誰でも簡単！基礎から分かるリアルタイム PCR
株式会社キアゲン 瀬藤 拓也
本日お話しさせていただく内容
リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA精製
逆転写酵素
リアルタイムPCR試薬
SYBR GreenリアルタイムPCR用Primer
リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA精製
逆転写酵素
リアルタイムPCR試薬
SYBR GreenリアルタイムPCR用Primer
リアルタイム PCR による遺伝子発現解析の流れ
例）がん細胞特異的に多いRNAは、どんなRNAか？
高品質 RNA 定量
効率的な サンプル破砕 正常細胞
がん細胞
サンプルタイプごとに 応じたRNA精製
正確に定量できる リアルタイムPCR がん細胞で多く発現して いる遺伝子を探す
検体
RNA安定化 RNA精製
逆転写 リアルタイム定量PCR
リアルタイム PCR とは
PCR では
PCRによる目的断片の増幅
励起& 蛍光検出 リアルタイムで増幅産物をモニタリング10 cycle 15 cycle 20 cycle 25 cycle
リアルタイム PCR では
PCRによる目的断片の増幅
電気泳動 ：A
遺伝子 ：B
遺伝子リアルタイム PCR とは 検出について
目的とする
RNA
量の多いサンプル 早く光る立ち上がり早い
目的とするRNA量の少ないサンプル 遅く光る
立ち上がり遅い
→ サイクル数
→
蛍光強度リアルタイム PCR 原理 ― 用語
Amplification Plot （増幅曲線）と threshold と C T 値
蛍光強度（対数目盛）
10
0 20 30 40
Cycle数 Cycle
数10
0 20 30 40
蛍光強度（リニア目盛）
BaseLine
Threshold
（閾値）Cycle Point値（C
T値）Thresholdの設定：
バックグラウンドのノイズよりも上
蛍光強度を対数目盛りにしたときの直線内に設定テンプレートが多いほど早く 検出され始める
サイクル数 サイクル数
ターゲットの定量
Exponential phase 対数直線増幅領域
PCR産物分子の生産がサイクルあたりの
ターゲット分子に正比例する Plateau phsase プラトー領域
PCR
産物収量の増加が無いか殆どない• PCR産物濃度 （PCR産物の蓄積による
DNAポリメラーゼの有 効濃度の低下）
• PCR基質の枯渇
• PCR
酵素の半減期•
最終産物によるポリメラーゼ反応の阻害リアルタイム PCR ― 検出方法
SYBR Green 法と Probe 法
SYBR Green Ⅰ法
• 価格が安価
• 融解曲線（メルト）解析で非特異的増幅の有無を検出可能
• 非特異的な増幅も検出
• 特異的増幅が得られた場合、感度は TaqMan Probe 法より高い
• Primer デザインの自由度が高い
TaqMan Probe 法
• 価格が高価
• Primer に加え、 Probe を使用することで特異性が高い
• デザインの自由度が低い
リアルタイム PCR 検出方法 蛍光検出方法
SYBR Green 法 TaqMan Probe 法
融解曲線解析
融解曲線（メルト）解析とは
解離
（メルティング）
温度が上昇すると、DNAは二本鎖から一本鎖に
低温 高温
deg.
78.5 79.0 79.5 80.0 80.5 81.0 81.5 82.0 82.5 83.0 83.5 84.0 84.5 85.0 85.5 86.0 86.5 87.0 87.5 88.0
dF/dT
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
deg.
