九州大学学術情報リポジトリ Kyushu University Institutional Repository アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発 今給黎, 修 Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University https:

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発

今給黎, 修

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University

https://doi.org/10.11501/3075410

出版情報：Kyushu University, 1993, 博士（薬学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

」【ユ 4-(2ーフェナンスラオキサゾリル)フェニルイソチオシア不

第 ²章

ートによるアミノ酸のプレカラム蛍光誘導体化とHPLC

u ト斗

�

〈

...

。

仏国

...

:i

h

.a

-ア'

切Oω

E

ザ

O

U可

ω匂刊M円OMMV

ロ『ロバ

口付

巨ON、OOH

ρ

...

_ュ

O的ohH匂拘

7"

国 E

o

rl

U

ro

_U叶hHO

匂

・叶

HZU

(叶ミOOH)

UA仏 国

� 0

同三-HωK円ロOωロvd

... h 4内凶白

ω

... ω

o N

ω切口一明

〆

-43-

刊H けV

ロ ω U

同ミoom

hHMWU

ω同MJ判HOHZロO

A

U

ω

hH HVωリV

」[ ユ MW 同向 山

宮

O N (m.∞

国 仏)Hω

川明い判ロA

ω

キJ

ωOZ仏。的内

.... ロ EO」【、OOH

ρ

刊誌。〉\〉ロ叶)U

一一一7

内凶ia

，圏、

、.HH

ω

言

。叶句"ωa【叶

m.H

U

伺

Hn嗣O

l!'l

rl

ロCU内

Mリ#」判ロO判ω o

l!'l

(〉\〉

ロ叶EMWHhz

叶hHリV叶

ロ叶匂叶HK内向

、_，

l!'l

ロOリザω

u d

N.Hu 的ト.∞H00 ω

HVω

叶Muviω

ーω.門

rl

。

(ω同

、_，

-叶

足

o

rl

叶M川相叶ロOリVωUMW

dρ Cコ 。、

qJ判UM叫

0 口

ロ

υ

←4

仏 .a

〉

H

hH

内同O内向1

けV吋3ω同V

吋

m u

_{Oロ」門民泊}

吋リVMWN 叶 け干の

ω

'ô

_ω足

以MOU判ωHロ。ωUOH

仏

刷odo

同1N

-m 吋 ι同

p-POPICもm-POPICと同様にフェナンスラオキサゾールiこフェニル

m-POPICと同様に塩基性条件下でチオカルパモイル誘導体(p-POPTC-

p-POPICの最適誘導体化反応条

トニ

1000Cで10分間

氷冷して反応を止め，

水層20μ1をHPLCに付し トリエチルアミ

反応液に ン酸 塩緩衝液

トリル

バイ了 トイ さらに酸性条件下でチオヒダントイン 誘導体

②p-POPTHーアミノ酸生成反応:上記の水層100μ1を10M 塩酸50 μlに加え1000Cで20分間加熱する.

rnMアミノ酸溶液(g0児アセ

ルを約10回強く振り混ぜ遠心分離したのち，

第1章で検討したm-POPICのチオヒダン また

1. 5mM p-POP

¹

C (アセトニ

さらに四塩化炭素300μlを加える.

逆相HPLCにおける分離及び検出感度を検討した.

ージオキサン ，

1-1) .

トを導入して合成した(実験の部参照) .

v/v)50μlをパイアル管iことり，

トリノレーピリジンー (p-PO PTHーアミノ酸)に導かれると予想される(Ch

a r

^t

反応液iこ20

mM

①p-POPTCーアミノ酸生成反応:^O. 05

-42- ン誘導体化反応条件の検討と同様に，

v/v)50μ1，

氷冷して反応を止める.

2-1 )

トニ アセ (1)蛍光誘導体化反応(F^{i g.}

8.5)250μlを加え，

ン混液(90:8.75:1.25，

トリル水溶液)100μ1，

p-POPIC についても，

1 :

1.

アミノ酸)を形成し，

イソチオシア不一

基準操作

加熱する.

件を求め，

2

- 1

Hn ny ，，E‘、

アこ.

(2)

H P L C

NJ【司

門同副Y

自ロ巨刊Mω巨ロOJ判ω

ωロOHhH伺〉ロ叶

その20μ1 ;をHPLCに付し 4M水酸化ナトリウム水溶液50μlを加える.

Tこ.

。04y

NHdy

NH副YOH噌

(民国)

(〉\hr‘∞"H)( 国仏

gqi明

U 旬3 U叶けVωUMWZJ【.01

)ωMロHMM円刊 HHH 的.∞

dy川山内

民mw

Hh

足以ωJ明ロO川市ωUω1ωロ伺MnOJ明白」明hHH担

ZH.OEω

同刊hHHMωロJ判 (〉\hr‘∞

"・【)(

出白

巨 'ô ・吋

)ωMロUM円刊

U」明HVωU6 U 伺

EH.01 0.

凶HH」【

的泊門

民伺 Hh ぷHVω刊旬以

ZH.

01ω 叶J明hHリギJ司ロOHVωUMW1ω白川WMnO吋白ωロ刊 的AW門(〉\H

l判旬以

〉‘j【HH)ω吋ロOHMωU川町1ωロ訓WMOJ明白

∞@門

固いO刷OMOHnu

-45-

∞叫門ロmHH匂何回向ω旬以ωLFロ刷。

∞也門ωロωMnO刊白

(目白)

ωヨロ同

O刊以伺HV刊U巨J判例伺巨ロ

þ<

凶

HVロω〉J【Oω

ω日平ロω〉叶Oω

U HA凶On凶tA凶

ロoJ明けVMW川相J判UM凶 叫40

ωUロωUωωhHOロa【刷

，ロω ヰJ 体40

rø 刊刊日MロOω川町巨ω吋巴ω

。ロ rø HIN ωHaωLF

ドロフラン及び

蛍光励起及び発光極大波長

p-POPTH-アミノ酸のピークを前述のpHの異なる2種の溶離液で分離分

-44-

トニ トリ

p-POPICと p-POPTC-アミノ酸及び このpHの変化によって蛍光励起及び発光 ル溶液をpHの異なる2種の溶液(1-2-(1)を参照)で10倍希釈して蛍光

m-POPICの メタノール 試薬が可溶な溶媒に溶かしスペク

p-POPICの ジオキサ ンーアセ トニ この時得られた蛍光励起及び発光極大波長を

(2)p-POPTCーアミノ酸及び‘p-POPTH-アミノ酸の蛍光スペクトル

A

1

a，

またp-POPICのジオ牛サンーアセ

これから，

His及びAsn

(1

mM)を基準操作にしたが って，

トラヒ トニトリル，

この反応液を逆相HPLCに付し，

トルと比較して大きな違いはなかった.

