博 士 （ 理 学 ） 引間
学 位 論 文 題 名
Study of Electrochemical Assay with Enzymatic Reaction
（酸素反応を用いる電気化学的分析法の開発に関する研究）
学位論文内容の要旨
微分 バル ス ポー ラロ グ ラフ イ― （DPP） は， ボ ル タン メト リ ーの 一種であり， 溶 液に浸 し た水 銀滴 下 電極 の電 位 を連 統的 に 変化 させ ， 電極 に流 れ る電 流値 を 電位 の関 数 とし て言 己 録 し（ ポー ラ ログ ラム ） ，電 流の 流 れる 電位 か ら定 性， 電 流値 から 定 量を 行う こ との でき る 分 析法 であ る ． DPPは ， 金 属な ど の無 機物 ば かり でな く ， 医薬 品 のよ うな 有 機物 に対 し て も． その 定 量や 電気 化 学的 性質 の 研究 が行 わ れ， 化学 工 業等 の実 用 分析 にも 応 用さ れた ． し か し ，DPPで 測 定 不 可 能 な 物 質 も 多 く ， こ れ ら を 検 出 す る た め に 酵素 反 応と 組み 合 わ せた定量法 はほとんどない．
ま た ， 酵 素 セ ン サ ー は ， 電 極 上 に 固 定 し た酵 素が 被 分析 物の 変 換反 応を 触 媒す る際 に 消 費 ， また は ，生 成す る 化学 種を 検 出し て被 分析物 の定量を行うもの である， 酵素セ ンサー は ，酵 素反 応 の特 異性 に よっ て選 択 性が 高く ， 操作 が簡 便 であ るこ と が特 徴で あ る， し か し ， それらの ほとんどは，酵素 反応によって消費， または，生成す る酸素， 過酸化 水素，
補 酵素のどれか を検出するもので あり， また，検出 電位を負電位に設 定するものは少ナ ょい．
そこ で本 研 究で は， 第1に ， 特異 的 な酵 素反 応 と高 感度 な 微分 パルスポ―ラログ ラフィ ー を 組 み 合 わ せ た 有 機 酸 の 定 量 法 の 開 発 を 試み た． そし て第2に， 酵 素ー ポー ラ ログ ラ7 定 量 法 の 原 理 を 応 用 し た ， 新 し い 型 の 酵 素 セン サー の 開発 を検 討 した ．対 象 とす る有 機 酸 と して は， 臨 床分 析， 食 品分 析に お いて 重要 で ， ポー ラ ログ ぅフ ィ ーに よっ て 酸化 還元 電 流を測定す ることができない ， クエン酸とL―乳酸を選 んだ．
本論文は ， 7章からなる， 第1章は， 序論であり， ポ―うログうフイ―， および， 酵素 センサーの 簡単な歴史と特徴 を示し， 本研究 の目的を述べた．
第2章 では ， 溶 存酵 素と微分 パルスポーラログラ フイーを組み合わ せた， クエン酸 ， ま たは，L一乳酸の定量法の開発にっいて検討した， それらの原理は， クエン酸， または， L一 乳 酸 を 含 む 試 料 に ， ク エ ン 酸 リ ァ ← ゼ （CL） 十 オ キ サ ロ 酢 酸 デ カ ル ボキ シラ ー ゼ（OAD C）， ま たは ， 乳 酸オ キシ ダ ーゼ （LO） を加 えて 一 定時 間変 換 反応 させ， 生成した ピルピ ン 酸 をDPPに よ っ て 検 出 す る 単 純 な も の で あ る ， こ れ ら の 方 法 は ， 試 料 量 が50ロ1以 下 と少なくて済 み， また，操作 も迅速， 簡便であ る， さらに，本 法は酵素の特異性 によっ
て 高 選 択 的 で あ り ， 電 解 反 応に 基 づくDPPを 用い る こと によ り 高感 度で あ る． こ れ らの 方 法 の 検 出 限 界 は 共 に 酵 素 反 応 溶 液 中 で 約0，3ロmol/lで あっ た． また ， DPP測 定 時の 妨害 とな る ， タンパ タ質（酵素），また は，過酸化水素の 除去法にっいても 検討した， さら に． セッコウ ， スポーツドリン ク中のクエン酸， または， 乳製品中のLー乳酸の定量に応用 し、良好な結果 が得られた，
第3章 では ， 第2章の 応用 と して ， 微 分パ ルス ポ ーラ ログ ラ フイ ーに よ る酵 素（ ク エン 酸リ ア― ゼ ， 乳酸オ キシダーゼ）活性， および，速度論 的定数（ミカエリ ス定数）の測定法 の開 発に っ いて述べた ， これらは， 過 剰量の基質存在下 で反応速度を測定 するものである．