78.0 78.5 79.0 79.5 80.0 80.5 81.0 81.5 82.0 82.5 83.0 83.5 84.0 84.5 85.0 85.5 86.0 86.5 87.0 87.5 88.0
Fluorescence
80
70
60
50
40
30
20
10
2
本鎖DNA 1
本鎖DNA
蛍光値
-dF/dT
融解曲線（メルト）解析で分かること
PCR 増幅産物の特異性確認
プライマーダイマーなど非特異増幅の確認
特異的な増幅産物
リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA精製
逆転写酵素
リアルタイムPCR試薬
SYBR GreenリアルタイムPCR用Primer
サイクル数
Threshold
蛍光強度20 23 26 29
2 14 2 11
2 8 2 5
サイクル数テンプレート量
コピー数、濃度、相対量など
23 20
2 5 2 8 2 11 2 14
Y = aX + b
a は増幅効率を表す 29
26 リアルタイム PCR の原理
どのように発現量を解析するのか ― 検量線
検量線（スタンダードカーブ法）
サイクル数
蛍光強度
サイクル数テンプレート量 2 5 2 8 2 11 2 14
Y = aX + b
2 14 2 11
2 8 2 5
2 6 リアルタイム PCR の原理
どのように発現量を解析するのか ― 検量線
Threshold
20 23 26 29
23
20
29
26
リアルタイム PCR の定量方法
絶対定量法 相対定量法
スタンダードカーブ法 スタンダードカーブ法
ΔΔC
T法説明
核酸の絶対量を測定
既知のコピー数や重量の外部スタンダード による検量線が必要
サンプル間の遺伝子の発現量を相対的に 比較
目的サンプルの遺伝子が基準となるサン プルの遺伝子と比較し、どのくらい発現 量が変化したかを算出する
使用例
ウイルス量、細菌量など 遺伝子発現量比較
ex.）薬剤投与した培養細胞 ：処理して
いない培養細胞検量線 必要 必要 不要
スタンダード
DNAスタンダード ; ターゲット遺伝子を
クローニングしたPlasmidなどRNAスタンダード ; in-vitro転写によって
合成した、ターゲットmRNA
実験系において細胞内で恒常発現してい る遺伝子
ハウスキーピング遺伝子を使用すること がほとんど
キャリブレーター 不要 必要 必要
補正遺伝子 不要 必要 必要
サイクル数
蛍光強度
サイクル数テンプレート量 2 5 2 8 2 11 2 14
Y = aX + b
2 14 2 11
2 8 2 5
2 6 リアルタイム PCR の定量方法 ― 絶対定量法 スタンダードカーブ法
Threshold
20 23 26 29
23
20
29
26
補正用遺伝子は細胞内で恒常発現をしている遺伝子 （ハウス キーピング遺伝子）を使用
恒常発現遺伝子と比較し、その後、コントロールサンプル（キャリブレーター）と比較
コントロールサンプル
（キャリブレーター）
テストサンプル
補正 ; 4 ÷ 4 ＝ 1
細胞内ターゲットmRNAはβ-actinの1倍
12 ÷ 6 ＝ 2
細胞内ターゲットmRNAはβ-actinの2倍
ターゲット
mRNA β-Actin
÷
2 ÷ 1 ＝ 2 （ fold change 2 ）
テストサンプルのターゲットmRNAはコントロールサンプルの2倍発現している
リアルタイム PCR の定量方法 ― 相対定量法
実験条件、条件の異なる組織、細胞株で発現レベルが変動しない遺伝子
よく使われる GAPDH や β-actin は条件により変動する場合がある
複数のハウスキーピング遺伝子測定し、変動の少ないものを使用
補正遺伝子を選択するソフトウエア（ BestKeeper, NormFinder など）もある
補正に使用する遺伝子は、ノーマライズ遺伝子、リファレンス遺伝子やその まま ハウスキーピング遺伝子などと呼ばれる
リアルタイム PCR の定量方法－相対定量法
ハウスキーピング遺伝子の選び方
ハウスキーピング遺伝子
► ターゲット遺伝子と同レベルの発現量のハウスキーピング遺伝子を選択
