九州大学学術情報リポジトリ Kyushu University Institutional Repository アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発 今給黎, 修 Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University https:

九州大学学術情報リポジトリ

Kyushu University Institutional Repository

アミノ酸のエドマン型蛍光試薬の開発

今給黎, 修

Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyushu University

https://doi.org/10.11501/3075410

出版情報：Kyushu University, 1993, 博士（薬学）, 課程博士 バージョン：

権利関係：

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第 ²章

ートによるアミノ酸のプレカラム蛍光誘導体化とHPLC

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p-POPICもm-POPICと同様にフェナンスラオキサゾールiこフェニル

m-POPICと同様に塩基性条件下でチオカルパモイル誘導体(p-POPTC-

p-POPICの最適誘導体化反応条

トニ

1000Cで10分間

氷冷して反応を止め，

水層20μ1をHPLCに付し トリエチルアミ

反応液に ン酸 塩緩衝液

トリル

バイ了 トイ さらに酸性条件下でチオヒダントイン 誘導体

②p-POPTHーアミノ酸生成反応:上記の水層100μ1を10M 塩酸50 μlに加え1000Cで20分間加熱する.

rnMアミノ酸溶液(g0児アセ

ルを約10回強く振り混ぜ遠心分離したのち，

第1章で検討したm-POPICのチオヒダン また

1. 5mM p-POP

¹

C (アセトニ

さらに四塩化炭素300μlを加える.

逆相HPLCにおける分離及び検出感度を検討した.

ージオキサン ，

1-1) .

トを導入して合成した(実験の部参照) .

v/v)50μlをパイアル管iことり，

トリノレーピリジンー (p-PO PTHーアミノ酸)に導かれると予想される(Ch

a r

^t

反応液iこ20

mM

①p-POPTCーアミノ酸生成反応:^O. 05

-42- ン誘導体化反応条件の検討と同様に，

v/v)50μ1，

氷冷して反応を止める.

2-1 )

トニ アセ (1)蛍光誘導体化反応(F^{i g.}

8.5)250μlを加え，

ン混液(90:8.75:1.25，

トリル水溶液)100μ1，

p-POPIC についても，

1 :

1.

アミノ酸)を形成し，

イソチオシア不一

基準操作

加熱する.

件を求め，

2

- 1

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(2)

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その20μ1 ;をHPLCに付し 4M水酸化ナトリウム水溶液50μlを加える.

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ドロフラン及び

蛍光励起及び発光極大波長

p-POPTH-アミノ酸のピークを前述のpHの異なる2種の溶離液で分離分

-44-

トニ トリ

p-POPICと p-POPTC-アミノ酸及び このpHの変化によって蛍光励起及び発光 ル溶液をpHの異なる2種の溶液(1-2-(1)を参照)で10倍希釈して蛍光

m-POPICの メタノール 試薬が可溶な溶媒に溶かしスペク

p-POPICの ジオキサ ンーアセ トニ この時得られた蛍光励起及び発光極大波長を

(2)p-POPTCーアミノ酸及び‘p-POPTH-アミノ酸の蛍光スペクトル

A

1

a，

またp-POPICのジオ牛サンーアセ

これから，

His及びAsn

(1

mM)を基準操作にしたが って，

トラヒ トニトリル，

この反応液を逆相HPLCに付し，

トルと比較して大きな違いはなかった.

ア

2-2A'こ示す.

1-2-(2)と同じ条件で行った.

トルと安定性

p-POPICもm-POPICと同様にジオキサン，

アセ

いずれの溶媒中でも，

水，

極大波長に大きな違いはなかった.

スペク

クロロホルムには可溶であるが，

及びベンゼンには難溶であ った.

トリル溶液のスペクトルをFi ^g.

トノレ

に大きな違いはなかった.

トルを測定 したが，

(l)p-POPICの蛍光スペク 蛍光スペク

2-1に示す.

トルを測定した.

Hyp，

反応させた.

スペク

2 - 2

Tab 1

e

omq

2-2に示す.

各分画の蛍光励起及び発光極大波長をTable 取した.

m-POPICの場合と同じようにp-POPTC-Ala 及びp-POPTH -Alaから得た蛍 検討し またpHによる違いも認 た他の3種のア

トルの形は類似し てい められなかった

m-POPICと比較すると， スペク

2 -2) .

(Table

m-POPICはm-POPTHーアミノ酸の方が励起波長が長波長域に ある たが，

p-POPICはp-POPTC-アミノ酸の方が励起波長が長波長域に のに対し，

p-POPTH

p-POPTCーアミノ酸は約3時間，

あるという違いが見られた.

