Studies on Hydrolytic Enzymes from -the Liver of Neon Flying Squid

学 位 論 文 題 名

博士 （水 産 学） スカ ノレ ノ

Studies on Hydrolytic Enzymes from ‑the Liver of       Neon Flying Squid

（ ア カ イ カ 肝 臓 加 水 分 解 酵 素 の 精 製 と 性 質 ）

学位論文内容の要旨

ア カ イ カ の 肝 膵 臓 （ 以 下 肝 臓 ） は 肝 臓 中 に 含ま れ る 各種 酵素 の活 性が非常に強い．

そのため自己消化 作 用の 進行 が速 く，

アカイカ肝臓の利用には困難が 伴 う．

この た め現状ではその大半が大量に廃棄され ている．   したがって，

もしアカイカの肝臓に含まれ る 各 種 の 有 用 酵 素 を 利 用 す る こ と が 可 能 に な れ ば，

資 源 の 有 効 利 用 や 廃 棄 物 処 理 の 負 担 の 軽 減 に 大 きく 貢献し得る．

本 研 究 で は 有 用 加 水 分 解 酵 素 と し て ア カ イ カの 肝 臓 よ ル リ パ ー ゼ と プ 口 テ ィ ナ ー ゼ を 分 離 す る こ とを 試み，

得られた酵素についてその性質を検討し，

併 せ て 分 離 し た 酵 素 を 用 い て 新 た な る 利 用 法 に っ いて も検討を行った．

アカイカの肝臓をアセトン，   酢酸エチル，   ジエチ ル エ ー テ ル な ど の 有 機 溶 媒 で 脱 脂 処 理 を し て 得 た粗 酵 素 （ 比活 性

）を ，

ふ っ化 フェ ニル メ チ ル ス ル ホ ニ ル で 処 理 後 ，

― セ ル 口 ー ス・ イ オ ン 交 換 ク 口 マ ト グ ラ フ ィ ー （ 比 活 性

    ‑ 888

−

m辷 ） ，   セ フ ァ デ ッ ク ス G― 100ゲ ル 浸 透 ク 口 マ ト グ ラ フ ィ ー （ 比 活 性 1 59.2uni ts/mg） ，   調 製 デ ィ ス ク

電 気 泳 動 法 の 各 精 製 本 酵 素 の 分 子 量 は 約 液 中 で は 活 性 を 有 し で 活 性 を 発 現 す る こ ク チ ナ ー ゼ を 含 ま ず 認 し た ．  さ ら にア ン ト リ プ シ ン ・ イ ン ヒ

・ イ ン ヒ ビ タ ー の 有 差 が み ら れ な か っ た ー ゼ が 混 在 し て い な パ ー ゼ の 活 性 発 現 に で あ っ た ．  こ のり パ は25℃ で あり ，  至 適 る こ と を 認 め た ．     本 リ パー ゼに よ る 種 の 加 水 分 解 の タ イ ラ ン ダ ム 型 で あ り ， 的 に 作 用 す る こ と が     ついで，  アカイカ プ 口 テ ィ ナ ー ゼ ） の プ ラ ス チ ン 合 成 へ の     ア カ イカ 肝臓 の ア 15.56  units/rDg）  と オ ン 交 換 ク 口 マ ト グ

法 を 経 て り パ ー ゼ を 分 離 し た ． 33．000（SDS−PAGE）であり，  水溶 な い こ と ，  乳 化 系 や 逆 ミ セ ル 系 と か ら 本 酵 素 が エ ス テ ラ ー ゼ や り パ ー ゼ の み よ り 成 る こ と を 確 チ パ イ ン ，  ペ プ ス タ チ ン   A， ビ タ ー な ど の 各 種 プ 口 テ ア ー ゼ 無 に よ る 活 性 の 比 較 に よ っ て ， も こ と か ら ，  本 酵 素 中 に プ ロ テ ア いことを確かめ，た．  なお，  本り は コ フ ァ ク タ ー の 共 存 が 不 可 欠 ー ゼ の 至 適pHは 7.0，  至 適 温 度 温 度 の 特 異 性 と し て 低 温 側 に あ 各 種 脂 質 並 び に 個 々 の 脂 質 分 子 ム コ ー ス の 解 析 よ り ，  本 酵 素 は と く に オ レ イ ン 酸 に 対 し て 優 先 判明した・