リアルタイム PCR の定量方法－相対定量法
ターゲットスタンダードカーブ法
•
検量線（スタンダードカーブ）を作成•
遺伝子とリファレンス遺伝子の増幅効率が 異なる場合も使用できる•
検量線は不要•
ターゲット遺伝子とリファレンス遺伝子 の増幅効率が同じ場合にのみ使用できる ΔΔC T 法
Fold Change = 2 -ΔΔC T
ΔC
T=
ターゲットC
T－リファレンスC
TΔΔC
T= テストサンプル ΔCt
－キャリブレータサンプル
ΔC
補正ターゲット遺伝子の発現量
÷
リファレンス遺伝子の発現量
Fold Change
補正後テストサンプルでの発現量
÷
リアルタイム PCR のよい結果とは
非特異的増幅がない
No Template Control & 融解（ SYBR Green 法）
低濃度・低発現での測定が可能となる
ゲノム DNA の増幅がない
No RT Control で増幅がない
unknown サンプルの結果が検量線内（測定レンジ）に含まれる
ダイナミックレンジ（検量線が直線になる最大～最少の RNA 濃度）を 外れると増幅効率と相関係数の値が適切でない
検量線の傾きが適切。検量線から離れている測定値は外す
適切な傾きの範囲の目安 約 –3.8 > x > – 3.3 （ 83.3% / 100% ） E = 10 (-1/S) -1
S: 傾き
E: 増幅効率
検量線の相関係数の二乗が、 1 に近い（約 0.98 以上）
再現性が高い
► RNA の精製度、プライマーの設計・濃度、アニーリング温度の最適化
リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA精製
逆転写酵素
リアルタイムPCR試薬
SYBR GreenリアルタイムPCR用Primer
リアルタイム PCR による遺伝子発現解析 の流れ
例）がん細胞特有に多いRNAは、どんなRNAか？
高品質 RNA 定量
効率的な サンプル破砕 正常細胞
がん細胞
サンプルタイプごとに 応じたRNA精製
正確に定量できる リアルタイムPCR がん細胞で多く発現して いる遺伝子を探す
検体
RNA安定化 RNA精製
逆転写 リアルタイム定量PCR
採取後の検体中の核酸の安定性
DNA/RNA の安定化 DNA
時間
分解
RNA
時間 発現
分解
RNA
の発現プロファイルを変化させる要因
検体採取後の、RNA分解酵素による
検体採取後に起きる、遺伝子発現レベ ルのダウンレギュレーション・アップ レギュレーション
検体の凍結融解による、RNA
の分解解決方法
検体採取後、RNAを速やかに安定化[検体のRNA安定化の方法]
凍結保存、安定化試薬の使用、ライセート RNA
安定化までは検体への負荷を少なくするRNA 安定化
採取後の検体中の核酸の安定性
組織摘出後の RNA 安定化
摘出時の組織内 RNA をそのまま保存
組織内の RNA を安定化
• 室温： 7 日間まで
• 4 ℃ ： 4 週間まで
• – 20 ℃ ～ – 80 ℃：長期
凍結解凍の繰返し可能
RNA を安定化したまま検体を輸送可能
RNAlater™ RNA Stabilization Reagent
RNA 安定化
RNAlater の迅速な RNA 安定化
0 5 10 15 30 60 M 0 5 10 15 30 60
分GAPDH
非安定化RNAlater
による安定化変性
アガロースゲル
ノーザンブロット
► RNAlater を使用することで迅速に RNA を安定化
ラット腎臓組織
組織サンプル中の DNA 、 RNA 、タンパク質を迅速安定化
Allprotect Tissue Reagent
採取した組織の DNA 、 RNA 、タンパク室を即座に安定化
組織内の RNA を安定化
• 室温： 7 日間まで
• 4 ℃： 12 ヶ月まで
• 長期保存の場合は – 20 ℃もしくは – 80 ℃
組織を安定化したまま検体を輸送可能
DNA/RNA/ タンパク質を同一サンプルから精製可能な
キット（ Allprep シリーズ）が使用可能
リアルタイム PCR による遺伝子発現解析 の流れ