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トルはいずれも良く似た形を示し(F^{i g.}

2-2

ミノ酸による違いもなかった.

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またm-POPICの場合と問機にアミ ーアミノ酸は約1時間安定であった.

ノ酸との誘導体の励起波長が試薬の それ と違いがあるのでHPLC検出 p-POPIC及びその蛍光アミノ酸誘導体はHPLCにおいて n m及び発光波長4 00

図から明らかなようにm-

2 -3).

p-POPTH-アミノ酸を分離した(F^{i g.}

POPICの場合と同様に一部のアミノ酸で相互分離のできないものがあ

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ミノ酸を分離したHPLC条件(1-3参照)に従い， 21種の nmで、蛍光検出した.

アミノ酸誘導体のHPLC分離

m-POPTH-ア に適している.

励起波長340

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以下m-POPICの場合と同様に10種類と11種類のア したがっ て，

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ミノ酸のグループに分けてそれらの混液を反応させ分離検出した 各アミノ酸についてそれぞれ単一のピーク これから，

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p-POPICはp-POPTC-アミノ酸からp-POPTH-アミ

G 1

u，

保持時間 2分から6分の聞に残存す

A

sn，

早く溶出する数種(Asp，

-47- しか し ，

ノ酸への変換が円滑に進行せず，

るp-POPTC -アミノ酸が認められ，

が得られた.

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-46-

p-POPTH-amino p-POPTC- and

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2-2 Excitation Tab1 e

8.5 and 5.0 pHs with so1 utions

acids in

8.5) So1 ution

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(pH

5.0) So1 ution

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(pH

acid derivative Amino

(run)

Emダmax

(nm) Ex/max

(nm) Em/max

(run) Ex/max

395 344

395

p-POPTC-Ala

344

335 402 335 402

p-POPTH-Ala

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395 344

395

p-POPTC-Hyp

344

403

394 335

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395 335

344

p-POPTH-Hyp

p-POPTC-His

p-POPTH-His

^{335 402 335}

403

344 395 344 395

p-POPTC-Asn

402

335

4

02 p-POPTH-Asn

335

F luorescence response

5.0

8.5

pH pH mixture

mixture acid

acid

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またp-POPTH-Proの Lys)のアミノ酸のピークと重なった.

Cys，

G

1

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ピークが試薬由来のプランクピークと重なった.

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誘導体化反応条件

2

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4

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(ロJ明巨)

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1 1 e)に

Lys，

Trp，

Met，

モデル化合物として5種のアミノ酸(G1 y，

ついて誘導体化反応条件を検討した.

(1)試薬濃度

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o rl 811

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mMのp-POPICを用いてp-POPTHーアミノ酸の生成ピークを調

0.5-1. 5

m-POPICの場合と同様に濃 この結果上記の濃度範囲において，

べた.

度を高くするにしたがってp-POPTlトアミノ酸の生成量が多くなった のp-POPICを用いることにした.

mM

よって1.5

(F i

g.

Oロ寸EMWE出hF仏O仏t仏

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Cコ

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ピリジン及びトリエチルアミンの濃度

( 2)

ピリジンの2 種について反応 塩基性触媒としてトリエチルアミン，

トリル50μl中の1.25%トリエチルアミン アセトニ

条件を検討した.

及び8.75%ピリジンを用いたとき大部分のアミノ酸において，

この反応条 p-POPTCーアミノ酸の生成量が巌大であった(Fi g.

件はm-POPICのそれと同じだった.

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p-POPTC-アミノ酸生成反応の反応時間

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ミノ酸のp-POPTC -アミノ酸生成反応における温度を p-POPICとア

各温度における反応時間( 2-30分 )の影響を調 m-POPICと同様に1000Cでは最大のピークを得るのに約10分間

-51-

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1000Cと500Cに設定し，

べた.

-50-

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1 2 3

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nぺur円U

9 8

Py工idine

and the p-POPIC(5 pyridine concentrations on

10

。

with of 2-6 Fig.

Effect acids 1.5

formation reaction 1.25

the per on

each

(rnM)

concentration acids (5

内FLHrhd

nmol 1_0

p-POP工C 0.75

c

I o p n o -­ p m p Pゐ O P T H -

p

hu e

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of

「 0_5

2-5

。

Fig.

Effect

500Cでは同じピーク高さを

2-7A)，

の反応時聞を必要 としたが(F^{i g.}

したがって基準 操作では反応温度と時閣をそれぞれ1000C及び 10分間に設定した.