ア

2-2A'こ示す.

1-2-(2)と同じ条件で行った.

トルと安定性

p-POPICもm-POPICと同様にジオキサン，

アセ

いずれの溶媒中でも，

水，

極大波長に大きな違いはなかった.

スペク

クロロホルムには可溶であるが，

及びベンゼンには難溶であ った.

トリル溶液のスペクトルをFi ^g.

トノレ

に大きな違いはなかった.

トルを測定 したが，

(l)p-POPICの蛍光スペク 蛍光スペク

2-1に示す.

トルを測定した.

Hyp，

反応させた.

スペク

2 - 2

Tab 1

e

omq

2-2に示す.

各分画の蛍光励起及び発光極大波長をTable 取した.

m-POPICの場合と同じようにp-POPTC-Ala 及びp-POPTH -Alaから得た蛍 検討し またpHによる違いも認 た他の3種のア

トルの形は類似し てい められなかった

m-POPICと比較すると， スペク

2 -2) .

(Table

m-POPICはm-POPTHーアミノ酸の方が励起波長が長波長域に ある たが，

p-POPICはp-POPTC-アミノ酸の方が励起波長が長波長域に のに対し，

p-POPTH

p-POPTCーアミノ酸は約3時間，

あるという違いが見られた.

ロ

守4

EH.otωロi明日ωHhzuωJ判MHV

MWHdt出向・仏O仏t仏(U)匂同MW

UHA凶O仏i白冨巨凶.H(4)

匂 吋Uω

・叶ロ

(田口)

UJ判判ωUω

、、，，，ρし nD

トルはいずれも良く似た形を示し(F^{i g.}

2-2

ミノ酸による違いもなかった.

同向け宇田口ω同ω〉ez

00守

光スペク

O山内00内

同百

� x

OUN

伺刊〈t出h・仏O仏1仏(υ)

またm-POPICの場合と問機にアミ ーアミノ酸は約1時間安定であった.

ノ酸との誘導体の励起波長が試薬の それ と違いがあるのでHPLC検出 p-POPIC及びその蛍光アミノ酸誘導体はHPLCにおいて n m及び発光波長4 00

図から明らかなようにm-

2 -3).

p-POPTH-アミノ酸を分離した(F^{i g.}

POPICの場合と同様に一部のアミノ酸で相互分離のできないものがあ

ω ω ロ M O ロ ω +J

& .�

IU 6

ZH.omロ刊ロJ判伺リV口OUω同叶旬以J判ロO川市ωUω

ωH41υ←ιOR凶l白(向)、(〉\〉‘同“同)ω」[叶MHVJ判ロO判ωU伺1ωロMWMO」明匂

MWHリザUω仏

ω

ωUロωumωMOロ同弘

匂40

。的司 (自己) ロO叶ωω.判巨ω

ミノ酸を分離したHPLC条件(1-3参照)に従い， 21種の nmで、蛍光検出した.

アミノ酸誘導体のHPLC分離

m-POPTH-ア に適している.

励起波長340

円。 っ“

.(凶.∞

出向 ) 切口ωロOa判ハギのけVJ明UMnω

同州判。ロω叶ω〉の3

(Ed)

ooq 。山内00門CUN 。的叩00内

� E

同�

E同

酬wH41ULF仏O仏1仏(国)

以下m-POPICの場合と同様に10種類と11種類のア したがっ て，

っTこ.

同向けV切口ω」【ω〉

伺3

ooq

同� 。山内

ミノ酸のグループに分けてそれらの混液を反応させ分離検出した 各アミノ酸についてそれぞれ単一のピーク これから，

(F

^{i g.}

F叫 N

・叶切 弘

UH仏O仏la(〈) OUN

p-POPICはp-POPTC-アミノ酸からp-POPTH-アミ

G 1

u，

保持時間 2分から6分の聞に残存す

A

sn，

早く溶出する数種(Asp，

-47- しか し ，

ノ酸への変換が円滑に進行せず，

るp-POPTC -アミノ酸が認められ，

が得られた.

{ヰτun五..IE.:I�τq.:IE) Á�τsua�uτ a::Jua::JsaJOnT..!l

-46-

p-POPTH-amino p-POPTC- and

of f1 uorescence the

of emission maxima and

2-2 Excitation Tab1 e

8.5 and 5.0 pHs with so1 utions

acids in

8.5) So1 ution

^b)

(pH

5.0) So1 ution

^・)

(pH

acid derivative Amino

(run)

Emダmax

(nm) Ex/max

(nm) Em/max

(run) Ex/max

395 344

395

p-POPTC-Ala

344

335 402 335 402

p-POPTH-Ala

lhH∞l

395 344

395

p-POPTC-Hyp

344

403

394 335

343 402

395 335

344

p-POPTH-Hyp

p-POPTC-His

p-POPTH-His

^{335 402 335}

403

344 395 344 395

p-POPTC-Asn

402

335

4

02 p-POPTH-Asn

335

F luorescence response

5.0

8.5

pH pH mixture

mixture acid

acid

司UFO-Mlω

の何回円O目印汁OG円印国

acetic acetic

国阿MFの

{】「印

CMh帥・市ψ

。。庁ゅの庁MO口、同M門

旬開同印ω命、HHロゆ印門凶門印。件。ロ汁(Olω。白いロ)

ωno汁Oロいけ円い]FO(品印1∞印刊)、伸。汁門印吋MM10門O凶川口門印ロ(印AW)‘

仲門仲ぬけUM1H印国ピMO10・】「沼ωno汁rυω口件。

∞・印)(HOAV)

。ωov

triethylamine triethylamine

0・HZ

E印汁 巾円(ιPOlO品開

)

円巾印の仲MOロ庁ロぴゆ)"HH〉ω旬、

ωHVM1mご品H20仲町

∞"のHM3mw日間吋酬と

門巾印泊巾ロ庁I

HH0・

∞ 1.0

トdw

、

、 ‘ 、 、 .... 、 、

_、

、、

、、

、、

、、

、 、、

N

」円 1 、

..1-、

圏 、 、 、

、

、、�

F・

、 、

ドd

__

⁰

\トd トd

、1

、、トdN

司・-H よ‘

司、-�

\ U可 トdo、

c、

w

。

40

刃巾片巾コけ戸Oコ

MO \ ヨ{コ 門戸ヨ巾

。

附匂l同MO同M4出l印固いFロO

noロ白い汁いOロω"のOHg田口、時的問凶OH

呂田い了。.、切な自)川内H02

ωhO同居間自hgo 自件同庁ロ門巾(句国

旬。円

句。ωwω(印

〉ω ロ

M M

切"出】「ω

0.1 0.1

印ロ。

ロ因 。 一戸

印口。N"のHZωロ。

の 】・ ロ U

nM可ωh

ω ロ

a m o

門町

小川崎町門川

「一← l

.þ. 吋

CJ'I ω

Acetonitrile (%�v/y) 印白い《凶凶

。ロmlHN04

円 ω 冒 汁 o (l) 司 、

い・ トー ト・4 昌 (l) t-'

、、

自

ト....

