I n t e r n a t i o n a
l J o u r n a l o f H e m a t o l o g y P
o t e n t i a
l o e l o r a f d e t a v i t c r o t c a f I I I V ) a l l l V F ( F n i e u s s i t / a l l V t e n n d e p e - d o r c t f a F X a g
e n e r a t i o
n i n n o i i t a i t i n p h a s e b f o o o d l n i o t a u l g a c o
Order of Authors Secondary :oniatmorfIn
I Question
- - M a n u s c r i p
t - - t f a r D
K e i j
i Nogami , M ..D.Ph.,D Nara Medical Uni verytis K
a
shihara , JAPAN
K e i j i Nogami
K e n i c h i Ogiwara
M i d o r i Shima
F a c t o
r eusist/iaIV rotcfa Flla/T(FV ) iitna ti bes lood ionlataguco by promoting FXa g
e n e r a t i o
n snirtxe( i-Xa)c . Subsequent genera noit of r itni c FX a (isn aX-cisnirtni ) ampl ie s if thrombin r mofn.tioa Preousvi u dtses si uggested taht FVlla/T F astevaict FVlll r
a p i d l
y inimm edia te coagu ltiao『ト,sniotcare and FVlla/TF /FX a act it eav s FlllV roirp ot t
h r o m b i
n -dependent feedback. We ideatgtiesvn alVlF/lllVF /TF/FXa relhnstioa ips in e
ar l cyoag ua tlo n i mechan isms . Tota l FXa generated by FVlla/TF and FF-la/TVl a
c t i v a t e
d lllVF (FVl)FT/allVall was 22.6±1 . nM (7 m1 in ) t;a l to FXa wthi aVllF inhb iirot 3
.
4 士0.7 nM; whe reas FXa gene rated by Fla/TFVl o r FVlllf
「
Fwas 10.4±1 .1 or 0.74±0.14 nM, res peylevitc 町elttiL
×
a w as generated by FVl alle,onl gsuggestin thati n t r i n s i c - X
a mec hanisms were mediated by FlallV Vla /l TF and FVlFT/ll tni ihe niitait o n- phase . lt rninsic-X a was delayed some what by von Wbllei rand frocta (VWF) . FVlll
by FX a wi Fht Vlla/TF was comparab le t aovict atnoi with Gl- Guly-Arg - i
n a c t i
v atedFVl- la/TF. TF cout en 『a ctd te he itibihn ory 巴ffe cts of VWF on FXa-indu ced F
V l l
l ct iavatnoi med iated by Arg372 cleavage . The FVll -Cl 2 doma i bnound ot c
ytmicoplas doma in dtedele TF (TF1 243 ), and VWF blocke d this bngdiin by >80 %, i
n d i c a t i n
g an olapver between VWF- and TF1 同bi43-2 「gindi sie(s) t on C2. Ollrave , these d
a t a
suggest hat t FV I I卜assoc atied itrin nsci司Xa, governed by both FaVll /ndTF-i uced and FXa- idu cn ed FlllV i vtcai o ta n med iated by FllV 卜TF it enrac tios, tn oge the w ir ht F
V l
l a-depe ndent extrs ini c回Xa mecha nisms, may be cenr a t l to the iitin atn -oi phas e of coagultiao n .
D ear R eviewer
Thank you very muc h yrof our response.
