培養を行った場合の経過を図−３に示した。29時間経過した時点でグルコースを流加した場合，70時間経過後の見掛け粘度は60 mPa･s であった。

これに対して，一旦グルコースを枯渇させた後にグ

0 5 10 15 20 25

0 20 40 60 80 100

time[h]

Glucose[g/l]

0 5 10 15 20 25

0 20 40 60 80 100

time[h]

Na-Glutamate[g/l]

図−３グルコース流加培養の経過（その１）

ルコースを流加した場合の経過を図−４に示した。１回目の流加を行った時点で培養液粘度は10 mPa･s であったが，２回目の流加直前の粘度は215 mPa･s ，190時間経過後の粘度は1,810 mPa･s に達した。この結果は，

PGA蓄積を阻害していたPGA分解経路がグルコースの枯渇によってさらに強く発現し，グルコースの流加によって逆に強く抑制されたため，結果としてPGA合成経路が優勢となり，高濃度のPGA蓄積をもたらしたことを示唆するものと考えられる。

図−４グルコース流加培養の経過（その２）

3-3 納豆菌の至適培養条件

培養温度がpHの低下開始時間に与える影響を図−５に示した。

pHの低下開始時間は培養初期の菌体増殖速度を反

図−５納豆菌の至適生育温度

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

30 35 40 45 50 55 60

培養温度[℃]

pH低下開始時間[h]

流加

流加流加

DO

ORP Air

Temp

Agit

pH

DO

ORP

pH ^Agit

Temp

Air

(4)

映する。納豆菌の至適増殖温度は，今まで採用してきた37℃ではなく45℃であった。しかし，37℃と45℃で PGAの生産を試みた結果，45℃では菌体の増殖は良好であるものの，PGAが全く蓄積されなかった。

これらの結果は，45℃ではPGA分解酵素系の発現が増強されるため，PGAが蓄積されないことを示唆しており，３−２項の結果と合わせて考えれば，適切な段階で培養温度を45℃から37℃に切り替えることによってPGA分解酵素系の発現を抑制し，PGAの生産効率を高めることを期待できる。

3-4 ストレスの組み合わせがPGA生産に与える影響培養温度の切り替えとグルコースの流加を組み合わせて行った場合の培養経過を図−６に示した。

図−６複合ストレスがPGA生産に与える影響温度は溶存酸素濃度（DO）が飽和濃度の７割程度となる培養開始から７時間が経過したときに，45℃から 37℃に切り替えた。グルコースは枯渇に伴うpHの上昇を指標として37時間が経過したときに流加した。培養液粘度は27時間で610 mPa･s ，37時間で1,820 mPa･s と急速に増加し，グルコース流加後も順調に増加して44 時間で2,420 mPa･s ，50時間で3,200 mPa･s に達した。3 -3項で推察したとおり，温度の変動もグルコースの枯渇と再投与と同様にPGA生産の安定化に極めて有効であることが確認された。

3-5 ストレスがPGA分解酵素の活性に与える影響培養条件が培地中のGGT活性に与える影響を表−２から表−４に示した。表−２に明らかなように，グルコースを流加することによってGGT活性は有意に低下した。しかし，培養温度の変更はGGT活性を増強する効果を示した（表−３。培養温度の変更とグルコー）スの流加を合わせて行った場合もGGT活性は全体的に高い値を示したが，グルコースの流加はGGT活性を有

流加

DO

Agit ORP

Air

Temp

意に低下させた。YwtDとPghA活性を評価していないため，PGA分解酵素群の抑制の裏付けとしては不完全ではあるが，培養条件によってPGA分解酵素の生産が抑制されていることが示唆された。

表−２ GGT活性の変化

（37℃, 52:05:グルコース流加, 101:00 終了, 120

mPa･s

）時間[

h:m

] 7:30 11:15 24:00 52:00 56:30 59:30 72:30 1 01:00 >

表−３ GGT活性の変化

（45℃→37℃(７:00), 24:00 終了, 450

mPa･s

）時間[

h:m

] 7:30 11:15 24:00 GGT[

IU l

/ ] 0.0 0.4 11.9

表−４ GGT活性の変化

mPa･

(45℃→37℃(7:00),34:40:グルコース流加,53:00終了。1,200

s

)

時間[

h:m

] 6:50 8:30 11:30 34:30 38:00 41:30 5 >

4 まとめ

納豆菌によるPGA生産の安定性を向上させることを目的として，代謝を培養条件によって制御してPGA分解酵素群の生成を抑制する方法を検討した。PGAの原料となるグルコースをいったん枯渇させてから再度流加することにより，PGA分解酵素群の生成を抑制してP GAの収量を大幅に向上させられることが明らかとなった。また，培養温度を生育至適温度から生産至適温度へ変動させることによっても同様の効果が得られることが明らかとなった。両者を組み合わせることによって生産効率を大幅に改善することが可能であり，これらのストレスはPGA分解酵素群の発現を抑制していることがGGT活性の変化から示唆された。