ロ

同M周回 .

、

O Hl

HHH〉]Fω"

MMN寸門酬と

]FmUFOC

吋川hp円凶勺

H凶HMM円。

+

ぴ】・印ロ

w u

H

ON-司凶吋

門川

】「品H〈仰いFh

岡山日間MW岡市川町

a) b)

lh∞l ωロ 白

<A/AIも)alτ1ヰτuo�a;)v

またp-POPTH-Proの Lys)のアミノ酸のピークと重なった.

Cys，

G

1

n，

(ω且ロuv

的寸」

ω ∞ L

ピークが試薬由来のプランクピークと重なった.

ロO刊HVUMWωH

誘導体化反応条件

2

-

4

Mω仏

ぷUMWω

(ロJ明巨)

o N

1 1 e)に

Lys，

Trp，

Met，

モデル化合物として5種のアミノ酸(G1 y，

ついて誘導体化反応条件を検討した.

(1)試薬濃度

J【O自民的)

ω匂

刊Uω

ω巨」明以

ロO刊以ロωμω出

o rl 811

le^、‘

a瓜i .(l�

mMのp-POPICを用いてp-POPTHーアミノ酸の生成ピークを調

0.5-1. 5

m-POPICの場合と同様に濃 この結果上記の濃度範囲において，

べた.

度を高くするにしたがってp-POPTlトアミノ酸の生成量が多くなった のp-POPICを用いることにした.

mM

よって1.5

(F i

g.

Oロ寸EMWE出hF仏O仏t仏

、、 ‘、 •

Cコ

a;)ua::JsaJonτa asuodsaJ

ピリジン及びトリエチルアミンの濃度

( 2)

ピリジンの2 種について反応 塩基性触媒としてトリエチルアミン，

トリル50μl中の1.25%トリエチルアミン アセトニ

条件を検討した.

及び8.75%ピリジンを用いたとき大部分のアミノ酸において，

この反応条 p-POPTCーアミノ酸の生成量が巌大であった(Fi g.

件はm-POPICのそれと同じだった.

(ロ刊巨)

o r、a

匂40

ω日ωMmouvω巨ohH戸内υ

dytN ne・1

)fuelq lua6e�u、 @叫d

+ 、

oJd、色 、

p-POPTC-アミノ酸生成反応の反応時間

、、.，J nぺυ ，，E‘、

-切刊h問

o rl ロO刊日帝国ωけが出ω

。 ω日刊一#

elY J�J.、...

、

、

dsy"--

ミノ酸のp-POPTC -アミノ酸生成反応における温度を p-POPICとア

各温度における反応時間( 2-30分 )の影響を調 m-POPICと同様に1000Cでは最大のピークを得るのに約10分間

-51-

、、

、

、、

、、

、

、

、

、

、

、

、

、

屯

s瓜1 ul�

、

、、

、

、

、

Jas� ー

"

^la刷F

、、 d.(H

nl9

1000Cと500Cに設定し，

べた.

-50-

sA�.usV

a;)ua;)saJOnT.!I

asuodsaJ

100

(HV.判ロロ

討しH伺旬以叶nhHC)

uvamJ判ω耳M{伺ω仏

Met 100

HVZm判ωぷ

如何MWMMJ判AH巾)

(リVJ判ロロM-ωω仏

。

amino tube) of

reaction 5

reaction per

4 (も，vjv)

triethylamine coupling

nmol each 7 (も，vjv)

1 2 3

Triethylamine

nぺur円U

9 8

Py工idine

and the p-POPIC(5 pyridine concentrations on

10

。

with of 2-6 Fig.

Effect acids 1.5

formation reaction 1.25

the per on

each

(rnM)

concentration acids (5

内FLHrhd

nmol 1_0

p-POP工C 0.75

c

I o p n o -­ p m p Pゐ O P T H -

p

hu e

f u o t

of

「 0_5

2-5

。

Fig.

Effect

500Cでは同じピーク高さを

2-7A)，

の反応時聞を必要 としたが(F^{i g.}

したがって基準 操作では反応温度と時閣をそれぞれ1000C及び 10分間に設定した.

(4 )抽出溶媒

p-POPICもrn-POPICと同様にp-POPTCーアミノ酸からp-POPTH-アミノ 副産物や試薬の分解物などの妨害物 クロロホルムではrn-POPICの場合と同様

rn-POPICの場合と異 1000Cにおいて20分

1

-5一(1 )の基 準操作にしたがってOPA-MCE試液を用いてp-

POPICとア

ミノ酸の反応収率を求めた.

2-7B).

得るのに長時間の反応が必要であった(F^{i g.}

10Mの 10Mと5Mの時の1000Cにおける反応時間を検討した.

L.

、，

Phe)も抽出される

rn-POPICの場合と同じように10Mの塩酸を用いる方がp-POPTH-アミノ

2

-

⁵

妨害物質を効率よく

未反応のアミノ酸を定量した結果を

r「U Ed

rn-POPICの場合と同様に四塩化炭素を使用することにした.

基準操作においては，

1000Cにおいて20分間の反応時間を設定した.

反応収率，

p-POPTH-アミノ酸生成における反応温度と塩酸濃度

1 1

e，

しかし，

なりp-POPTHーアミノ酸への変換に長時間を要し，

p-POPTCーアミノ酸をほぼ完全に残し，

塩酸を用い，

妨害物質 と共にp-POPTC-アミノ酸(Leu，

検量線及び検出限界 したがって，

酸の高い生成率が得られた(F^{i g.}

酸へ変換してHPLCに付す前に，

質を除去する必要があった.

間で最大の生成量を得た.

抽出することができた.