Response
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! I f
te fhtsri author nsit a mo ember of the ts! riF author :Sho ko Furukawa
!Japane 凶 ico叫 州ematolo 叫 USO 判tySocie mem 阿 number:6002714
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E n t e
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Pow er＇巴dby Edt oilari M anagerR and ProduX Moni anag er⑧from Arie s Syst 巴＇m sCorpora tion
M a n u s c r i p t
1234567890123
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7890123456789nu
－ －
2 3456789012345
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01
23456789012345 1111
111
1
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112？ 二 ノ
－
222222233333333334444444444
4555555
55 55666666
C l i c
k t e r e h v o l w i e d e k n i s c e e n e r e f R
主P o t e n t i a
l o e l o r f a e d v a t t i c r t o f a c V I I I ( F V I I I a ) F n i i s s u e I I a / t V f a c t o r - d e p e n d e n t F X a g
e n e r a t i o
n i n i n o i t a i t i n p h a s e o f b l o o d u l a t i o n c o a g
S h o k o F u r u k a w a , K e 祖 iN o g a m i , n i c h i K e O g i w a r a
，恥i r o d i l ' S h i m a
F r o m t D e h n t r t m e e p a , s o f P c i r t a i d e N a r a M a l d i c e U , y
凶t i s r e v , a r a h i h s a K N a r a 6 , 2 5 2 8 - 3 4 n a a p J
R u n n i n g : e l t i t V I I a / T F F / I I V I F
開n t d e e n e p d F X a g n o i t a r e n e
T y p e s f m o p t : r i u s c a n l a n i g i r O e l c i t r a
G r a n t : t o r p u p s i s h T w o r k w a s p y l t r a d e t r o p u p s b y a G d i - A n i - t n a r S r o f c i f i t n e i c h r c e a R e s ( K A K E N H I ) f r o m t M e h y r t s i n i o f E , n o i t a c u d , e r u t l u C , s t r o p S e c e n i c S a n d T o l o g e c h n y ( M E X T ) o t KN ( 1 5 K 0 9 6 6 3 a n d 1 8 K 0 7 8 8 5 ) a n d b y a d a n g r o f B a y e r l a i c e p S t c e j o r P A w a r d s ( K N )
S t a t e m e n
t p f o : n o i t a t n e s e r A n a t n o u c c o f t s i h w o r k w a s p d e t n e s e r t t a 5 e h h t 6 F n S a ( , o c s i c n a r CA, 2
0 1 4
) a n d a t t 5 e h h 1 8 n S a ( , o g i e D CA, 6 ) 0 1 2 l a u n n a me t i e s g n t o f A e h m e r i c a n y t e i c o S o f H
e m a t o l o g y .
W o r d c : t n u o S u m m a r y , 6 9 1 t 4 x T e 5 0 , 9 F
i g u r
e e l / b a t : t n u o c e r u g i F T , 6 e l b a S , 1 a l t e n e m p l u p 2 a t a d P , s g e a R , 2 2 c e n r e f e e ; t n u o c 3 9
C o r r e s p o n d i n g : s r h o t u a K
e i j
i N o g a m i , M . D
吋D . . h P D
e p a r t m e n
t o f P s c i r t a i d e , N a r a M l c a e d i y t i s r e v i n U , 8
4 0
S , o h c - o j i h , a r a h i h s a K N a r a 6 3 4
・, 2 2 8 5 . n a p a J T
e
l
：十1 8
・7 4 4 ,
・1 8 8 8 - 9 2 : + x a F 8
ト4 4 - 2 7 4
・9 2 2 2 E
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: r o c - n o g a @ n a r a m e d p j . c
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S u m m a r y F
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r e u s s i t / a i I V r o t c a f ) / T F I l a ( F V s e t a i t i n i b l o o d n i o t l a u a g o c b y p r o m o t i n g F X a g n i o t r a e e n
5 6789. ) a X - c i s n
(i r t x e t S u b s e q u e n n o t i a r n e e g o f i c i s n i r t n F X a ( ) a X - c i s n i r t n i s e i f i l p m a t h r o m b i n
nV
－
2－J
14 寸ムーム
1ム
f o r m a t i o n
. s o u v i r e P s e i d u t s e d s t g e u g s t a h t F V I I a / T F s e t a v i t c a V I I I F y l d i p a r i n i m m e d i a t e c
o a g u l a t i o n - r e a c t i o n s
, a n d F V I l a / T F / F X a s e t a v i t c a F V I I I r o i r p t o t n t p e n d e i n - d e h r o m b k . c b a d e e f We i d e t a g i t s e v n FV I I /F I V I I a / T F /F X a r s p i h s n o i t a l e e n i y l r a n o t i a l g u a c o m e c h a n i s m . s l a t T o F X a g
e n e r a t e
d b y F V I I a / T F a n d F e d a t i v c t a F - / T I a V I F V I I I ) F r 1 a n v a I I I V F ( w a s 2 2. 6
土7 nM ( . 1 m 1 ; n ) i
14567890l a t o t F X a w h F i t r o t i b i n h i - a I I V w a s 3 4 .
土7 n . 0 M ; w h e r e a s F X a g d e a t e r n e b y F V I I a /T F o F r V I I I / T F
1234567890l23
τよ句よームームーム
qL 円 ノム内 正司 Lっ
ιqLq
ノ ム つ 乙 司 ノ
ム ペ414
コJ コJ コJ
w a s 1 4 . 0
土1 o . 1 0 r 7 4 .