(4 )抽出溶媒

p-POPICもrn-POPICと同様にp-POPTCーアミノ酸からp-POPTH-アミノ 副産物や試薬の分解物などの妨害物 クロロホルムではrn-POPICの場合と同様

rn-POPICの場合と異 1000Cにおいて20分

1

-5一(1 )の基 準操作にしたがってOPA-MCE試液を用いてp-

POPICとア

ミノ酸の反応収率を求めた.

2-7B).

得るのに長時間の反応が必要であった(F^{i g.}

10Mの 10Mと5Mの時の1000Cにおける反応時間を検討した.

L.

、，

Phe)も抽出される

rn-POPICの場合と同じように10Mの塩酸を用いる方がp-POPTH-アミノ

2

-

⁵

妨害物質を効率よく

未反応のアミノ酸を定量した結果を

r「U Ed

rn-POPICの場合と同様に四塩化炭素を使用することにした.

基準操作においては，

1000Cにおいて20分間の反応時間を設定した.

反応収率，

p-POPTH-アミノ酸生成における反応温度と塩酸濃度

1 1

e，

しかし，

なりp-POPTHーアミノ酸への変換に長時間を要し，

p-POPTCーアミノ酸をほぼ完全に残し，

塩酸を用い，

妨害物質 と共にp-POPTC-アミノ酸(Leu，

検量線及び検出限界 したがって，

酸の高い生成率が得られた(F^{i g.}

酸へ変換してHPLCに付す前に，

質を除去する必要があった.

間で最大の生成量を得た.

抽出することができた.

塩酸の濃度が，

の結果，

ので，

、、，，，rhu ，，‘‘、

lこ，

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(B)

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100

川相nmJ明ωぷ

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6 1b 2b 3b

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B

­

(C

T P

o p

p M 5 and

Reaction

(HCl) from acid hydrochloric

p-POPTH-amino M

10 (min)

(A) formation

in time time

reaction Reaction

of Fig. 2-8

Effect

acids of

tube) the

reaction on

per acid each

2-3 chloric

nmol

Table (5

the after reaction

七he in unreacted remained

that acids

aml.no of

Amounts

p-POPIC tube) wi七h

reaction per

nmol acids (5

aml.no of

reaction coupling

(nmol) Amount

acid Amino

Amount(nmol ) acid

Amino

0.21 0.21 0.15

。

。

。

。

。

Proa) Hyp・}

Leu Ile Val Phe Trp Tyr Gly

Ala

0.12 0.04 0.25 0.14 0.15

0.19

。

。

。

。

Cys川

Ser

His Arg Thr Gln Glu

Lys Met Asn Asp

C.M

�

with reaction

fluorescence reagent.

could

o-ph七halaldehyde-2-mercaptoethanol(OPA-MCE) the by detected be

acids not aUll.no

The the a)

nmolであり，

反応に用いたアミノ酸は反応液中S 2-3に示す.

Table

100

200

Fig.

Calibration graphs of amino acids detected as p-POPTH-amino acids

-59-

150

(pmol) injected

100

acid 50

Amino

2-9

。

(以吋ロロhM6HリザJ判AMMW)川相耳切J判ωZMωω仏

。

p-POPICとアミノ酸の

検量線

検出限界(S/N=3)はO. 2

m-POPICの場合より またrn-POPICに比べ，

POPICの方が m- POPICに比べ1. 5-3倍高いという利点があった.

-58 -

p-

それぞれ いずれの検量線も原点を通る直線を示した

しかし検出限界においては，

また基準操作に従ってアミノ酸をp-POPTH-アミノ酸とし，

。-POPICもm-POPICと同様にp-POPTH-アミノ酸へ導くと，

反応収率は少なくとも95-100%であることが分かった.

p-POPTH-アミノ酸への変換には長時間を要した.

2-4) .

のアミノ酸に対し単一の蛍光ピークを示したが，

nmolであるので，

各n=2プロ ッ pmo l/HPLCl注入量であった(Table

試薬由来のブランクピークも高い.

未反応のアミノ酸は0-0. 25

(相関係数r=O. 992 -0. 998，

を作成した(Fi g.