塩酸の濃度が，

の結果，

ので，

、、，，，rhu ，，‘‘、

lこ，

山明O口O叶判伺巨MOU明 (ωAロリV

ロO叶川VU巾ωM

ωhHD川干のMω向自ωリvq口の

HωazU伺ω

HOEロ的

)

ω足以ロOω巨刊HV

ロOJ判UVU伺ω-H

制OUMUωい閉山相同・0叶h凶 ωUJ判Uω10ロヨ同伺1uhLO仏t仏 o σ3

(ロ叶巨)

O '"

トlN

ωEJ判以ロO刊日VU伺ω出(口付巨)ロO叶HVUωω出

ω巨叶リV O

r

。

。σ3

。

。ひ4

O

r

。

ー噌ーー

OOF 。

=lq6τaq l{ead

=lq6下aq l{ead

-54-

(ヰτun瓦.re.:I=lτq.I'e) (ヰτun .li..J.E.:I=lτqJ.e)

� � ε4

UVωエ

OOF ドO的(回)ρOOH (〈)

Met M HCl

(B)

5

100

(川相 吋ロロ hH屑WM川相吋AM伺) 川相耳切判ωZ M{のω内出

M HCl (A) 10

100

川相nmJ明ωぷ

hMMWMHM」判AM伺)

M-cω仏 (川市」明白ロ

にy、

て3、

ら 1b 20 30

。 。

(min) time

6 1b 2b 3b

o s r d d

・l y c h a o n

4ム ) m

B

­

(C

T P

o p

p M 5 and

Reaction

(HCl) from acid hydrochloric

p-POPTH-amino M

10 (min)

(A) formation

in time time

reaction Reaction

of Fig. 2-8

Effect

acids of

tube) the

reaction on

per acid each

2-3 chloric

nmol

Table (5

the after reaction

七he in unreacted remained

that acids

aml.no of

Amounts

p-POPIC tube) wi七h

reaction per

nmol acids (5

aml.no of

reaction coupling

(nmol) Amount

acid Amino

Amount(nmol ) acid

Amino

0.21 0.21 0.15

。

。

。

。

。

Proa) Hyp・}

Leu Ile Val Phe Trp Tyr Gly

Ala

0.12 0.04 0.25 0.14 0.15

0.19

。

。

。

。

Cys川

Ser

His Arg Thr Gln Glu

Lys Met Asn Asp

C.M

�

with reaction

fluorescence reagent.

could

o-ph七halaldehyde-2-mercaptoethanol(OPA-MCE) the by detected be

acids not aUll.no

The the a)

nmolであり，

反応に用いたアミノ酸は反応液中S 2-3に示す.

Table

100

200

Fig.

Calibration graphs of amino acids detected as p-POPTH-amino acids

-59-

150

(pmol) injected

100

acid 50

Amino

2-9

。

(以吋ロロhM6HリザJ判AMMW)川相耳切J判ωZMωω仏

。

p-POPICとアミノ酸の

検量線

検出限界(S/N=3)はO. 2

m-POPICの場合より またrn-POPICに比べ，

POPICの方が m- POPICに比べ1. 5-3倍高いという利点があった.

-58 -

p-

それぞれ いずれの検量線も原点を通る直線を示した

しかし検出限界においては，

また基準操作に従ってアミノ酸をp-POPTH-アミノ酸とし，

。-POPICもm-POPICと同様にp-POPTH-アミノ酸へ導くと，

反応収率は少なくとも95-100%であることが分かった.

p-POPTH-アミノ酸への変換には長時間を要した.

2-4) .

のアミノ酸に対し単一の蛍光ピークを示したが，

nmolであるので，

各n=2プロ ッ pmo l/HPLCl注入量であった(Table

試薬由来のブランクピークも高い.

未反応のアミノ酸は0-0. 25

(相関係数r=O. 992 -0. 998，

を作成した(Fi g.

2 _- 6 小括

-2. 4

ンドリル)フェニルイソチオシアネート 4-(2ーシアノイソイ

第3章

によるアミノ酸及びジペプチドのプレカラム蛍光誘導体化 とHPLC

ペフ。

アセ

本章ではCIPICとアミノ酸及びジペプチドの蛍光誘導体化条件の

1

ト基に変換させたCIPIC を合成し

Leu-Ala ) (アセ アミノ酸との蛍 分子内にイソチオシアネート基を有

3に示すようにシ またシアン

ペプチド)生成反応 第一アミンと反応し強い蛍光性のシアノイソ

塩基触媒としてアセ

トリエチルアミン

1. 25

円4U

100

しているのでPITCと同様な反応機構になると考えられる(Chart

ドを導入し，

アミノ酸，

トリル溶液

8.

75

チドあるいはタンパク質と反応して鋭敏に蛍光を呈し，

化物イオ ンの存在下，

アミノ酸 溶液あるいはジペフチド(Ala-Gly，

トリエチルアミン混液(90 OPA はMCEのような還元剤の存在下で第一アミン，

トアニリ

CIPICもPOPICの場合と同様に，

そこで著者らはChart

トニ トリルー

①チオカルパモイル誘導体(CIPTC-アミノ酸 ・

v /vの溶液) 50μlに，

アセ アン 化カ リウム存在下 OPAにpーアミノ アセ

トニ v/v)50μl及び10mM CIPIC

1i nhu

チル化後フェニルイソチオシアネー

ペプチド 溶液にはアセ 検討とHPLCへの応用を検討 した.

光誘導体は単離していないが，

(1) 蛍光誘導体化反応(F^{i g.}

イ ンドールを生成する1 ^{5 )}

トリノレーピリジン ー

混液(9

た(実験の部参照).

基準操作

トリル-

71<.

v/v)50μ1 ，

: O. 1 rnM

円。

トニ トニ

• 、‘a，，44ム

∞.0 mhHd m.0 ω

H H

門.H

ω吋出 的.0d-.0

hHZhh

ロωJ

司.0門.0

制

ωω

ω戸山内凶

m.0

刊の〉

N.0 リMω冨

内.0OM仏内.Hω九円A 門.0hHhh-ωK円Ud-.N

@.0

内凶

M

h・

由.0

口 付。

ザ.0

ω Had 口 付。

-60-

ト.0

N.0

向L門 出

的.0ロω4 門.0九円J[O仏的〈的.0

(」[og仏)(叶O巨仏)

日制.明日付叶リV刊日J明付

OロJ明日4 旬刊UMW ロOJ判リVUωリザω口匂J判U川町OロづMJNロO刊以Uω判ωロ ω匂刊Uの

Oロ」明田伺1出LFn凶O

仏1a(門"2\ω)叩lN

ωHAmh・

ωUVJ判巨刊同ロOJ明日干Uωμωロ

斗40

。2白『同ωム 唱。ωausaoz〈弘一N白2020『白ヨ言。白色ag一5220

+

2

5

2ーの一却 の

。 。

^z

zoω 。同司同の hpBZ 。制酬の 芯

。国.