土1 4 n 0 . M , r l e v i t c e p s e L . y e l t t i Xa w a s g e n e d e t a r b y F V I I I , e n o l a g i n t e s g u g s t
h a
t a X - c i s n i r t n i m e c h a n i s m s w e r e m e d i a t e d b y F I I l V v u . a ,T a F n d F V I I I / T F t n i i e h . e s a h p - n o i t a i t i n I
n t r i n s i c - X
a w a s d e d l a y e s o m e w h a t b y v o n W d b r a n i l l e r o t c a f ( V W F
司）I I F V I n o i t a v i t c a b y F X a w
i t
h F V I I a T F w a s c o m p a r a b l e a o t n o i t a v i t c i t h w G l u - G l F - d e t v a i y- t c a i n - g r A VI . F T / a I T F c
o u n t e r a c t e
d i e h t y r o t i b i h n s t c e f f e o f VWF o n F X a - i n d u c e d I F V I I n o i t a v i t c a m e d i a t e d b y A r g 3 2 7 c
l e a v a g e
. T h e F I I V I - C 2 d o m a i n b o u n d c o t l p o t y
出m i c d t e d l e - d e a i n o m T F ( T F
ト24 3) , a n d VWF b
l o c k e
d s i h t g d i n i n b b y >8 0 % , g n i t a c i d n i a n o a p l r v e b e t w e e n VWF
国a n d T 4 2 - 1 F 3- n g i n d i b ) s ( e t i s o n C
2
. l l r a e v O , t e s e h a t d a t s g e u g s t a h t i a c s o s - a I I I F V te d i a X - c i s n i r t n , g o v e r n e d b y b t h o F V I I a / T F
・u c e d i n d a n d F X a - i n d u c e d I I F V I n o i t a v i t c a a t e d m e d i by F V I I I - T F , s n o i t c a r e t n i r h e t e o g t w
i t
h F V I I a
回d e p e n d e n t a X - i c s n i r t x e me ch , m s i s a n may be c l a r t n e t o t i e h e s a h p - n o i t a i t i n o f
3 4. n o i t a l u g a o c
巳dfb
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ム 円 ノ ム
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JnU 1ム 44 1
》44 亡Jrb 『 ／
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A1a 4A Aヨパ吐
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JR dR JRJRJ
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K e y w o r d s ; F V I I a , e u s s i t , r o t c a f F V I I I , F X a g en , n o i t a r e n o i t a i t i n i p h a s e
2
123456789012345678901234
ー ム 1ょ 1上 1上 1ょ 1ム 14q ムー よ 寸上 つ 乙 qL 勺／
』つム内
L
I n t r o d u c t i o n F
a c t o
r I I I V ) F ( s n o i t c n u f a s a r o t c a f o c t n i t e h e s a n e x c o m p l e e l b i s n o p s e r p r o f d i p i l o h p s o h ) L P ( s
u r f a c e - d e p e n d e n
t n o i s r e v n o c f F o X t F o X a b y F I X a [ . ] 1 I I I V F s s i d e z i s e h t n y a s a e l g n i s n i a h c m
o l e c u l e
, d e g n a r r a o t n i d x i s n s m a i o ( A l - A 2 - B - A
子C l
・, ) 2 C g n i t s i s n o c 2 o f 2 3 3 , n o a m i d i c a r
e s i d u e
s a h t i w r a l u c e l o m m a s s o f
～3 0 0 k . D a t I p s i d e s s e c o r o t n i s a e i r e s f m o l a t e t n e d n e p e d - n o i h
e t e r o d i m e r
s a h o f y e a v n i a h c ( H C h ) g n i t s i s n o c t f o A e h
トA 2 d , s n i a m o r e h t e g o t h t i w h
e t e r o g e n e o u
s s t n e m g a r f t o f B d e h , n a i m o d e k n i l a l o t t h g i n i a h c ( L C h ) g n i t s i s n o c f t o e h A 3 - C
トC 2 d n s a i o m . ] 3 , 2 [ I I I V F s e t a l u c r i c a s a p l e x c o m v h t w i o n W d n a r e b l l i r o t c a f ( V W F ) , d a n VWF p s t c e t o r s n d a s e z i l i b a t F e h t I I I V r o t c a f o c y t i v i t c a . ] 4 [ T h e c c i t y l a t a y c n e i c i f f e F o f I I I V n i t