5 参考文献

1)G.Ivanovics and V.Bruckner： Z.Immunitatsforsc h Exp. Ther., 90, pp.304-318 (1937)

2)F.B.Oppermann-Sanio and A.Steinbuchel： Naturw issen- schaften, 89, pp.11-22 (2002)

3)T.Nagai, L.-S.Phan Tran, Y.Inatsu and Y.Itoh：

J.Bacteriol., 182, pp.2387-2392 (2000) 4)T.Suzuki and Y.Tahara： J.Bacteriol., 185, pp.

2379-2382 (2003) 5)特開2003-235566号 6)特開2003-230384号

7)藤井久雄：日本農芸化学会誌, 36, pp.1000-1004 (1962)

8)M.Kunioka： Appl.Microbiol.and Biotechnol., 4 4, pp. 501- 506 (1995)

9)G.Szasz： Clin.Chem. 15, p.124 (1969)

pH

代謝制御によるポリ−γ−グルタミン酸生産の最適化＊１

代謝制御によるポリ−γ−グルタミン酸生産の最適化

廣藤祐史

Optimization of the poly-gamma-glutamic acid production by metabolic pathway control

Yushi Hirofuji

1 はじめに

ポリ-γ-グルタミン酸（以下PGAと略記する）は193 7年に Bacillus anthracis の菌体表面を覆う夾膜の構 成成分として発見された 。その後，PGAは納豆菌を

Bacillus Bacillus

含むある種の 属細菌とその近縁種（

subtilis ， Bacillus licheniformis ， Bacillus mega など）によって生産されることが数多く報告さ terium

れてきた 。これらのPGAの多くは数十万から200万程

度の分子量を有するのに対して，本研究が対象とした 納 豆 菌 はD− グル タ ミン 酸と L−グ ルタ ミ ン酸か ら な る，分子量が300万を超える極めて巨大なPGAを生産す る。

PGAは化粧品，医薬品，食品の他に，水質浄化剤，

， ，

コンクリートのひび割れ防止剤 砂漠緑化用保水材料 結露防止剤など幅広い用途が提案されており，近年注 目を集めている 。これらの用途の多くにおいて，分

子量が大きいことは機能性の強化に繋がるうえに，納 豆菌由来のPGAは食経験に裏打ちされた安全性の点で

， 。 ，

も 他菌種が生産するPGAよりも優れている しかし 納豆菌を用いた液体大量培養によるPGA生産は，他菌 種を用いたPGA生産と比較して極めて不安定であり，

実用的な生産方法が確立されていなかった。

pgsBCA の直下には D−グルタミン酸とL−グルタミン酸の結合を切断して 分子量１０万から５０万に断片化するγ−ＰＧＡ分解

酵素YwtDをコードする遺伝子， ywtD が存在することが 報告されており ，PGAの生産安定性は様々なPGA分解

酵素群が生成することによって損なわれているものと ywtD 考えられる。これに対処することを目的として，

とγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）の生 産に係わる遺伝子 ggt を破壊し，PGA高生産株を得る方 法が特許として公開されている 。また，YwtD以外の

分解酵素に着目し，PGAを分子量１０万に断片化する 酵素ポリグルタミン酸ハイドラーゼ（PghA）の生産に 係わる遺伝子 pghA と ggt を同様に破壊してPGA高生産株 を得る方法も特許として公開されている 。本研究は

納豆菌内部の代謝を制御する培養条件を見出すことに よってPGA分解酵素群の発現を抑制し，遺伝子破壊等 によらず，納豆菌を用いた高分子量PGAの安定生産手 法を確立することを目的として検討を行った。