-

zーの-::0

。 。

吋町民。g与ω富。句向島ozs止さ(Q句史り・ω富山gRE)

党

問

。

1-T。

42岡山。seロ件。zpユモ急さ(の弓吋一回・母国防図。"

の向島)

Fig. 3-1

lmNl

preco1umn by

peptides and

acids anll.no

CIPIC of determination derivatization with

HPLC for

f1uorescence Procedure

も �c�Qnitri1e). 50μl (in 90

peptides or

acids Amino

v/v) or (90:8.75:1.25，

Acetonitri1e-pyridine-triethy1amine

l v/v) 50μ

l (90:10，

100 acetonitri1e) acetonitri1e-triethylamine

CIPIC (in

10 mM μ

m1n 80X; ， 5

l

HPLC 200μ

to l HaO

App1y 20μ 8.5) or

l (pH

\

200μ buffer tetrach10ride

Centrifuge Aqueous layer

Phosphate Carbon

Mix 25 mM

10ωl

50μ エ acid Hydroch1oric

HPLC M

to 2.5 1)

min

1 App1y 20μ

μ

5 (100

サ

80X; ，

(日ロ)

、ωω

匂刊以

内凶ω

白

M円

_ω自\

民凶

(凶.∞

氷冷して反応を止める. 次にア 5分間加熱する.

800Cで μ1を加え，

aody

∞ody

。。略

的04Y

同同副y mwO叩

HHdy OHdy

HH叩 ∞O叩

(自己)

国仏

)【

aロol判以ロ叶Oω

匂ロ伺

ペフチ ン酸塩緩衝液(pH 8.5) 200μlを、

ミノ酸の反応液には25mM

ω匂J判Uの

四塩化炭素200μlを加 ド の反応溶液には水200μlを加えたものに，

，ー‘、 ，国司、

的.∞0.ω 出向

田仏

、�、�

ωMロリザM門叶自叩」明udw ωMロけVM内付属匂l判UMW

(巨口) OHdy 。。叩 OH叩

^。。噌」【吋噌∞O噌

HH叩 OH叫Y HHdy

m

oψ

M内伺自\冒凶

(0.的

出

向) U叶判ωU

MW

U叶け干ωU

MW(Eロ)

� 叶・.0」【.0 m.∞切口MW0.mω出白ZUVJ判3Oロ叶巨伺lu←仏Hυ刷OωUロωUωωhHOロ叶刷ω足以

水層20μ1をHPLCに付した.

遠心分離し，

え激しく振り混ぜ，

ン誘導体(CIPTH-アミノ酸)生成反応:上記の水

②チオヒダントイ

ト@内。川WN

∞mN m@内

∞mN N由内

∞mN N@N

mmN ∞市山内

Mn伺巨\M門凶

800Cで5分間加熱する. 氷冷 反応液20μlをHPLCに付した.

HPLC

( 2)

粒径

i. d. .

m m

x

4.6

ODS-120Tカラム( 150

gel

逆相分配型のTSK

ド トニトリル， テトラヒ

溶離液にはア セ 東ソー)を使用した.

m μ phu

記

ト@N的。N

小山内∞@N

∞mN NmwN

mmN 内申N

mmN

h・由内"の巨\M内同

【-ロOJ判判ロHoω

酢酸混液(pH 8.5)及び水 ンー0.1M

トリエチルアミ

O.

1M

ロフラン，

ωロ吋民伺HhnuMω」明旬以ωロJ判官MWH加点以ωJ判旬以

H

.0 z

同 O .

ωHad-ロωA1ULFH仏HU

記

K円叶016H.4tULFH向HU

ωロO叶判ロHOωロ刊ω匂吋UMW刷O

Mω

巨叶

Mm居

口O叶ωω叶自ω OロJ明日岡山l出向・仏HU匂ロの

同M同園川口OJ判以MWけ苧叶UM門凶

」【l内ω叶nHMwh

(v /v)の (v /v)及び80

10

65 20 10

の容量比が，

トリル濃度を40 分 トニ

アセ で，

ml/min

流速は 1.0

2種類を用いた.

励 検出は，

操作は室温(22 +

トルと安定性 40C)で行った.

蛍光スペク

0. 0.

ω ω

< <

I ，

U 出8 8 仏 ø..

ト4 ト4

u u

ω叶出t同LF白HUω

叶出』uhn同HU 向何回t出LFn同HU 仏何回lυ←仏HU

MW

」門41出LF仏HU

剖WH41ULF仏HU

ω〉叶川VMW〉J判制ω旬

匂J判Uの

Leu-Ala(各1mM)を基準操 Hyp及び Ala-Gly，

Asp，

H i s，

A 1 a，

G

1

y，

CIPTC-アミ この反応液をHPLCに付し，

作に従いCIPICと反応させた.

OロJ判民〈

ノ酸 ・ ペプチド及びCIPTHーアミノ酸のピークをpHの異なる2種の溶離

，戸、，ー、

"' ..Q

内《UV

トル及びCIPTC-

r「u nhU

- 4やー←←

-E・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・圃E 可 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

層100μlに2.5Mの塩酸50μlを加えて，

して反応をとめ，

閣で20ト80児まで変化させる直線グラジエントで行った.

nmで行った.

260 nm及び発光波長410 起波長

3

-

²

各分画の蛍光励起及び発光極大波長をTable CIPTH-Ala の蛍光スペク

まTこCIPTC-Ala，

-64-

液で分離分取した.

1に示す.

他のアミノ酸及びペプ 3-2'こ示す.

トルをFig.

Ala-Glyの蛍光スペク

Ex Em

またpH変化 トルも互いに類似していた.

チドの誘導体の蛍光スペク

室温でCIPTCーアミノ ノ酸はそれぞれの反応液中で約 よってCIPIC及びその誘導体 はH PLC検出に適し

CIPICとのカップリング反

3 )が ，

' • 唱aA

それぞれのアミノ酸で遅

3' )は各アミノ酸に したがって基準操作では反応溶液中の妨害物質を取り除く たCI PTCーアミノ酸 はアンモニア及び試薬由来のブランクより早く溶

上記のアミノ酸に対しそれぞれ

CIPTH-アミノ酸に変換 CIPICとアミノ酸とのカップリング反応によって生成し

その 保持時聞が14-30分であるそのフランクピーク

20種のア ングリング反応後iこ四泊化炭素で抽出した(Fi g.