2 _- 6 小括

-2. 4

ンドリル)フェニルイソチオシアネート 4-(2ーシアノイソイ

第3章

によるアミノ酸及びジペプチドのプレカラム蛍光誘導体化 とHPLC

ペフ。

アセ

本章ではCIPICとアミノ酸及びジペプチドの蛍光誘導体化条件の

1

ト基に変換させたCIPIC を合成し

Leu-Ala ) (アセ アミノ酸との蛍 分子内にイソチオシアネート基を有

3に示すようにシ またシアン

ペプチド)生成反応 第一アミンと反応し強い蛍光性のシアノイソ

塩基触媒としてアセ

トリエチルアミン

1. 25

円4U

100

しているのでPITCと同様な反応機構になると考えられる(Chart

ドを導入し，

アミノ酸，

トリル溶液

8.

75

チドあるいはタンパク質と反応して鋭敏に蛍光を呈し，

化物イオ ンの存在下，

アミノ酸 溶液あるいはジペフチド(Ala-Gly，

トリエチルアミン混液(90 OPA はMCEのような還元剤の存在下で第一アミン，

トアニリ

CIPICもPOPICの場合と同様に，

そこで著者らはChart

トニ トリルー

①チオカルパモイル誘導体(CIPTC-アミノ酸 ・

v /vの溶液) 50μlに，

アセ アン 化カ リウム存在下 OPAにpーアミノ アセ

トニ v/v)50μl及び10mM CIPIC

1i nhu

チル化後フェニルイソチオシアネー

ペプチド 溶液にはアセ 検討とHPLCへの応用を検討 した.

光誘導体は単離していないが，

(1) 蛍光誘導体化反応(F^{i g.}

イ ンドールを生成する1 ^{5 )}

トリノレーピリジン ー

混液(9

た(実験の部参照).

基準操作

トリル-

71<.

v/v)50μ1 ，

: O. 1 rnM

円。

トニ トニ

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日制.明日付叶リV刊日J明付

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Fig. 3-1

lmNl

preco1umn by

peptides and

acids anll.no

CIPIC of determination derivatization with

HPLC for

f1uorescence Procedure

も �c�Qnitri1e). 50μl (in 90

peptides or

acids Amino

v/v) or (90:8.75:1.25，

Acetonitri1e-pyridine-triethy1amine

l v/v) 50μ

l (90:10，

100 acetonitri1e) acetonitri1e-triethylamine

CIPIC (in

10 mM μ

m1n 80X; ， 5

l

HPLC 200μ

to l HaO

App1y 20μ 8.5) or

l (pH

\

200μ buffer tetrach10ride

Centrifuge Aqueous layer

Phosphate Carbon

Mix 25 mM

10ωl

50μ エ acid Hydroch1oric

HPLC M

to 2.5 1)

min

1 App1y 20μ

μ

5 (100

サ

80X; ，

(日ロ)

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白

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氷冷して反応を止める. 次にア 5分間加熱する.

800Cで μ1を加え，

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∞ody

。。略

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同同副y mwO叩

HHdy OHdy

HH叩 ∞O叩

(自己)

国仏

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匂ロ伺

ペフチ ン酸塩緩衝液(pH 8.5) 200μlを、

ミノ酸の反応液には25mM

ω匂J判Uの

四塩化炭素200μlを加 ド の反応溶液には水200μlを加えたものに，

，ー‘、 ，国司、

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田仏

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水層20μ1をHPLCに付した.

遠心分離し，

え激しく振り混ぜ，

ン誘導体(CIPTH-アミノ酸)生成反応:上記の水

②チオヒダントイ

ト@内。川WN

∞mN m@内

∞mN N由内

∞mN N@N

mmN ∞市山内

Mn伺巨\M門凶

800Cで5分間加熱する. 氷冷 反応液20μlをHPLCに付した.

HPLC

( 2)

粒径

i. d. .

m m

x

4.6

ODS-120Tカラム( 150

gel

逆相分配型のTSK

ド トニトリル， テトラヒ

溶離液にはア セ 東ソー)を使用した.

m μ phu

記

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小山内∞@N

∞mN NmwN

mmN 内申N

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トリエチルアミ

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」【l内ω叶nHMwh

(v /v)の (v /v)及び80

10

65 20 10

の容量比が，

トリル濃度を40 分 トニ

アセ で，

ml/min

流速は 1.0

2種類を用いた.

励 検出は，

操作は室温(22 +

トルと安定性 40C)で行った.

蛍光スペク

0. 0.

ω ω

< <

I ，

U 出8 8 仏 ø..

ト4 ト4

u u

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叶出』uhn同HU 向何回t出LFn同HU 仏何回lυ←仏HU

MW

」門41出LF仏HU

剖WH41ULF仏HU

ω〉叶川VMW〉J判制ω旬

匂J判Uの

Leu-Ala(各1mM)を基準操 Hyp及び Ala-Gly，

Asp，

H i s，

A 1 a，

G

1

y，

CIPTC-アミ この反応液をHPLCに付し，

作に従いCIPICと反応させた.