例）がん細胞特有に多いRNAは、どんなRNAか？
高品質 RNA 定量
効率的な サンプル破砕 正常細胞
がん細胞
サンプルタイプごとに 応じたRNA精製
正確に定量できる リアルタイムPCR がん細胞で多く発現して いる遺伝子を探す
検体
RNA安定化 RNA精製
逆転写 リアルタイム定量PCR
RNA 精製
最適な RNA 精製キットの選択
サンプル種やスタートサンプル量
最適なキット（手法）の選択
RNA 精製 サンプル破砕の重要性
培養細胞 動物組織
破砕 ボルテックス 液体窒素上で 乳鉢 / 乳棒
破砕+
ホモジナイズ * 機械的破砕 機械的破砕
ホモジナイズ *
ボルテックス
（細胞数が少ない場合）
注射器 / 注射針
QIAshredder
機械的破砕
注射器／注射針
QIAshredder
機械的破砕
ホモジナイズ: gDNAのせん断をさす
RNA 精製
ホモジナイズの重要性：粘性を下げるプレカラム ; QIAshredder
スピンダウン方式ホモジナイゼーション：
•
高分子量DNA
のせん断•
ライセート中のデブリスを除去 乳鉢・乳棒で破砕した組織ライセートのホモジナイズ用
細胞ライセートのホモジナイズ用（ 3 x 10 7 cells まで）
細胞数：5 x 106個 細胞種：Hela
精製・溶出：RNeasy、40 µlで2回溶出
RNA量・1レーン：10 µl
► 適切で効率的な破砕とホモジナイズにより、高収量の RNA が得られる
RNA 精製
QIIAGEN 破砕装置一覧
TissueLyser II TissueLyser LT
TissuRuptor
RNA 精製 RNA 精製
溶出 検体
フェノール中で サンプルを破砕
破砕・ホモジナイズ
・乳鉢・乳棒
・Proteinase K
・機械的破砕
クロロ
フォルム添加
イソプロパ ノール添加
ペレット 溶解 の洗浄
ホームメイド法
QIAGEN スピンカラム法
核酸の 結合
メンブレンの 洗浄 ペレット化
RNA 精製 RNA 精製
溶出 検体
フェノール中で サンプルを破砕
破砕・ホモジナイズ
・乳鉢・乳棒
・Proteinase K
・機械的破砕
クロロ
フォルム添加
イソプロパ ノール添加
ペレット 溶解 の洗浄
ホームメイド法
QIAGEN スピンカラム法
核酸の 結合
メンブレンの 洗浄 ペレット化
下層・フェノールのコンタミ
核酸ペレットの紛失
フェノールのコンタミなし
沈殿操作がない
簡単・ペレット紛失なし
RNA 精製
フェノールのコンタミの影響 [Abs]
Wave length (nm)
0.4
0.0 0.0
0.3
220 320 220 320
水にフェノールを添加
[Abs]
260 280 260 280
フェノールがコンタミした
RNA (1/100,000)
精製済み
RNA
Phenol (1/5000)
275
► フェノールがコンタミすることで、ピークがずれる可能性
► フェノールがコンタミすることで実際より RNA 量を多く見積もる可能性
RNA 精製
フェノールのコンタミによる RT-PCR 反応の阻害
フェノール法
RNA中のフェノールに
よる増幅阻害増幅早 増幅遅
RNA量少 RNA
量多ラット 筋肉組織
RNeasy Fibrous Tissue Kitとフェノール法
同一サンプルから同時精製 Allprep シリーズ
mRNA
発現量 を調べたいmicroRNA発現量を
調べたいgDNAの変異
を調べたいタンパク質の発現量 を調べたい
► Allprep シリーズを使用することで同時精製が可能
同一サンプルから同時精製
Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit
同一 サンプルから高収量のDNA、RNA、
miRNA精製
溶解困難なサンプル用に開発
ダウンストリームですぐ使用可能な高品質 核酸
様々なサンプルタイプ用に最適化された プロトコル
フェノール不要の簡便操作
QIAcube対応
リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA精製
逆転写酵素、リアルタイムPCR酵素