3-3A

トグラムをFi g.

3-3B 及び C).

CIPTH-アミノ酸の蛍光ピークの検出 を困難にした(Fi g.

副反応物 は酸変換反応後も分解しな いで反応液中に残り，

ミノ酸からそれぞれ 検出された.

-67-

応及びそれに続く酸変換反応後の反応液のクロマ

及び によるスペクトルの違いも認められなかった.

由来する副反応物であることが分かった(Fi g

. B)

_• をモデル化合物として，

及び 及び CIPTC-ペプチド及びCIPTH-アミ

アミノ酸誘導体のHPLC分離

早く検出されるピーク(peak CIPICとのカップリング反応では

3-3A 2本のピークを与えた(Fig.

く 検出されるピーク(peak ていることが分かった.

1時間安定であった.

3-3A).

カップリ

Leu A

1

a，

出した(Fi g.

に示す .

C).

3-3B).

ために，

G ly，

QU

Qυ

され ，

and

酸，

は，

nベU

500

Fig.

Fluorescence excitation and emission spectra of HPLC fractions of (A) CIPTC-Ala，

(B)

^CIPTH-Ala

(C) CIPTC-Ala-Gly.

-66-

500

500 400

Em

400 (nm)

400

Em

300

300

Wavelength

300

Ex

Ex

220

220

220

有100?1

ω ロ ( ω +J

� ^・刊 訂 正ゴ

..-i �

ω >s

o �

� rU

ω �

o � ω 守4 ω .Q

� � o rU

ロ )

叶 O

』

(A)

〉可

�100

切口 r、

ω �

� _・刊 訂 正3

・什 ロ

ω h

o �

� rU

ω �

o � (J) 叩4 ω .Q

� H o rU

ロ )

記 o

日(けて吋ロ3

hhHMmhHHV叶nMLH伺)

O

K向けが叶mGωHVG叶

ωυロωoωω

hHOロパ仏

3-2 (B)

and (C)

トグラムを示す.

3-4に20種のアミノ酸の最終反応液のクロマ

F i g.

20種全てのCIPTCーアミノ酸は酸変換反応によってそのアミノ酸に相 各アミノ酸 当する各単一ピークを示すC1 P TH-アミノ酸lこ導かれた.

の副反応物は 分解及び変換せずに保持時間5-15分に検出された. し Metと Proの蛍光ピーク(CIPTH-アミノ酸)がそ かしながらGl nとHi s，

九伺叶ロO巨民ω"“可 リVUロ匂仏hH仏1K門店"'J【

hHOU明

ω足以

斗40 切口刊点ω伺3Mω川炉心明MW ωHロuvu内」明巨

\0 v、

Cコc"1

山口ωJ

30 v/v，

トリル濃度(20-74完，

移動相中アセトニ れぞれ重なり，

ト溶離でそれらの誘導体を完全に分離するこ min)の直線グラジエン

Aspと Asn及びGluと 良好な点が観察された.

ジペプチド誘導体のHPLC分離

3

-

⁴

hHoh明日hHOUH

リザUロ句OMaIhA“-内

.(ωnHロ

HV

ロO刊HVUωωhH

N Cコ

(同)

r-f Cコ 切口ω

ωhHoh明

ωA

Cコ

ミヨI下

..

^{:q.下uo�a:J\[}

c>

れ』

l1\.j1\.)

�・T、

(亀

c"1

N r寸

ゃ、

u

しかしPOPICと比較すると ， Glnの蛍光ピークが分離でき るなど，

とはできなかった.

“ωuAωω仏 ロOJ判的Mω〉口OU

uコc"1

(〈)

ωMロ川VM内J門医

(に叶巨 山口ωA“門

Ala-Gly及び Leu-AlaもCIPICと反応しCIPTC-Ala-Gly及びCI PTC-

h・伺H4 カップリング反応

2).

及び

peak 1 3-5A，

Leu-Alaを生成した(F i g.

それぞれ のジペプチドに対し副 ではアミノ酸のと きと同じように，

酸変換反応 次に，

• 、‘，J ，

内，b

peak

l' 及び

3-5A，

反応物を与えた(F i g.

及びCIPTC-Leu- Alaの 反応時間とと もにCIPTC- Ala-Gly

を行なうと，

peak 3 C，

及び 3-5B N末端アミノ酸(F i g.

蛍光ピークは減少し ，

これらの誘導体 及びCIPTH-Leuが生成された.

4)のCIPTH-Ala 及び

これによりジペ プチドのN末端アミノ酸の決定が可能であることが分かった.

� d ω 切

<<s M ω ω 11 .、 ω�

� .c:=

rl � (.!) 0 .MロMWHnH hHoh明日VUロ句

OM仏'hnH"-

N

旬ω白山)ωけVJ判

ロOJ明日VUωωい

(U)

句40

回01 、 -M ω 叶 旬

。4 守4 ロ H o 0 () rl .ロU 伺H

� ω

� 斗40

ロO叶HVUのωH

〈コ f、ー

ωE 叶 』

o r寸

句ロ

ωCコ

o F、

c"1 1 1

1 1 1 、

1 1 1

1 1 1 1

1

1 1 1 1

1 1

\

N r寸

(同) ぷU伺ω

uコ c"1 c>

c"1 J【O百回

基準操作に従い各ペプチドで確認した.

の生成は，

"のHd"N ω例VJ明U伺Oロ吋ロ司 伺

ω

æ

^�

� 0 切』o �

� <<s

<<s 0 E 0

・ M 01.ロ

-M U 11c

足以J明言

門1門

1 1 1

1

、、 ‘、 、、 、、 ‘、

1 1

、1

、1 1 1

1 、

、、

、、 1 1

1 1 1 、

、

、

e、a F、

、1 1 、

1 、

、、

\ 、

，→

4

誘導体化反応条件

3

-

⁵

『ミ=

Leu)及びジペプ

Trp，

Val.

Arg，

A

1

a，

Gly，

7種のアミノ酸( G1 u，

asuoasa� aouaosa�onTd

nu.u Fhu

-68-

，戸、

^。ρ

hh〆\〉)

65

ωa【叶HけV叶ロouvω04

aF 4F ， aF dF aF JF 戸

2

1

4+5

�----__，�ζ

(

。ρ

hk〆\〉)

74

2

20

6

mi玄ture

2'=

for

冒ム

a n

--

- vu m

市ム e G

-

t

一

a N 唱ム

= A 3

Ala-Gly tube) m1n (A)

reaction

Leu-Ala;

of (B)

(C)

reaction 5 coupling

reaction mi玄ture

Leu.

