千葉大・病院・疾患プロテオミクス研究部門 4医薬基盤研・プロテオームリサーチプロジェクト 5千葉大・医・先端応用外科 6千葉大・院医・分子病態解析学 （受付 20010 年 8 月 19 日，受理 2010 年 11 月 1 日） SUMMARY
There is substantial interest in applying disease proteomics to the identification of diagnostic markers. However, a 2-DE with immobilized pH gradients is not particularly suitable in analyzing high-molecular-mass (HMM) proteins larger than 100 kDa. A 2-DE with agarose IEF gels in the first dimension (agarose 2-DE), which is suffi-ciently good at separating HMM proteins as large as 600 kDa, has been used for separation of proteins from human primary colorectal cancer, esophageal squamous cell carcinoma and hepatocellular carcinoma. We could find and identify many diagnostic marker candidates in these cancer tissues with LC-MS/MS. Interestingly, a 195-kDa HMM protein, periplakin, was significantly downregulated in esophageal cancer. In hepatocellular carcinoma, a 190-kDa HMM protein, clathrin heavy chain (CHC), was significantly upregulated. These results suggest that the agar-ose 2-DE based proteomics is a useful strategy for finding new diagnostic markers with HMM.
Key words: disease proteomics, agarose 2-DE, high-molecular-mass proteins, cancer
はじめに 疾患診断用マーカー探索のツールとしてのプロテオーム 解析では，主に二次元電気泳動法や質量分析法が用いられ てきた．しかし，いずれの方法を用いた場合でも，高分子 量蛋白質や塩基性蛋白質，疎水性蛋白質などの解析は困難 である． 我々の研究グループは，従来の方法では解析が困難であっ た分子量 10 万～ 60 万程度の高分子蛋白質も含めて解析可 能なプロテオーム解析法を確立し，これまでにさまざまな 疾患診断用マーカーを探索してきた．本論文では，北里大 学と千葉大学との共同研究によって行ってきた，大腸癌， 食道扁平上皮癌，および肝細胞癌の疾患診断用マーカー蛋 白質探索の事例について報告する． 方 法 高分子量蛋白質の解析には，一次元目の等電点電気泳動 法にアガロースゲルを用いた二次元電気泳動（アガロース 2-DE）法1, 2）が強力なツールとなる．本法の特長は，（1） 分子量 100 kDa–600 kDa の高分子量蛋白質が解析可能で，
The search for disease diagnostic markers of high-molecular-mass proteins
Masamichi Oh-Ishi1, Yoshio Kodera1,2,3, Tadakazu Maeda1,2, Takeshi Tomonaga3,4, Takanori Nishimori5, Masanori Seimiya6, Kazuyuki Matsushita6, Fumio Nomura3,6
1Laboratory of Biomolecular Dynamics, Department of Physics, Kitasato University School of Science; 2Center for Disease Proteom-ics, Kitasato University School of Science; 3Clinical Proteomics Research Center, Chiba University Hospital; 4Laboratory of Proteome Research, National Institute of Biomedical Innovation; 5Department of Academic Surgery, Graduate School of Medicine, Chiba Uni-versity; and 6Laboratory of Molecular Diagnosis, Graduate School of Medicine, Chiba University
* Corresponding author: Masamichi Oh-Ishi; Laboratory of Biomolecular Dynamics, Kitasato University School of Science,1-15-1 Kitasato, Minami-ku, Sagamihara, Kanagawa 252-0373, Japan
Fax: 042-778-9541
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（2）一度に最大 20 mg もの蛋白量を解析可能なため MS へ の負担が少ない，（3）ほぼすべての細胞・組織の粗抽出物 が解析可能であることなどが挙げられる．Fig. 1 にアガロー ス 2-DE 法と固定化 pH 勾配を用いた二次元電気泳動法（IPG 法）とのパターンの比較を載せた．アガロース 2-DE パター ンは IPG 法のパターンに比べて，特に分子量 200 kDa 以上 の高分子量蛋白質がよく解析できていることがわかる．そ れと同時に，ほとんどの蛋白質成分が中央（pH 4–7）付近 に集中している．これは，アガロース 2-DE では，高濃度 の尿素・チオ尿素で変性した蛋白質でも複合体またはアグ リゲートを形成し，その等電点が中性付近に偏るからと考 えられる．一次元目のアガロース等電点電気泳動において， 複合体やアグリゲートのままポアサイズの大きいアガロー ス IEF ゲルに入り，二次元目 SDS-PAGE では，各蛋白質は SDSサンプルバッファー中の 5％2-mercaptoethanol および 2％SDS 存在下でモノマーに解離してゲルに入るからである． なお，また，我々はアガロース 2-DE 法から得られた蛋 白質をゲル内消化しイオントラップ型質量分析計（MS）で 解析する手法3）を確立した．Fig. 2 に我々の疾患プロテ オーム解析のストラテジーを載せた．クーマジー染色を行っ たアガロース 2-DE ゲルからスポットを切り出し，トリプ シン消化後，得られたペプチド断片を Shiseido 社 Nanospace SI-2液体カラムクロマトグラフィー（HPLC）で分離後，自 動的に Thermofisher 社の LCQDECAに導入して，ペプチド 断片の MS および MS/MS を行い，そのマススペクトルを SEQUEST検索にかけて，蛋白質を同定した． さらに，癌部と非癌部に含まれる蛋白質成分を定量的に 解析を行うため，アガロース 2-DE 法と二次元蛍光ディファ レンスゲル電気泳動（2D-DIGE）法との組み合わせ4）に よって，各スポットの定量的な比較を行った．
Fig. 1. Comparison of IPG-Dalt and agarose two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). Tissues used are rat duodenum. (A) A 2-DE gel with immobilized pH gradients (IPGs) in the first dimension; (B) a 2-DE gel with agarose gels in the first dimension. Proteins loaded on an agarose isoelectric focusing gel and an IPG gel were 740µg. Note that spot densities are different in the high-molecular-mass regions. A=actin; MHC=myosin heavy chain. The gels were stained with PhastGel Blue R.