2 研究，実験方法 2-1 使用菌株

Bacillus subti 本研究が検討の対象とした納豆菌は

に分類され，PGAの生産に培地中のグルタミン酸と lis

ビオチンを要求することを特徴とする食用発酵細菌で ある 。納豆製造業者の間では，納豆菌は遺伝的に不

安定であり，継代培養によって粘質物生産能を容易に 喪失することが古くから知られている 。このため，

cfu ml / となるように，PGA生産培地 に接種した。

2-2 培養装置

丸菱バイオエンジMDL300型（槽容積3 ）及びMSJ-U2 l -50L型（槽容積50 ）ファーメンターを用いた。 l 2-3 培地組成

， グルタミン酸はPGAの生成に直接は関与しないものの

。 PGAの合成を大幅に促進することが報告されている

本研究が採用した培地組成も，同様の理由でPGAの生 産原料であるグルコースとPGAの生産を促進するグル タミン酸を含む構成とした。

表−１ 培地1 当たりの組成 l

A培地（900ml）

グルタミン酸ナトリウム１水和物 20.0

g

リン酸２水素カリウム 2.5

リン酸水素２ナトリウム１２水和物 1.7

塩化ナトリウム 0.5

B培地（100ml）

グルコース 20.0

硫酸マグネシウム７水和物 0.5

ビオチン 0.1

2-4 培地粘度の測定

2-5 培養に伴う培地組成の時間変化の検討

MSJ-U2-50L型ファーメンターを用いて，培養温度37

℃におけるグルコースとグルタミン酸ナトリウムの濃 度変化を検討した。グルコース濃度はグルコースCⅡ

−テストワコー，グルタミン酸濃度はヤマサL−グル タミン酸測定キットを用いて測定した。攪拌翼には２

， ，

段６枚羽根ディスクタービンを採用し 培養液量35 l 攪拌回転数110 rpm ，通気速度30 l/min の条件で80時間 に渡って培養を行った（pH制御は行っていない 。 ） 2-6 流加培養の検討

MSJ-U2-50L型ファーメンターを使用して，流加培養 がPGA生産に与える影響を検討した。培養の進行に伴 って消費されるグルコースを補給するために29時間経 過時点で濃度2.0％相当量のグルコースを流加した。

攪拌翼には２段６枚羽根ディスクタービンを採用し，

培養液量35 ，培養温度は37℃，攪拌回転数120 l rpm ， 通気速度30 / l min の条件で培養を行った（pH制御は行 っていない 。 ）

また，炭素源がPGA生産に与える影響を検討するた め，同様の培養条件においてグルコースが完全に枯渇 しpHが上昇した状態 65時間30分及び137時間 で 2. （ ） ， 0％相当のグルコースを流加した。

2-7 納豆菌の至適培養条件の検討

属細菌によるPGAの生産は37℃で行われる Bacillus

， ， ， ，

回転数120 rpm 通気速度2 / l min の培養条件で 35 40 45，50℃の培養温度において，培養開始からpHが低下 を始めるまでの経過時間を調べた。

2-9 ストレスが分解酵素活性に与える影響の検討

炭素源の枯渇と再投与や温度変動などの外的ストレ

スが，実際にPGA分解酵素の活性に影響を与えている

かを確認するため，酵素活性を測定した。納豆菌が有

するPGA分解酵素としてはYwtD，PghAとGGTの３種が報

告されている。YwtDとPghAは膜結合型酵素であり，単

離・精製に成功した例がなく，測定が困難である。GG

Tは培地中に分泌される酵素であり測定が容易である

ため，培地中のGGT活性で分解酵素活性の変化を検討

した。GGT活性はγ−グルタミル−p−ニトロアニリド

基質法によって測定した 。

3 結果と考察

3-1 培養に伴う培地組成の時間変化

グルコースが枯渇するとグルタミン酸の消費が開始さ れ，pHの上昇を伴いながら濃度が低下した。

図−１ 培養の進行に伴うグルコース濃度の変化

が培地中のグルタミン酸からではなく，炭素源から菌 体内で合成されたグルタミン酸を原料として合成され ることを報告しており，納豆菌についても同様の機序

。 ， でPGAの生産が行われていることが推察される なお 80時間経過時点の培養液の見掛け粘度は80 mPa･s であ った。

3-2 流加培養がPGAの生産に与える影響

ポリ-γ-グルタミン酸（以下PGAと略記する）は193 7年に Bacillus anthracis の菌体表面を覆う夾膜の構成成分として発見された。その後，PGAは納豆菌を

含むある種の属細菌とその近縁種（

れてきた。これらのPGAの多くは数十万から200万程

度の分子量を有するのに対して，本研究が対象とした納豆菌はD− グルタミン酸と L−グルタミン酸からなる，分子量が300万を超える極めて巨大なPGAを生産する。

，，

コンクリートのひび割れ防止剤砂漠緑化用保水材料結露防止剤など幅広い用途が提案されており，近年注目を集めている。これらの用途の多くにおいて，分

子量が大きいことは機能性の強化に繋がるうえに，納豆菌由来のPGAは食経験に裏打ちされた安全性の点で

，。，

も他菌種が生産するPGAよりも優れているしかし納豆菌を用いた液体大量培養によるPGA生産は，他菌種を用いたPGA生産と比較して極めて不安定であり，

pgsBCA の直下には D−グルタミン酸とL−グルタミン酸の結合を切断して分子量１０万から５０万に断片化するγ−ＰＧＡ分解

酵素YwtDをコードする遺伝子， ywtD が存在することが報告されており，PGAの生産安定性は様々なPGA分解

とγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（GGT）の生産に係わる遺伝子 ggt を破壊し，PGA高生産株を得る方法が特許として公開されている。また，YwtD以外の