OロJ判民〈

ノ酸 ・ ペプチド及びCIPTHーアミノ酸のピークをpHの異なる2種の溶離

，戸、，ー、

"' ..Q

内《UV

トル及びCIPTC-

r「u nhU

- 4やー←←

-E・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・圃E 可 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・

層100μlに2.5Mの塩酸50μlを加えて，

して反応をとめ，

閣で20ト80児まで変化させる直線グラジエントで行った.

nmで行った.

260 nm及び発光波長410 起波長

3

-

²

各分画の蛍光励起及び発光極大波長をTable CIPTH-Ala の蛍光スペク

まTこCIPTC-Ala，

-64-

液で分離分取した.

1に示す.

他のアミノ酸及びペプ 3-2'こ示す.

トルをFig.

Ala-Glyの蛍光スペク

Ex Em

またpH変化 トルも互いに類似していた.

チドの誘導体の蛍光スペク

室温でCIPTCーアミノ ノ酸はそれぞれの反応液中で約 よってCIPIC及びその誘導体 はH PLC検出に適し

CIPICとのカップリング反

3 )が ，

' • 唱aA

それぞれのアミノ酸で遅

3' )は各アミノ酸に したがって基準操作では反応溶液中の妨害物質を取り除く たCI PTCーアミノ酸 はアンモニア及び試薬由来のブランクより早く溶

上記のアミノ酸に対しそれぞれ

CIPTH-アミノ酸に変換 CIPICとアミノ酸とのカップリング反応によって生成し

その 保持時聞が14-30分であるそのフランクピーク

20種のア ングリング反応後iこ四泊化炭素で抽出した(Fi g.

3-3A

トグラムをFi g.

3-3B 及び C).

CIPTH-アミノ酸の蛍光ピークの検出 を困難にした(Fi g.

副反応物 は酸変換反応後も分解しな いで反応液中に残り，

ミノ酸からそれぞれ 検出された.

-67-

応及びそれに続く酸変換反応後の反応液のクロマ

及び によるスペクトルの違いも認められなかった.

由来する副反応物であることが分かった(Fi g

. B)

_• をモデル化合物として，

及び 及び CIPTC-ペプチド及びCIPTH-アミ

アミノ酸誘導体のHPLC分離

早く検出されるピーク(peak CIPICとのカップリング反応では

3-3A 2本のピークを与えた(Fig.

く 検出されるピーク(peak ていることが分かった.

1時間安定であった.

3-3A).

カップリ

Leu A

1

a，

出した(Fi g.

に示す .

C).

3-3B).

ために，

G ly，

QU

Qυ

され ，

and

酸，

は，

nベU

500

Fig.

Fluorescence excitation and emission spectra of HPLC fractions of (A) CIPTC-Ala，

(B)

^CIPTH-Ala

(C) CIPTC-Ala-Gly.

-66-

500

500 400

Em

400 (nm)

400

Em

300

300

Wavelength

300

Ex

Ex

220

220

220

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hHOロパ仏

3-2 (B)

and (C)

トグラムを示す.

3-4に20種のアミノ酸の最終反応液のクロマ

F i g.

20種全てのCIPTCーアミノ酸は酸変換反応によってそのアミノ酸に相 各アミノ酸 当する各単一ピークを示すC1 P TH-アミノ酸lこ導かれた.

の副反応物は 分解及び変換せずに保持時間5-15分に検出された. し Metと Proの蛍光ピーク(CIPTH-アミノ酸)がそ かしながらGl nとHi s，

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30 v/v，

トリル濃度(20-74完，

移動相中アセトニ れぞれ重なり，

ト溶離でそれらの誘導体を完全に分離するこ min)の直線グラジエン

Aspと Asn及びGluと 良好な点が観察された.

ジペプチド誘導体のHPLC分離

3

-

⁴

hHoh明日hHOUH

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ゃ、

u

しかしPOPICと比較すると ， Glnの蛍光ピークが分離でき るなど，

とはできなかった.

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(〈)

ωMロ川VM内J門医

(に叶巨 山口ωA“門

Ala-Gly及び Leu-AlaもCIPICと反応しCIPTC-Ala-Gly及びCI PTC-

h・伺H4 カップリング反応

2).

及び

peak 1 3-5A，

Leu-Alaを生成した(F i g.