Nで蛋白質成分が大きく異なっていた．107 個のスポット のうち 97 個のスポットに N と T の間に発現量の変化が見 られたが，そのうち 49 スポット（42 種類の蛋白質）に顕 著な発現量の差が認められた．それらの中で，eukaryotic translation initiation factor 4H（eIF-4H）（Fig. 3 のスポット 番号 T22），inorganic pyrophosphatase（T6），anterior gradient
らかになった．
分子量 100 kDa 以上の高分子量領域では，T で激減する スポット（N1）が検出され，smooth muscle myosin heavy chain 11 isoform SM1と同定された．T では N に比べ actin の減少は見られないのに平滑筋特異的 myosin だけが顕著 に減少していたことから，筋肉蛋白質のストイキオメトリー
Fig. 3. Coomassie-stained agarose 2-DE pattern of proteins of human primary colon cancer (A) and normal adjacent mucosa (B). Total protein homogenates were prepared from matched samples of tumor or adjacent normal tissue. 500µg of protein was applied to the agarose 2-DE follwed by staining with PhastGel Blue R. Spots, T1–T30 and N1–N6, are proteins whose expression are elevated in tumor tissue or normal mucosa, respectively.
のアンバランスが示唆された． （2）食道扁平上皮癌プロテオーム解析：多重蛍光標識ア ガロースゲル二次元電気泳動法（agarose 2D-DIGE）を用い てヒト食道扁平上皮癌のプロテオミクス解析を行った．手 術標本 12 例より蛋白質を抽出し，agarose 2D-DIGE により Tと N の蛋白質発現を比較し，T と N との間で増減が認め られた 74 個のスポットから MS を用いて 33 種類の蛋白質 を同定した．それらの中で，細胞間接着因子である約 200 kDa の高分子量蛋白質 periplakin が T において有意に発現低下 していた．免疫組織化学染色を行った結果，periplakin は， Nでは細胞膜が強く染まったが，初期癌では細胞質全体に 広がり，進行癌ではほとんど検出されなかった． （3）肝細胞癌（HCC）のプロテオーム解析：アガロース 2D-DIGE法によって 10 例の T と N を比較したところ，127 個のスポットに有意差が確認された．このうち癌部優位が 48個，非癌部優位が 79 個であり，83 種類の蛋白質が同定 できた．この中には代謝，細胞骨格，細胞接着，細胞周期 に関連する蛋白質などが含まれていた．これらの蛋白質の
Fig. 4. An advantage of agarose 2DE-based proteomics.
The agarose 2-DE based proteomics is preferable to shotgun proteomics when HMM-protein isoforms are to be analyzed because disease-specific isoforms, due to alternative splicing and/or post-translational modifications, can be analyzed as intact molecules on an agarose 2-DE map. P, phosphorylation; CHO, protein carbonyls.
Table 1. HMM proteins (>100 kDa) separated by agarose 2-DE. Experimental molecular mass (MM) and pI were obtained from the protein position on 2-DE gels. Theoretical molecular mass (MM) and pI were calculated by amino-acid sequence. Protein identification was made by database comparison with a “non-redundant” human database (NCBInr; National Center for Biotechnology Information, Bethesda,MD).