h e
i c i s n i r t n e s a n e t p l e x c o m e s i d e n c h a n r e v o d l o f - 5 0 1 b y c r e v n o
計o n i o t n a n a e v i t c , m r o f a I I I V F [
5 ]
. g e a v e a l C t f o H e h C h b y t i n m b o h r n d /o a F r X a o s r u c c A t a r g 3 7 2 A a n d , 4 0 7 r g d p a n s e c u d o r
5 0
・k D a A l a n d 4 0 - k D a A 2 s s t i n u b u . ] 6 [ T h e 8 0
・k D a L C h i c s d e v a e l A t a r g 1 6 8 9 g n i , t a r e n e g a 7
0
・k D a s . t i n u b u g e a a v e C l t t a l e h r e t t a e t i s s e t a r e b i l VWF [ ] , 4 g n i t u b i r t n o c t o t o e h l l a r e v c i f i c e p s
2 内正門5 678901234567890y t i v i t c a t f o c e h r o t c a f o . ] 7 , 5 [
4
円L qL ペJ
コJ1 d1 41J1d
「J
「J
「J
コJAA
T h e a e v i t c m o r f F o f I I V ) a I I V F ( s m o r f a x p l e c o m h t i w e u s s i t r o t c a f , ) F T ( g o t e t a r e n e a t n e t o p e
n
可m e r e l b i s n o p s e i r o f g n i t a i t i n a n d p g n i t a g a p o r
批d o o b l n o i t a l u g a o c s s e c o r p n n i l m a o r h
e m o s t a s i
s . ] 8 [ T h e p m r i
訂yr e l o f F o F / T l a V I p l e x c o m t s i a o e t a v i t c F I X a d F n X [ . ] 9 F
o l l o w i n
g u n i t y r t o b e h d o o l l e s s e v , l l a w T F i e s e d o s p x c o g t n i t a l u c r i d o o b l a n d f s r m o a c o m p l ex w
i t
h . a I I V F T F I a / F V I s e t a i t i n i s i s a t s o m e h b y g g n i t a r e n e F I X a F n d a X a a p n d n g i o t m r o e h t f
o r m a t i o
n t f o e e h c i s n i r t x e s a n e t F / T a I I V ( F / F X ) ( e r u g i F . ) A I s i h T y l r a e e s n o p s e r s d a e l t o t e h g
e n e r a t i o
n e c a r t s n t m o u a f t o n b i o m r h t a h t s e t a i c o s s i d I I I F V m f r o VWF a p n d s e t m o o r t e l e t a l p
4123456. n o i t a v i t c a y l t n e u q e s u b S , i n b o m r t h n o i t a r e n e g a s i d e i f i l p m t n i p e h n o i t a g a p o r e s h a p b y t he
789
012
43 567
89 01 2345
dAAA
nu
－
4 4・44A4・
訓 告 にJ RJ RJRJ
EJ にJ RJR JEJ
広Jp bp b r brb
rbf b
f o r m a t i o
n i o f c i s n i r t n e s a n e t ) F X / a X I / F a I I V I F ( d a n e s a n b i m o r h t o r p ( F V a ) I I F / a X F / o n n
e g a t i v e l y - c h a r g e
d P L e d s e p o x o n p t e l e t a l m e m b r a n e s a n d o r e h t l l e c s e c a f r u s . ] 1 1 , 0 1 [ T h e o
v e r a l
l s s e c o r p d e t c e l f e r t n i e s e h s n o i t c a r e t n i b s a h e c o m e wi y l e d ac d e t p e c t s a c e h d e s a b - l l e c
o a g u l a t i o
n . l e d o m B
e r n t o r
p d c a n s e u g a e l l o d e t r o p e r t a h t i e h t v n o r t i n o i t i d d a o f F I I V I p o t a a s m l m h f r o a i i l h p m o e A p
a t i e n t
s h t i w h g i h g n i d n p o s e r s r o t i b i h n i y l t n a c i f i n g i s d c e a n n h e F V I l a /T d c e d u i n - F n i b o m r t h g
e n e r a t i o
n . ] 2 1 [ T h r o m b i n w s i y l e i d o gn c e r d e z i a p s a t n e t o v i t c a o at r o f FVI i I I n v ivo . n I a
d d i t i o n
, / T F I a V I F b s a h n e e s h o w n a o t e t a v i t c I I I V F y l l a c i t y l o e t o r p , a d t n i o i t c a n v at e t