リアルタイムPCR試薬
SYBR GreenリアルタイムPCR用Primer
One-Step リアルタイム PCR および Two-Step リアルタイム PCR
簡単なハンドリング
早いプロトコール
高い再現性
コンタミリスクが低い
プライマーの高い自由度
1 回の逆転写から複数の PCR
cDNA での保存可能
Two-Step
One-Step
逆転写反応
リアルタイムPCR
逆転写反応 ＋ リアルタイムPCR
リアルタイム PCR による遺伝子発現解析 の流れ
例）がん細胞特有に多いRNAは、どんなRNAか？
高品質 RNA 定量
効率的な サンプル破砕 正常細胞
がん細胞
サンプルタイプごとに 応じたRNA精製
正確に定量できる リアルタイムPCR がん細胞で多く発現して いる遺伝子を探す
検体
RNA安定化 RNA精製
逆転写 リアルタイム定量PCR
RNA
42℃ 2分間インキュベート（gDNA除去）
Reverse Transcription Buffer, Primer Solution
（Oligo-dT + Random oligomers）
Reverse Transcription Mix 添加混合
42℃ 15分間インキュベート（逆転写）
95℃ 3分間インキュベート
（逆転写反応を不活性化）
リアルタイムPCR反応ミックスへ
cDNAを添加混合
Genome DNA Removal Buffer RNase-Free waterを添加
逆転写酵素： QunatiTect Reverse Transcription Kit
ゲノムDNA除去を含む、迅速で簡便なリアルタイムPCR用逆転写キット
cDNA 合成ステップがたった 20 分！
逆転写酵素： QunatiTect Reverse Transcription Kit 効果的なゲノム DNA 除去
QIAGEN
ゲノムDNA除去なしゲノムDNA除去ステップを行なった場合、逆転写反 応を行なわないコントロール（–RT；緑色のプロッ ト）でゲノムDNAによる増幅が無い
ゲノムDNAの除去を行なわない場合、逆転写反応を 行なわないコントロール（–RT；濃青色のプロット）
でゲノムDNAによる増幅が認められる
100ng トータルRNAを逆転写し、β-アクチンに特異的Primer、QiantiTect SYBR Green PCR Kitを用い検証した。
► 効率よく迅速にゲノム DNA を除去した cDNA 合成
+ RT→ + RT→
- RT ↓
- RT→
本日お話しさせていただく内容
リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA精製
逆転写酵素
SYBR GreenリアルタイムPCR用Primer
リアルタイムPCR試薬
リアルタイム PCR による遺伝子発現解析 の流れ
例）がん細胞特有に多いRNAは、どんなRNAか？
高品質 RNA 定量
効率的な サンプル破砕 正常細胞
がん細胞
サンプルタイプごとに 応じたRNA精製
正確に定量できる リアルタイムPCR がん細胞で多く発現して いる遺伝子を探す
検体
RNA安定化 RNA精製
逆転写 リアルタイム定量PCR
デザイン済 SYBR Green 用 Primer ： QuntiTect Primer Assay
メルト解析およびNo template controlで非特異的な増幅の有無を確認
メルト解析によりPCR
特異性を確認 No template controlよりPCR特異性を確認
► 非特異性増幅を抑えることが結果の妥当性を検討する際に重要
デザイン済 SYBR Green 用 Primer ： QuntiTect Primer Assay
SYBR Green 検出によるリアルタイム PCR 用 Primer デザイン QuantiTect Primer Assays
標的遺伝子の 選択と注文
プライマーミックス の再懸濁
至適化なしに 良好な結果
ホームメード法
標的遺伝子を解析
（例:BLAST検索など）
プライマーデザイン プライマー注文 プライマーの再懸濁
品質管理 アッセイの最適化
最適化／至適化の後で のみ良好な結果