Tissue
Database Accession Number Protein Name Experimental MM Da/pI
Theoretical MM Da/pI Human Esophageal cancer
gi-14195005 Periplakin 190,000/5.2 204,506/5.33 gi-24657579 Vinculin 130,000/5.4 116,645/5.75 gi-625305 Myosin heavy chain nonmuscle form A 130,000/4.8 226,582/5.41 gi-15149461 Caldesmon 1 isoform 1 120,000/5.5 93,176/5.5
gi-13124879 200,000/4.9 227,179/5.29
Smooth muscle myosin heavy chain 11 isoform SM1 Human colorectal cancer
gi-13124879
Smooth muscle myosin heavy chain 11 isoform SM1 200,000/4.9 227,179/5.29 Human hepatocellular carcinoma
gi-2506872 Fibronectin precursor 260,000/5.0 252,686/5.46 gi-4758012 Clathrin heavy chain 1 190,000/5.6 191,595/5.48 gi-19913410 Major vault protein 100,000/5.2 99,248/5.34 gi-2804273 Alpha-actinin 4 100,000/5.2 102,250/5.27 gi-4557385 Complement component 3 precursor 190,000/7.4 187,027/6.02 gi-24657579 VCL protein (VINCULIN) 120,000/6.0 116,718/5.50 gi-1709947 Pyruvate carboxylase, mitochondrial precursor 130,000/6.5 129,533/6.37 gi-4938304 Lysine-ketoglutarate reductase 100,000/6.2 102,064/6.18 gi-8659555 Aconitase 1 100,000/6.6 98,318/6.23
ン複合体のストイキオメトリーに異常を生じている可能性 が示唆された． 考 察 アガロース 2-DE と MS を組み合わせることで，大腸癌， 食道扁平上皮癌および肝細胞癌において，高分子量蛋白質 を含む癌マーカー蛋白質の探索および同定に成功した． Table 1に，アガロース 2-DE 法を用いて解析された，みか けの分子量 100 kDa 以上の高分子量蛋白質を示す．以前， 我々の研究グループは前立腺癌細胞 LN-CaP のプロテオー ム解析を行ったことがある7）が，分子量 80 kDa 以上の同 定したスポットの 100 個のうち約半分が転写因子や翻訳因 子であった．癌では遺伝子の発現異常や選択的スプライシ ング異状が頻繁に報告されており，癌における転写・翻訳 関連因子の発見は，癌研究に大きく貢献することが期待さ れる． また，2D-DIGE 法は，アガロース 2-DE 法へも応用が可 能で，発現量の差を迅速に見極め，かつ統計処理を行う際 に有効であることが明らかになった． Fig. 4に示すように，近年は組織の粗抽出物を直接，ト リプシン消化し，そのペプチド混合物から各蛋白質成分を 同定・定量するショットガン・プロテオミクスが大規模に 行われるようになった．我々は，大腸癌のプロテオーム解 析で，annexin A2, calreticulin, triosephosphate isomerase 1 お よび vinculin のスポットが癌部と非癌部とで，アガロース 2-DEパターン上で等電点と分子量が全く異なる位置に出現 することを観察した．これらの多くは，mRNA の癌特異的 選択的スプライシング異常に伴う蛋白質アイソフォームの 出現，あるいは翻訳後修飾の異常を示すものと考えられる． このような発見は，最初にトリプシン消化を行うショット ガン・プロテオミクスではまず不可能である．このことか ら二次元電気泳動法を基盤とするプロテオミクスでは，臓
SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; 2D-DIGE, two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis
文 献
1) Oh-Ishi M, Satoh M, Maeda T. Preparative two-dimenstional gel electrophoresis with agarose gels in the first dimension for high molecular mass proteins. Electrophoresis. 2000;21: 1653–1669.
2) Oh-Ishi M, Maeda T. Separation techniques for high-molecular-mass proteins. J Chromatogr B. 2002;771:49–66.
3) Satoh M, Haruta-Sato E, Omori A, Oh-Ishi M, Kodera Y, Furudate S-I, Maeda T. Effect of thyroxine on abnormal pan-creatic proteomes of the hypothyroid rdw rat. Proteomics. 2005;5:1113–1124.
4) Nishimori T, Tomonaga T, Matsushita K, Oh-Ishi M, Kodera Y, Maeda T, Nomura F, Matsubara H, Shimada H, Ochiai T. Proteomic analysis of primary esophageal squamous cell car-cinoma reveals downregulation of a cell adhesion protein, periplakin. Proteomics. 2006;6:1011–1018.
5) Tomonaga T, Matsushita K, Yamaguchi S, Oh-Ishi M, Kodera Y, Maeda T, Shimada H, Ochiai T, Nomura F. Identification of altered protein expression and post-translational modifica-tions in primary colorectal cancer by using agarose two-dimensional gel electrophoresis. Clin Cancer Res. 2004;10: 2007–2014.
6) Seimiya M, Tomonaga T, Matsushita K, Sunaga M, Oh-Ishi M, Kodera Y, Maeda T, Takanao S, Togawa A, Yoshitomi H, Otsuka M, Yamamoto M, Nakano M, Miyazaki M, Nomura F. Identification of novel immunohistochemical tumor markers for primary hepatocellular carcinoma; clathrin heavy chain and formiminotransferase cyclodeaminase. Hepatology. 2008; 48:519–530.
7) Kuruma H, Egawa S, Oh-Ishi M, Kodera Y, Satoh M, Chen W, Okusa H, Matsumoto K, Maeda T, Baba S. High molecular mass proteome of androgen-independent prostate cancer. Proteomics. 2005;5:1097–1112.