分解酵素に着目し，PGAを分子量１０万に断片化する酵素ポリグルタミン酸ハイドラーゼ（PghA）の生産に係わる遺伝子 pghA と ggt を同様に破壊してPGA高生産株を得る方法も特許として公開されている。本研究は

納豆菌内部の代謝を制御する培養条件を見出すことによってPGA分解酵素群の発現を抑制し，遺伝子破壊等によらず，納豆菌を用いた高分子量PGAの安定生産手法を確立することを目的として検討を行った。

ビオチンを要求することを特徴とする食用発酵細菌である。納豆製造業者の間では，納豆菌は遺伝的に不

安定であり，継代培養によって粘質物生産能を容易に喪失することが古くから知られている。このため，

cfu ml / となるように，PGA生産培地に接種した。

，グルタミン酸はPGAの生成に直接は関与しないものの

本研究が採用した培地組成も，同様の理由でPGAの生産原料であるグルコースとPGAの生産を促進するグルタミン酸を含む構成とした。

表−１培地1 当たりの組成 l

℃におけるグルコースとグルタミン酸ナトリウムの濃度変化を検討した。グルコース濃度はグルコースCⅡ

−テストワコー，グルタミン酸濃度はヤマサL−グルタミン酸測定キットを用いて測定した。攪拌翼には２

，，

段６枚羽根ディスクタービンを採用し培養液量35 l 攪拌回転数110 rpm ，通気速度30 l/min の条件で80時間に渡って培養を行った（pH制御は行っていない。） 2-6 流加培養の検討

MSJ-U2-50L型ファーメンターを使用して，流加培養がPGA生産に与える影響を検討した。培養の進行に伴って消費されるグルコースを補給するために29時間経過時点で濃度2.0％相当量のグルコースを流加した。

培養液量35 ，培養温度は37℃，攪拌回転数120 l rpm ，通気速度30 / l min の条件で培養を行った（pH制御は行っていない。）

また，炭素源がPGA生産に与える影響を検討するため，同様の培養条件においてグルコースが完全に枯渇しpHが上昇した状態 65時間30分及び137時間で 2. （）， 0％相当のグルコースを流加した。

，，，，

回転数120 rpm 通気速度2 / l min の培養条件で 35 40 45，50℃の培養温度において，培養開始からpHが低下を始めるまでの経過時間を調べた。

基質法によって測定した。

グルコースが枯渇するとグルタミン酸の消費が開始され，pHの上昇を伴いながら濃度が低下した。

図−１培養の進行に伴うグルコース濃度の変化

が培地中のグルタミン酸からではなく，炭素源から菌体内で合成されたグルタミン酸を原料として合成されることを報告しており，納豆菌についても同様の機序

。，でPGAの生産が行われていることが推察されるなお 80時間経過時点の培養液の見掛け粘度は80 mPa･s であった。

グルコース濃度を維持することを目的として流加培養を行った場合の経過を図−３に示した。29時間経過した時点でグルコースを流加した場合，70時間経過後の見掛け粘度は60 mPa･s であった。

図−３グルコース流加培養の経過（その１）

ルコースを流加した場合の経過を図−４に示した。１回目の流加を行った時点で培養液粘度は10 mPa･s であったが，２回目の流加直前の粘度は215 mPa･s ，190時間経過後の粘度は1,810 mPa･s に達した。この結果は，

図−４グルコース流加培養の経過（その２）

培養温度がpHの低下開始時間に与える影響を図−５に示した。

図−５納豆菌の至適生育温度

映する。納豆菌の至適増殖温度は，今まで採用してきた37℃ではなく45℃であった。しかし，37℃と45℃で PGAの生産を試みた結果，45℃では菌体の増殖は良好であるものの，PGAが全く蓄積されなかった。

3-4 ストレスの組み合わせがPGA生産に与える影響培養温度の切り替えとグルコースの流加を組み合わせて行った場合の培養経過を図−６に示した。

意に低下させた。YwtDとPghA活性を評価していないため，PGA分解酵素群の抑制の裏付けとしては不完全ではあるが，培養条件によってPGA分解酵素の生産が抑制されていることが示唆された。

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7)藤井久雄：日本農芸化学会誌, 36, pp.1000-1004 (1962)