それぞれ のジペプチドに対し副 ではアミノ酸のと きと同じように，

酸変換反応 次に，

• 、‘，J ，

内，b

peak

l' 及び

3-5A，

反応物を与えた(F i g.

及びCIPTC-Leu- Alaの 反応時間とと もにCIPTC- Ala-Gly

を行なうと，

peak 3 C，

及び 3-5B N末端アミノ酸(F i g.

蛍光ピークは減少し ，

これらの誘導体 及びCIPTH-Leuが生成された.

4)のCIPTH-Ala 及び

これによりジペ プチドのN末端アミノ酸の決定が可能であることが分かった.

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1 1

\

N r寸

(同) ぷU伺ω

uコ c"1 c>

c"1 J【O百回

基準操作に従い各ペプチドで確認した.

の生成は，

"のHd"N ω例VJ明U伺Oロ吋ロ司 伺

ω

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1 1 1

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、1 1 1

1 、

、、

、、 1 1

1 1 1 、

、

、

e、a F、

、1 1 、

1 、

、、

\ 、

，→

4

誘導体化反応条件

3

-

⁵

『ミ=

Leu)及びジペプ

Trp，

Val.

Arg，

A

1

a，

Gly，

7種のアミノ酸( G1 u，

asuoasa� aouaosa�onTd

nu.u Fhu

-68-

，戸、

^。ρ

hh〆\〉)

65

ωa【叶HけV叶ロouvω04

aF 4F ， aF dF aF JF 戸

2

1

4+5

�----__，�ζ

(

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74

2

20

6

mi玄ture

2'=

for

冒ム

a n

--

- vu m

市ム e G

-

t

一

a N 唱ム

= A 3

Ala-Gly tube) m1n (A)

reaction

Leu-Ala;

of (B)

(C)

reaction 5 coupling

reaction mi玄ture

Leu.

4

reaction

Ala;

(C) for

(B)

and

Peaks: l=Ala-Gly; l'=by-product Leu-Ala: 2・=by-product for

4=N-terminal

41よ門，f

3

r e n

pi m

20

(min)

each 2 a 2

Ti_me

(A) nmol convers1on

10

of of

r

(5 times Fig.

Chro皿.atograms Leu-Ala its

ωωロO仏ωωHωυロ

3-5

ωυωωhH03叶ι阿

and and

ω同叶hHHV刊ロOけが

ω04

20

reaction.

reagent 18=Ile;

blank.

6=Ser;

13=

19=

nmol

.，. E Y

.，T

n

=

円羽 市4

q4

n G l

・- 一-

5 1

p

u o c

and

18

20

36

(5

convers1on

4=His;

7=Thr; 8=Arg;

14=Met; 15=Val; 16=Trp;

others=by-product

nuu 円，t

acids

11=Ala;

17=Phe:

〆...19

30

C I_PTH

-

^amino

tube)

9=Gly:

15

， 、，

司 lid --EEE・E・-aa-- aJ 唱ム，a'EE-­ 守，

Leu;

the gthe n

y

n s

H i

A

= w

=

nu

0 3 1

可ム 唱A

o

zι

7

8 11

9

12

1n

20

却

(min)

the 3

2=Glu;

Tìme

mixture reaction

of

2

10 1

s

却

r g o t a m 0

. r g h i

F

c

l=Asp;

20=Lys;

per reaction 3-4

Peaks:

each

。

Pro;

ωmGonhωωね

ωOロωoωωhH03叶』

Leu-Al a)をモデル化合物としてCIPICとの誘導体 化反 チド(Ala-Gly，

5 7 1 9 8 2 100

{UVJ明白ロ討しHωHUVJ判AMMW)

けvnhuJ明ω耳MMWω仏

応条件を検討した.

( 1)試薬濃度

アミノ酸に トニトリルに 約15 rnMまで可溶であった.

CIPICはアセ

ペプチド に対しては7. 5 rnMの濃度を用いたとき 対しては5 mMで，

また過剰j試薬による反応阻 害は観察されなかったのでCIPICの基準操作では10 rnMに設定した.

、‘，，， nJu r'E‘、

CIPICとアミノ酸の反応もPOPIC同様にトリエチルアミン及びピリ 基準操 。

それらの塩基が存在しないときは，

ジン存在下で進行した.

10

そこでトリエチルアミン及びピリジンの濃 生成は約1/20であった.

2.5 。 V/V) (毛，

5 pyridine 7.5

CIPTCーアミノ酸の蛍光ピークはアミノ酸の場 10

度について検討した.

the

6=

Fig. 3-6

Effect of triethylamine and pyridine

concentrations on the coupling reaction of amino acids and dipeptides (5 nmol each per reaction tube).