4

reaction

Ala;

(C) for

(B)

and

Peaks: l=Ala-Gly; l'=by-product Leu-Ala: 2・=by-product for

4=N-terminal

41よ門，f

3

r e n

pi m

20

(min)

each 2 a 2

Ti_me

(A) nmol convers1on

10

of of

r

(5 times Fig.

Chro皿.atograms Leu-Ala its

ωωロO仏ωωHωυロ

3-5

ωυωωhH03叶ι阿

and and

ω同叶hHHV刊ロOけが

ω04

20

reaction.

reagent 18=Ile;

blank.

6=Ser;

13=

19=

nmol

.，. E Y

.，T

n

=

円羽 市4

q4

n G l

・- 一-

5 1

p

u o c

and

18

20

36

(5

convers1on

4=His;

7=Thr; 8=Arg;

14=Met; 15=Val; 16=Trp;

others=by-product

nuu 円，t

acids

11=Ala;

17=Phe:

〆...19

30

C I_PTH

-

^amino

tube)

9=Gly:

15

， 、，

司 lid --EEE・E・-aa-- aJ 唱ム，a'EE-­ 守，

Leu;

the gthe n

y

n s

H i

A

= w

=

nu

0 3 1

可ム 唱A

o

zι

7

8 11

9

12

1n

20

却

(min)

the 3

2=Glu;

Tìme

mixture reaction

of

2

10 1

s

却

r g o t a m 0

. r g h i

F

c

l=Asp;

20=Lys;

per reaction 3-4

Peaks:

each

。

Pro;

ωmGonhωωね

ωOロωoωωhH03叶』

Leu-Al a)をモデル化合物としてCIPICとの誘導体 化反 チド(Ala-Gly，

5 7 1 9 8 2 100

{UVJ明白ロ討しHωHUVJ判AMMW)

けvnhuJ明ω耳MMWω仏

応条件を検討した.

( 1)試薬濃度

アミノ酸に トニトリルに 約15 rnMまで可溶であった.

CIPICはアセ

ペプチド に対しては7. 5 rnMの濃度を用いたとき 対しては5 mMで，

また過剰j試薬による反応阻 害は観察されなかったのでCIPICの基準操作では10 rnMに設定した.

、‘，，， nJu r'E‘、

CIPICとアミノ酸の反応もPOPIC同様にトリエチルアミン及びピリ 基準操 。

それらの塩基が存在しないときは，

ジン存在下で進行した.

10

そこでトリエチルアミン及びピリジンの濃 生成は約1/20であった.

2.5 。 V/V) (毛，

5 pyridine 7.5

CIPTCーアミノ酸の蛍光ピークはアミノ酸の場 10

度について検討した.

the

6=

Fig. 3-6

Effect of triethylamine and pyridine

concentrations on the coupling reaction of amino acids and dipeptides (5 nmol each per reaction tube).

Curves: l=Gly; 2=Ala;

Glu; 7=Trp; 8=Ala-Gly;

8.

75

アセトニトリルー ピリジンートリエチルアミン(90

A 仁J

，

ジペプチド v/v)50μlを用いたときで最大であった. しかし，

1. 25

塩基触媒としてトリエチルアミンとピリジンの混液を用い の場合，

トリエチルアミンのみを用いたときの方がより高いピ たときより，

5=Leu;

3=Arg; 4= Val;

9=Leu-Ala.

そこでアセトニトリル50μl中トリエ ーク高さを得るこ とができた.

チルアミンの濃度を0-20先まで変化させカップリング条件を検討し

v /v)

アセトニトリルートリエチルアミン(90

10

50μlを用いたとき最も高い ピーク高さが得られた.

反応温度と反応時間

、‘，，，n《けV，，‘、、 円4U円ff

一ι-

CIPTC蛍光体の生成がほぼ最大に達した.

3- 6)

塩基濃度(F_{i g.}

7.5 (も， vjv)

2.5 5

Triethylamine

。

作で 反応した場合に比べCIPTCー アミノ酸 ・ ペプチドの蛍光ピークの

その結果，

た.

nJ白円，f

M 11

N ζコ

CHduN

ωZHVい明

lI"I

句ロω

M

hHOUH

。ω 匂J判UMW

ω

{GJ明記) 匂吋UC

。 ωω〉いロυ

OロJ何回MW

ロ刊百ω1ULF

ro ロωA"。

O∞μ

ω

ω￡ JhLF

Cコr-i

. M

ρ千

九hHω1ωHJH

(ωnHロリVG

吋EH

Hm a

ω

UV12切口伺

(〈)

u∞ O刊リギ

ω匂

刷OCO刊以ωghHO似 J明UMW

内同HU

u、

0\

カップリング反応及び酸変換反応において 50-1000Cの範囲で反応 温度が高いほど反応が早く進むことが分か 時間を検討したところ，

酸変換反応では2-3分間の各 カップリング反応では2-4分間，

っ7こ.

ほぼ最大のピーク高さが得 反応時間で反応温度を1000C'こしたとき，

また 500Cでは最大のピーク高さを得るのに60分以上の反応 られた.

800Cでは両反応とも。C5分間で最大のピーク高さ 時間を必要とした.

アミノ酸とジペ いずれも800C5分に設 よって基準操作では，

プチドのカップリング反応 及び酸変換反応は，

定した.

A及びB)

_•

を得た(F^{i g.}

3-7

Cコ

(同)

=lq6τaq l(l?aa o

(=lτun瓦.:Il?.:I=lτq.:IE)

OOH

( 4}酸変換反応

Cコr、a

CIPTC-アミノ酸 ・ ペプチドからCIPTH-アミノ酸への変換反応に用

九円凶い

UMWω

0 ロ .c: ω

酢酸及びトリフルオロ酢酸 過塩素酸，

いる酸として各2.5Mの塩酸，

� E-4 H ト11 ω 刊日伺t 以ロ

O

酢酸及びトリフルオロ酢酸では樋酸， 過塩素酸 について検討した.

山口ωAH凶 叶O民民的)ωω (国)HVロω

‘ωω

ωω巨吋μロO刊HVUωωhH

白 川口 .c: r・4

u ω ro 11 ω uコ

国LFh凶HU

“、 r-i

塩酸と過塩素酸ではほぼ同じ結果を得

ベースラインの乱れがより少ない塩酸の2. 5Mを反応に用いた.