こ れ ま で ， 酵 素 活 性 の 測 定 は 主 に 吸 光 光 度 法 で 行 わ れて きた が ，本 研究 に おい て微 分 パル スポ ―う 口 グラ フィ ― によ る， より 高感 度 ， 高精 度な 優れた測定法を開 発することができ た ． ま た， 少量 の 酵素 を用 い て， 酵素 の 定量 や酵 素 反応 の速 度 論的 取り 扱 いを 簡便 迅 速に 行 う こ と が 司 能 と な っ た ． 得 ら れ た 値 を 文 献 値 と 比 較 し た 結 果 は 良 好 で あ っ た ． ＿ 第4章 で は ， 酵 素 の 反 復 有 効利 用と 操 作の 簡易 ， 迅速 化の た めに ，酵 素 を固 定化 し てり アク ター を 作製 し， クエ ン酸 ， または，L―乳酸の微分 パルスポーうログ ぅフ定量法への応 用に っい て 検討 した ， こ れら は 固定 化酵 素 をカ ラム に詰 めてりアクターと し， これに試料 溶 液 を 通 し て 変 換 し ，DPPで 測 定 す る も の で あ る ， 第1に， これ まで に 例の ない ク エン 酸 リ ア ー ゼ の ポ リ ァ ク リ ル ア ミド ゲ ル中 への 包 括固 定化 を 試み た． リア クタ ー は6日 間安 定で あっ た ． 第2章1ごお ける 溶 存の クエ ン 酸リ アー ゼを 用いぁ定量法に比 べて， 除タンパ ク 操 作 が 不 要 と な っ た た め に 操 作 が 簡 便 と な っ た こ と と ，CL， OADCの2つ 酵 素 を 初 めて 固定 化 し， こ れ らの 反復 利 用が 可能 と なっ たこ と から 有用 な 定量 法で ある， 第2に，
固 定 化 担 体 と し て 用 い ら れ た 例 の 少 な い キ ト パ ー ル への 乳酸 オ キシ ダー ゼ の共 有結 合 固定 化を 行っ た ． この 固 定化 酵素 リ アク ター は40月 以上 も 使用 可能 で あっ た． さらに ， 第3 章の 酵素 活 性測 定法 を 用い て酵 素 固定 化率 を 求め るこ とも 可能であった． また， この固定 化酵素リアクタ ―によって， さら に迅速， かつ， 簡便なL一乳酸定量法を開 発することがで きた ． こ れら の検 出 限界 は， リアクターに注 入する試料中で共に 約O，6皿mol/lであった，
これらの方法を ， ワイソ中のクエ ン酸， または， 動物血清中のL一乳酸の定量 に応用し， そ の有用性を確か めた．
第5章では， さらに ， 簡便性を高め るために， キトパ ールを用いる固定 化乳酸オキシダ ー ゼ リ ア ク タ ー と 静 止 水 銀 滴 亀極 を 用い るポ ー ラロ グラ フ 的な 還元 電 流検 出器 に よるL―乳 酸 の フ ロ ーイ ンジ ェ クシ ョン 分 析装 置を 作 製し た， 測定 の妨 害 とな る試 料 中の 溶存 酸 素は ODS― カ ラム に よっ て分 離 され ， 10試料/時間 の測 定 が可 能で あ る． ま た ， 酵素 リ アク タ ― は ， 10月 間 の 反 復 使 用 が 可 能 で あ っ た ．200皿mol/lのLー 乳 酸 に 対 す る 相対 標 準偏 差 は2．8％ ， 検 出 限 界 は 注 入 試 料 中 で99皿mol/lで あ っ た ， 本 装 置 の 感 度 は 従 来 の 吸 光 光 度 検 出 器 を 用 い る も の よ り100倍 ほ ど 高 く ， ま た ， 他 の 電 気 化 学 検 出 器 に 比べ て アス コ ルビ ン 酸な どの 酸 化性 物質 に 妨害 され な いな どの 利点 がある， 本装置 を用いてヒト血清
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中のL一乳酸の定量に応用し，良い結果が得られた，
第6章では， より汎用性の高い定量法として，酵素―ポーラログラフ定量法の原理を応 用するなどの， これまでにない新しい原理による酵素センサ―を作製した． 第1に， 水銀 薄膜電極を用いる酵素センサーの開発を検討した． このセンサーは， 酵素ーポーラログラ フ定量法と同様に， 酵素反応による生成物， ピルビン酸の還元電流を測定するものであり，