► 即使用可能なゲノムワイドなプライマーセット
デザイン済 SYBR Green 用 Primer ： QuntiTect Primer Assay
QuntiTect Primer Assay
ゲノムワイドなデザイン済プライマーで良好な実験結果
エキソン/ エキソン境界にまたがるデザイン
ほぼ 100% の PCR 効率で信頼できる相対定量
高い感度と特異性
幅広い濃度範囲で正確な定量
SYBR Green 検出で時間と経費を節約
QIAGEN ホームページで簡単に検索、オーダー可能
GeneGlobe 遺伝子研究用ポータルサイト ターゲット遺伝子の検索について
GeneGlobeをクリック
GeneGlobe 遺伝子研究用ポータルサイト
ターゲット遺伝子の検索について
例としてヒトcaps2
を検索遺伝子名や ID を入力
生物種を選択 4
GeneGlobe 遺伝子研究用ポータルサイト
ターゲット遺伝子の検索について
例としてヒトcaps2
を検索製品名をクリック
GeneGlobe 遺伝子研究用ポータルサイト
ターゲット遺伝子の検索について
例としてヒトcaps2
を検索選択したQuantiTect Primerアッセイ 以外にもデザイン済siRNAの情報も
GeneIDやアンプリコンの長さなど
の情報リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA精製
逆転写酵素
SYBR GreenリアルタイムPCR用Primer
リアルタイムPCR試薬
リアルタイム PCR による遺伝子発現解析 の流れ
例）がん細胞特有に多いRNAは、どんなRNAか？
高品質 RNA 定量
効率的な サンプル破砕 正常細胞
がん細胞
サンプルタイプごとに 応じたRNA精製
正確に定量できる リアルタイムPCR がん細胞で多く発現して いる遺伝子を探す
検体
RNA安定化 RNA精製
逆転写 リアルタイム定量PCR
QIAGEN のユニークな PCR Buffer システム
PCR buffer 中の陽イオンの影響
QIAGEN のユニークな PCR Buffer システム
PCR buffer 中の陽イオンの影響
アニーリングの条件検討
QIAGEN M 50 52 54 56 58 60
Supplier A
50 52 54 56 58 60
℃NH4+により、広範なアニーリング温度で特異的な増幅
► は、 の最適化条件検討が不要
QuntiNova シリーズ
QIAGEN の新しいリアルタイム PCR 試薬
色素によるピペッティングコントロール
青いマスターミックスと黄色の希釈液により、ピペッティングの 視覚的確認の確実性と簡便性
新規のホットスタートメカニズム
Taq DNA Polymerase 活性の高い特異性
アンモニウムイオンによる高いアニーリング特異性
ミスマッチ結合を低減し、特異的な増幅
超高速サイクリング
PCR にかける時間を低減
高感度
わずか 1 コピー相当の遺伝子発現の検出
30 ℃で最高 100 時間まで安定
QuntiNova シリーズ
反応液のセットアップの確認を視覚化してミスのない分注
► 視覚的にテンプレートの入れ忘れを防止
マスターミックス：青
テンプレート希釈用 Buffer ：黄色 混合すると 緑色に
QuntiNova SYBR Green PCR データ 幅広いダイナミックレンジ
► 10 µl qPCR 反応で 10 fg までの cDNA の高感度の検出
Hela cDNA 100 ng-10 fg β-actin
QuntiNova SYBR Green PCR
本日お話しさせていただいた内容
リアルタイムPCRの原理
1
2
定量方法リアルタイムPCRで良い結果をだすポイント
3
RNA
精製 SYBR Green
Ⅰ法とTaqMan Probe
法
絶対定量と相対定量
ハウスキーピング遺伝子 RNA安定化
サンプルのホモジナイズ、破砕
サンプルに応じた最適なキットの選択
同一サンプルから同時精製 Allprep DNA/RNA/miRNA Universal Kit本日お話しさせていただいた内容
逆転写酵素
リアルタイムPCR試薬