に比べ変換に 時間を要した.

fこカf， _(ロ叶E)

Cコr-i 白ωE吋 ング反応における副反応物

(5 )

カップリ

九州伺

カップリング反応液中の水の量が副反応物の収率に影響している

〉"凶Y

。刊以匂叶川相

外40 +J

トー内

アミノ酸のカップリング反応溶液200

u、

3-8) .

ことが分かった(F^{i g.}

hm H

aω仏Jh

仏ω白J明

Uωん刑制.回

CI PTCーアミノ酸の生成 μl中の水の量を2.5-50%(v/ v)まで増やすと，

4 匂 匂 cil

.�

b‘

(dH)

副反応物は増加した(約十20 が減少していく(約2/3倍)のに反し，

Cコ

'l o

(ヰτun五.:Il?.:I=lτq.:IE)

roOOH

ペプチドでは上述の範囲でCIPTCーペプチドの生成は同様 倍) . 一方，

=lq6τaq l(l?aa

高IJ反応物も減少した(約2/3-1/2倍)

iこ 減少したが(約2/3-1/2倍) ，

また塩基触媒としてピリジンのみを用いると， 副反応

3 -9).

(F

i g.

。

。 25 50

Water (毛， v/v)

Fig. 3-8

Effect of amounts of water on the coupling

reaction mi玄ture of amino acids (5 nmol each per reaction tube) with CIPIC.

Curves: l=Gly; 1・=by-product for Gly; 2=Ala; 2'=

by-product for Ala; 3=Arg; 3・=by-product for Arg 4=Val; 4'=by-product for Val; 5=Leu; 5'=by­

product for Leu; 6=Glu; 6'=by-product for Glu;

7=Trp; 7'=by product for Trp.

-76-

。

。 25

Water (毛， v/v)

Fig. 3-9

50 1 2

l'

2'

Effect of amounts of water on the coupling

reaction mixture of dipeptides (5 nmol each per reaction tube) with CIPIC.

Curves: l=Leu-Ala; 1・=by-product for Leu-Ala; 2=

Ala-Gly; 2'=by-product for Ala-Gly.

-77-

その副反応物の構造については未確認であ 物は減少した(第4章) .

泊泊.0

トm.0。ザ.0

副可門.0

同門.0AW4y.0

山[email protected]

。門.0川w門.0

H門.0(Hog仏)

ロO刊以UωHVω白HV」明日刊同

検量線及び検出限界 反応収率，

る.

匂刊 U伺

ωH

H

ロωA

」【〉伺 ωぷ仏

ohH仏

HhLF

仏臼ιF

伺

」【4

向K門 出

hHO

Oロ吋EJH

m匂J明U

Mw od刊回ωt出札F仏HU刷。

3

-

⁶

CIPICとのカップリング反応によるアミノ酸及び2種のジペプチド

のCIPTC-Ala-Gly及びCIPTC-Leu-Ala(各5nmol反応液中)の生成 収率は POPICと同様にOPA-MCE試液を用いるプレカラム誘導体化法で測定し

その結果反応液中に未反応のアミノ酸及びペプチ た(1-5-(1)参照) .

アミノ酸及びペプチドはほぼ それゆえ，

ドは検出されなかった.

(門"Z\ω)

しかし反応 生成物がすべ 100 %CIPICと反応するものと考えられる.

それに てCIPTC-アミノ酸及びペプチド であるということではなく，

muv刊gJ明付

基準操作iこしたがって得ら は副反応物も含まれるものと思われる.

。門.0

副司何.0

∞門.0

dy門.0

同門.0。ト.0

小切.0∞dy.0

。門.0

同凶.0

(

HO

E白

)

以刊巨叶同

m H d

ω

J明

白

HZLF

hHωω

HMωZ

的、円A

dHO

ロHO

4 ω 仏 同ω4

ロO刊以Uω判ω口旬刊UωO口刊巨4

ロO刊HVUωuvωロ

少なくともO. 025- れるアミノ酸及び2種のジペプチドの検量線は，

nmol(HPLC注入量)までは原点を通る直線を示した(相関係数r=

2. 5

N1門

pmol/HPLC注入量であ 結果未掲載).

O. 7 O. 3 -

ト，

アミノ酸の検出限界(S/N=3)は，

3

-

⁷

各n=2プロ ッ

0.994-0.999

小括 っTこ(Tab 1 e.

ωHA

ωLF

ドマン試薬であるP1 TCと同様な反応条件 新規に合成したCIPICはエ

それらの蛍光誘導体化に適していた . アミノ酸と反応し，

下で，

-79-

uv検出HPLCでのPITC試薬を用いたときょ

m-POPICより高くp-POPICとは同等であった.

円ハv円，z

HPLCでの蛍光検出感度は，

少なくとも2桁高く，

り，

またCIPICのアミノ酸及びペプチドとの反応性は極めて高く， CIPIC を用いたこの反応条件によって， ジペプチドのN末端アミノ酸 の決定が可能であった. よって蛍光エドマン分解への応用が期待で きる.

-8 0^-

第4章 4-(2ーシアノ イソ インドリル)フェニルイソチオシ アネート を用いたトリペプチドの蛍光エドマン分解

エドマン分解を行うに あ たって， 試薬がペプチドあるいはタンパ ク質と完全に カップリンクーすること がまず重要な条件となる. しか し， これまで報告されている大部分のエドマン類似試薬はペプチド とのカップリング反応における収率が十分ではない. また合水条件

下では， 通常エドマン分解時にペプチドの解裂を引き起こすので ， 無水有機溶媒中でチ アゾリノン誘導体を形成させエドマン分解させ ている. この場合煩雑な脱水操作を必要 とする.

CIPICは第3章で述べたようにペプチドとほぼ完全に 反応するので，

カップリング反応においてPITCによるダブルカップリング法を 必要 としないこと が予期される. また第3章でCIPICとペプチドとの反応 条件を検討した際， 塩基触媒と して ピリジンを用いるとトリ エチル アミンを用いたときに比較して， C 1 PTC-ペプチドの生成量は少ない が副反応物が 極端に減少するという知見が得られた .

そこで本章では， カップリン グ反応においてピリジンを塩基触媒 として用いた反応条件につ いて検討し， またエドマン分解における 操作を従来の方法より簡便にする目的で ， 含水条件下にN末端アミ ノ酸を切断すると同時にCIPTH-アミノ酸に変換するという新しいエ ドマン分解操作について検討した(Chart 4-1).

4 - 1 基準操作

( 1

)エドマン分解操作(Fig. 4-1)

-81-