Curves: l=Gly; 2=Ala;

Glu; 7=Trp; 8=Ala-Gly;

8.

75

アセトニトリルー ピリジンートリエチルアミン(90

A 仁J

，

ジペプチド v/v)50μlを用いたときで最大であった. しかし，

1. 25

塩基触媒としてトリエチルアミンとピリジンの混液を用い の場合，

トリエチルアミンのみを用いたときの方がより高いピ たときより，

5=Leu;

3=Arg; 4= Val;

9=Leu-Ala.

そこでアセトニトリル50μl中トリエ ーク高さを得るこ とができた.

チルアミンの濃度を0-20先まで変化させカップリング条件を検討し

v /v)

アセトニトリルートリエチルアミン(90

10

50μlを用いたとき最も高い ピーク高さが得られた.

反応温度と反応時間

、‘，，，n《けV，，‘、、 円4U円ff

一ι-

CIPTC蛍光体の生成がほぼ最大に達した.

3- 6)

塩基濃度(F_{i g.}

7.5 (も， vjv)

2.5 5

Triethylamine

。

作で 反応した場合に比べCIPTCー アミノ酸 ・ ペプチドの蛍光ピークの

その結果，

た.

nJ白円，f

M 11

N ζコ

CHduN

ωZHVい明

lI"I

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M

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(〈)

u∞ O刊リギ

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刷OCO刊以ωghHO似 J明UMW

内同HU

u、

0\

カップリング反応及び酸変換反応において 50-1000Cの範囲で反応 温度が高いほど反応が早く進むことが分か 時間を検討したところ，

酸変換反応では2-3分間の各 カップリング反応では2-4分間，

っ7こ.

ほぼ最大のピーク高さが得 反応時間で反応温度を1000C'こしたとき，

また 500Cでは最大のピーク高さを得るのに60分以上の反応 られた.

800Cでは両反応とも。C5分間で最大のピーク高さ 時間を必要とした.

アミノ酸とジペ いずれも800C5分に設 よって基準操作では，

プチドのカップリング反応 及び酸変換反応は，

定した.

A及びB)

_•

を得た(F^{i g.}

3-7

Cコ

(同)

=lq6τaq l(l?aa o

(=lτun瓦.:Il?.:I=lτq.:IE)

OOH

( 4}酸変換反応

Cコr、a

CIPTC-アミノ酸 ・ ペプチドからCIPTH-アミノ酸への変換反応に用

九円凶い

UMWω

0 ロ .c: ω

酢酸及びトリフルオロ酢酸 過塩素酸，

いる酸として各2.5Mの塩酸，

� E-4 H ト11 ω 刊日伺t 以ロ

O

酢酸及びトリフルオロ酢酸では樋酸， 過塩素酸 について検討した.

山口ωAH凶 叶O民民的)ωω (国)HVロω

‘ωω

ωω巨吋μロO刊HVUωωhH

白 川口 .c: r・4

u ω ro 11 ω uコ

国LFh凶HU

“、 r-i

塩酸と過塩素酸ではほぼ同じ結果を得

ベースラインの乱れがより少ない塩酸の2. 5Mを反応に用いた.

に比べ変換に 時間を要した.

fこカf， _(ロ叶E)

Cコr-i 白ωE吋 ング反応における副反応物

(5 )

カップリ

九州伺

カップリング反応液中の水の量が副反応物の収率に影響している

〉"凶Y

。刊以匂叶川相

外40 +J

トー内

アミノ酸のカップリング反応溶液200

u、

3-8) .

ことが分かった(F^{i g.}

hm H

aω仏Jh

仏ω白J明

Uωん刑制.回

CI PTCーアミノ酸の生成 μl中の水の量を2.5-50%(v/ v)まで増やすと，

4 匂 匂 cil

.�

b‘

(dH)

副反応物は増加した(約十20 が減少していく(約2/3倍)のに反し，

Cコ

'l o

(ヰτun五.:Il?.:I=lτq.:IE)

roOOH

ペプチドでは上述の範囲でCIPTCーペプチドの生成は同様 倍) . 一方，

=lq6τaq l(l?aa

高IJ反応物も減少した(約2/3-1/2倍)

iこ 減少したが(約2/3-1/2倍) ，

また塩基触媒としてピリジンのみを用いると， 副反応

3 -9).

(F

i g.

。

。 25 50

Water (毛， v/v)

Fig. 3-8

Effect of amounts of water on the coupling

reaction mi玄ture of amino acids (5 nmol each per reaction tube) with CIPIC.