上述 のDPPを 用い る 方法よ り簡便である． その定量範 囲は05−3．Ommol/lで， 1．O mmol/lのクエン酸に 対する相対標準偏差は4，8％ であった． 第2に，特異的な酵素反応 とキトサン膜の酸素に対する透過選択性を利用して選択性の高いL一乳酸センサ―を開発し た． その原理は， L oによる変換反応の際に消費される酸素を検出するものである． この センサーは， 一般に酵素の阻害剤である水銀の薄膜電極を用いても， 長期に渡って（28日 間）安定であった， 定量範囲は10．O−300皿mol/l，50ロmol/lのLー乳酸に対する相対標準 偏差は14Xで， 検出 限界は試料注人後の電解セ ル中で6．4肛mol/lであった ， また，
キトサン膜の酸素に対する透過選択性を実験的に確かめた． さらに， このセンサーを用い てヒト血清中のLー乳酸の定量を行い， その有用性を確かめた． 第3に， 微分パルスアンペ ロメトリ ク検出法を用いて高感度なL一乳酸セソサ―を開発した． このセンサ―は， 酵素 反応の特異性と微分パルス法の選択性によって高選択的なセンサーである， その原理は，
乳酸デヒド口ゲナーゼによって消費されるNAD゛（酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレ オチド）の還元電流を測定するものである、定量範囲は0．05―05 mmol/lで，0．25 mmol/l のLー乳酸に対する相対標準偏差は5．OXであった． また，NAD゛透過性の酵素固定化膜 の選択にっいても検討した．
第7章では， 本研究によって得られた成果を総括した．
学位論文審査の要旨 主査
副査 副査 副査
授 長谷部 授多賀 授 魚 崎 授 中 村
光 浩
学 位 論 文 題 名
St udy of Elec trochemical Assay Nith Enzymatic Reaction
（酵 素反 応 を用 いる 電気 化学 的 分析法の開発に関する研究 ）
申 請者 は， 高 感 度か つ高 選択 的な 定 量法 とし て， 酵 素反 応を 用い る電 気 化学 的分 析法 の開 発を 試み て いる ， この 中で ， 溶存酵素または固定化 酵素による変換反応後 に， 微 分パ ルス ポ ーラ ログ ラフ イ− ［DPP］ に よっ て測 定する 方法と， このポーラ ロ グ ラ フ 定 量 法 の 原 理 を 応 用 し た 新 し い 型 の 酵 素 セ ンサ ーの 開 発を 検射 して いる ． これ らの 方法 によ っ て， 食 品お よび 生 体試 料中 のク エ ン酸とL―乳酸の高感度かっ高 選択的な定量法を開発し， 良好な結果を得ている．
本論文は， 7章からなる， 第1章は， 序論であり， ポ―ラログラフイ−， および｜
酵 素 セ ン サ ー の 簡 単 な 歴 史 と 特 徴 を 示 し ， 本 研 究 の 目 的 を 述 べ て い る ． 第2章 で は ， 溶 存 酵 素 とDPPを 組 み 合 わ せ た ク エ ン 酸 ま た はL― 乳 酸 の 定 量法 の 開発 にっ いて 検討 し てい る． そ れら の原理は， 試料に酵素を 加えて一定時間変換反 応 さ せ ， 生 成 し た ピ ル ビン 酸をDPPによ って 検 出す る単 純な も ので ある が， 用 い る試 料量 が少 なく ， 吸 光光 度法 より も操作が迅速， 簡便で， かっ高感度である．
第3章 で は ， 第2章 の 応 用 と し て ，DPPに よ る 酵 素 活 性 の 測 定 法 の 開 発 に っ い て述 べて いる ． こ れら は， 過 剰量 の基質存在下で反応速度を 剛定するものである．
これ まで の酵 素活 性 の測 定は 主に 吸光 光 度法 で行 われ て きた が， 本 研究 に よっ て，
用 い る 酵 素 が 少 量 でDPPに よ っ て よ り 高 感 度 か っ 高 精 度 な 優 れ た 測 定 法 が 開 発 さ れ， 改善がみられている．
第4章で は ， 酵素の反復有効利用と 操作の簡易， 迅速化のた めに， 酵素を固定化 し て り ア ク タ ー を 作 製 し ， ク エ ン 酸 ま た はLー 乳酸 のDPP定 量 法へ の応 用に っい て
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