肝 臓 プ 口 テ ィ ナ ー ゼ （ セ リ ン ・ 基 本 的 性 質 と タ ン パ ク 質 類 似 物 応 用 に つ い て 検 討 し た ．   、 セ 卜 ン 沈 澱 物 を 粗 酵 素 （ 比 活 性 し ，  こ れ をDEAE− セ ル 口 ー ス イ ラ フ ィ ー （ 比 活 性 98． 37units

―889− ・

／

） 及 び セ フ ァ デ ッ ク ス

−

ゲ ル 浸 透 ク 口 マ ト グ ラ フ ィ ー に 供 して プ口 ティ ナー ゼを 精製 した ．

そ の 比 活 性 は

／

で 粗 酵 素 の そ れ と 比 較 し て

倍 の 比 活 性 を 有 し て い た ．

‐

ザ イ モ グ ラ ム に よ る 分 子 量推 定の 結果 ，

本プ 口テ ィナ ーゼ の 分子量は

．

，

加水分解至適

は

であり，  pH

か ら

の 範 囲 で 安 定で あっ た．

至 適温 度は

℃ であ り ，

ま た 温 度 安 定性 も

℃ま で安 定で ある こと を認 めた．   ジチオスレイトール，  L ―システイン，   グルタ チオン，   カルウム，   ナトリウム，   カルシウム，   マグ ネ シ ウ ム ，

ア ン モニ ウム のイ オ ン等 によ って 活性 化 し，

ヨード酢酸，   大豆トリプシンインヒピター，   鉄

（

価） ，

水銀 ，

銀 の各 イオン等によっ て活性が阻 害されることを認めた．

アカイカ肝臓の加 水分解物を濃縮し，

本プロティ ナ ー ゼ を 再 添 加 す るこ とに よル タン バク 質類 似物 の プ ラ ス チ ン を 合 成 し た 結 果 ，

ハ ン タ ー 白 色 度 が

65

の プ ラ ス チ ン を 得る こと がで き た．

時 間の プラ ス チ ン 合 成 反 応 では ，

生 成プ ラ スチ ンの アミ ノ酸 組 成 は ア カ イ カ 肝 臓 タ ン パ ク 質 の そ れ と ほ ば 同 一 で あ っ た が ，

反 応

時間 では りジ ンと トリ プト ファ ンが 減少し，

逆にアスパラギン酸，   グルタミン酸，   アラ ニ ン な ど の ア ミ ノ酸 が増 加し た．

こ のこ とか らア カ イ カ 肝 臓 の プ ロ テ ィ ナ ー ゼ に よ る 反 応 条 件 を 調 節 す

丶

る こ と に よ っ て 栄 養 性 を 考 慮 し た プ ラ ス チ ン を 合 成

できることが示唆された．

以上より，   経費等はかかるが， 廃棄物再利用の視

点から，

アセトン可溶部より得られる脂質はもとよ

り，

本酵素と内臓加水分解物は餌料等の用途に充分

に耐え得えることを認めた．

学 位 論文 審 査 の 要旨

副 査

教 授   羽 田 野 六 男 教 授   関   伸 夫     一

助 教 授  高 橋 是 太郎     学 位 論 文 題 名

Studies on Hydrolytic Enzymes from the Liver of     Neon Flying Squid

（アカ イカ肝臓加 水分解酵素の精製と性質）

  ア カ イ カ の 肝 膵 臓 （ 以 下 肝 臓 ） に 含 ま れ る 各種 酵 素 は 活 性が 非常に 強い．  その ため自 己消化 作用の進 行が速く，  アカイカ肝臓の利用には困難が伴い，  そ の 大 半 が大 量に廃 棄され ている 現状に ある．  本研究 は ，  アカ イカの 肝臓に 含まれ る有用 酵素の りパーゼ と プ ロ テ ィ ナ ー ゼ を 利 用 す る こ と を 目 的 と し て行 つ たものである．