Curves: l=Gly; 1・=by-product for Gly; 2=Ala; 2'=

by-product for Ala; 3=Arg; 3・=by-product for Arg 4=Val; 4'=by-product for Val; 5=Leu; 5'=by­

product for Leu; 6=Glu; 6'=by-product for Glu;

7=Trp; 7'=by product for Trp.

-76-

。

。 25

Water (毛， v/v)

Fig. 3-9

50 1 2

l'

2'

Effect of amounts of water on the coupling

reaction mixture of dipeptides (5 nmol each per reaction tube) with CIPIC.

Curves: l=Leu-Ala; 1・=by-product for Leu-Ala; 2=

Ala-Gly; 2'=by-product for Ala-Gly.

-77-

その副反応物の構造については未確認であ 物は減少した(第4章) .

泊泊.0

トm.0。ザ.0

副可門.0

同門.0AW4y.0

山w@.0

。門.0川w門.0

H門.0(Hog仏)

ロO刊以UωHVω白HV」明日刊同

検量線及び検出限界 反応収率，

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CIPICとのカップリング反応によるアミノ酸及び2種のジペプチド

のCIPTC-Ala-Gly及びCIPTC-Leu-Ala(各5nmol反応液中)の生成 収率は POPICと同様にOPA-MCE試液を用いるプレカラム誘導体化法で測定し

その結果反応液中に未反応のアミノ酸及びペプチ た(1-5-(1)参照) .

アミノ酸及びペプチドはほぼ それゆえ，

ドは検出されなかった.

(門"Z\ω)

しかし反応 生成物がすべ 100 %CIPICと反応するものと考えられる.

それに てCIPTC-アミノ酸及びペプチド であるということではなく，

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基準操作iこしたがって得ら は副反応物も含まれるものと思われる.

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少なくともO. 025- れるアミノ酸及び2種のジペプチドの検量線は，

nmol(HPLC注入量)までは原点を通る直線を示した(相関係数r=

2. 5

N1門

pmol/HPLC注入量であ 結果未掲載).

O. 7 O. 3 -

ト，

アミノ酸の検出限界(S/N=3)は，

3

-

⁷

各n=2プロ ッ

0.994-0.999

小括 っTこ(Tab 1 e.

ωHA

ωLF

ドマン試薬であるP1 TCと同様な反応条件 新規に合成したCIPICはエ

それらの蛍光誘導体化に適していた . アミノ酸と反応し，

下で，

-79-

uv検出HPLCでのPITC試薬を用いたときょ

m-POPICより高くp-POPICとは同等であった.

円ハv円，z

HPLCでの蛍光検出感度は，

少なくとも2桁高く，

り，

またCIPICのアミノ酸及びペプチドとの反応性は極めて高く， CIPIC を用いたこの反応条件によって， ジペプチドのN末端アミノ酸 の決定が可能であった. よって蛍光エドマン分解への応用が期待で きる.

-8 0^-

第4章 4-(2ーシアノ イソ インドリル)フェニルイソチオシ アネート を用いたトリペプチドの蛍光エドマン分解

エドマン分解を行うに あ たって， 試薬がペプチドあるいはタンパ ク質と完全に カップリンクーすること がまず重要な条件となる. しか し， これまで報告されている大部分のエドマン類似試薬はペプチド とのカップリング反応における収率が十分ではない. また合水条件

下では， 通常エドマン分解時にペプチドの解裂を引き起こすので ， 無水有機溶媒中でチ アゾリノン誘導体を形成させエドマン分解させ ている. この場合煩雑な脱水操作を必要 とする.

CIPICは第3章で述べたようにペプチドとほぼ完全に 反応するので，

カップリング反応においてPITCによるダブルカップリング法を 必要 としないこと が予期される. また第3章でCIPICとペプチドとの反応 条件を検討した際， 塩基触媒と して ピリジンを用いるとトリ エチル アミンを用いたときに比較して， C 1 PTC-ペプチドの生成量は少ない が副反応物が 極端に減少するという知見が得られた .

そこで本章では， カップリン グ反応においてピリジンを塩基触媒 として用いた反応条件につ いて検討し， またエドマン分解における 操作を従来の方法より簡便にする目的で ， 含水条件下にN末端アミ ノ酸を切断すると同時にCIPTH-アミノ酸に変換するという新しいエ ドマン分解操作について検討した(Chart 4-1).

4 - 1 基準操作

( 1

)エドマン分解操作(Fig. 4-1)

-81-