  本 研 究 で は 以 下 の 4点 を 明 ら か に し た ．     （1） アカイ カの肝 臓をアセトン，  酢酸エチル，

ジ エ チ ル エ ー テ ル な ど の 有 機 溶 媒 で 脱 脂 処 理 をし て 得 た 粗 酵素 を，  ふっ化 フェニ ルメチ ルスル ホニルで 処 理 後 ，DEAE一 セ ル ロ ー ス ・ イ オ ン 交 換 ク ロ マト グ ラ フ ィ ー ，  セ フ ァ デ ッ ク スG−100ゲ ル 浸 透 クロ マ ト グ ラ フィ ー，  調製デ ィスク 電気泳 動法の 各精製法 を経てりパーゼを分離，  精製した．  本酵素の分子量 は約33，000（SDS−PAGE）であり，  水溶液中では活性を 有 し な いこ と，  乳化系 や逆ミ セル系 で活性 を発現す る こ と か ら 本 酵 素 が エ ス テ ラ ー ゼ や ク チ ナ ー ゼを 含 ま ず り パー ゼのみ より成 ること を確認 した．  さらに ア ンチパイ ン，  ペプス タチン  A，  トリプシン・イ ン ヒ ビ タ ー な ど の 各 種 プ 口 テ ア ー ゼ ・ イ ン ヒ ビタ ー の 有 無 に よ る 活 性 の 比 較 に よ っ て も 差 が み ら れな か ったことから，  本酵，素中にプロテアーゼが混在して い な い こ と を 確 か め た ．  こ の ル パ ー ゼ の 至 適pHは 7.0， 至 適 温 度 は25℃ で あ り ， 至 適 温 度 の 特 異 性 と して低温側にあることを認めた．  なお，  本リパーゼ の 活 性 発 現 に は コ フ ァ ク タ ー の 共 存 が 不 可 欠 であ つ た．

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査 査

主 副

の そ れ と 比 較 し て55倍 の 比 活 性 を 有 し て い た ．SDS ーPAGEザイ モ グ ラムに よる分 子量推 定の結 果，  本プ ロ ティナー ゼの分 子量は24，000，  加水分解至適pHは 5.0であり ，  pH4から7の範囲 で安定であった．  至適 温 度 は37℃ で あ り，  また温 度安定 性も37℃まで 安定 であることを認めた．  ジチオスレイトール，  L―シス テイン，  グルタチオン，  カリウム，  ナトルウム，  カ ルシウム，  マグネシウム，  アンモニウムの各イオン によっで活性化し，  ヨード酢酸，  大豆トリプシンイ ンヒビター，  鉄（2価），  水銀，  銀の・各イオンによ って活性が阻害されることを認めた．

    （4） アカイ カ肝臓 の加水 分解物を濃縮し，  本プ ロ テ ィ ナ ー ゼ を 再 添 加 す る こ と に よ り タ ン パ ク 質 類 似 物 の プラ ス チ ンを合 成した 結果，  ハン ター白 色度 が58←65の プ ラ スチン を得る ことが できた ．  こ のプ ラ ス チ ンの ア ミ ノ酸組 成を検 討した 結果，  アカ イカ 肝 臓 の プ ロ テ ィ ナ ー ゼ に よ る 反 応 条 件 を 調 節 す る こ と に よ っ て 栄 養 性 を 考 慮 し た プ ラ ス チ ン を 合 成 で き ることが示唆された．  以上より，  経費等はかかるが，

廃 棄 物 再利 用 の 視点か ら，  アセト ン可溶 部より 得ら れ る 脂 質は も と より，  本酵 素と内 臓加水 分解物 は餌 料 等 の 用 途 に 充 分 に 耐 え 得 え る 、 こ と を 認 め た ．

―‑ 893―

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