h r o m b i n - a c t i v a t e
d I I I V F . ] 3 1 [ t n I s i h t x e t n o c , w e p y l s u o i v e r d e b i r c s e d a m e c h a n i s m w n i h i c h
3
12345678901234567
890
12345
6789012
3456789
01 23456
789
01234
567
890
123
45 111111111122
22222222333
33333334
44 444
4444
555
55 55 555
666666
T F/ n t n d e p e d e P L - F V I I a d e t a v i t c a I I I F V m o r e r y l d i p a t a n h t n b i o m h r e n i y l r a n o i t a l u g a o c s e s a h p b y p c i t y l o e t o r s e g a v a e l c A t a r g 3 7 2 a n d A r g 7 4 0 e v i t c e
ヲp s e r r i f t o p e h e c n e e s r VWF [ o f . ] 4 1 n I a
d d i t i o n
, s r u o s e i r e s o f s e i d u t o n h c t i a t s o m e l a i t n e t o p t n i c e h o e c
岨e n s e r p o f F I I I V a n d b g n s i s a y p a
g e n t
s d e t r a t s n m o e d t a h t n o i t a v i t c a - e r p o f F I I I V t n i p e h e c n e s e r o f T F t r e h t e g o F h i t w I a V I / F I V I c
o n t a i n e
d t n i b e h g n s i s a p y , s t n e g a d e t u b i r t n o c e o t a n c e d n h I I V I F n o i t a l u g a o c , y t i v i t c a i v e n e t n e h p
r e s e n c
e a o f I I I V F - i t n r o t i b i h n i s e i d o b i t n a , I - y a w h t a p ( e r u g i F [ ) l B 5 1 .
『] 7 1 , e r o m r e h t r u F a t n e c e r i
n v e s t i g a t i o
n b y R e r i g g u d c a n s e u g a e l l o g n i s u a a n l a m i n m o d e l e d s u o c f o n t p e h e l b i s s o c
o n t r i b u t i o
n f F o I I I V n o i t a v i t c a b y F V I V T F / F X a e s e x m p l c o r o i r p t o t t n d e n p e e - d n i m b o h r f
e e d b a c k - l o o
p t n i i s s e e n g b o m o h r ) I I - y a w h t a p ( . ] 8 1 [ T h e f l l u l a i t n e t o p t f o e s e h s n o i t c a r e t n i t n i e h i
n i t i a t i o
n o f c n o i t a l u g a o e d i n a e m r b o t e f y l l u , d e n i n n e t e d r . e v w e o h T h e p t n e s e r y d u t s w a s d
e s i g n e d
, , e r o f e r e h t f o t r e h t r u e t a g i t s e v n i d e t a i c o s s a - I I I V F / F T / a I I V F m e c h a n i s m s c o f i i s n i r t n F X a g
e n e r a t i o
n I - y a w h t a p ( a n d I i ) I t n p e h y a r m r i e s h a p c o f . n o i t a l u g a o
M a t e r i a l
s a n d M e t h o d s R
e a g e n t
s -L d e t a d i p i h t g n e l - l l u f t n n a i m b c o e r F T ) r ( d e t a d i p i l ( F ; I T n i o v n n R; D a d e , g n i r h e B M
a r b u r g
, y ) , m a n e r G d e t a d i p i l - n o n l l u f h
・t g n e l r T F ( 1 F T 63)
・2 , t c e h i c m s a l p o y t d o m a i n d e
四t e l e d n
o n - l i p i d a t e
d r T F c d e i s p r o m o f a r l l n o i g e r a e l o f u l l e c a r t x d o m a i n a n d a e a n b r e m - m a n s t r d o m a i n (
T F 1
"
2 4 3
; r o t l A c e n i e S c o B i , F L ) w e r e e d s h a c r p u
企o m t i e h d e t a c i d n . s r o d n e v T h e r I I I V F (
K o g e n a t
e F SR) a n d r a I I F V e n o v o s e v ( N R) w e r e d e d v i o p r b y B aye C r . p r o n p a a J , a k a s O ( ) n a p a J a
n d
N o v o k d i s o r N v a g s ( B
ぉ, D d r . r k ) n m a e A n a I I I V F - i t n l n a l o n o c m o y d o b i t n a ( m A b ) C 5 , r
e c o g n i z i n
g C e h t l a n i n r r e t - c i d i c a n o i g e r s e d i s e r ( 5 1 3
・) o 6 5 3 f t A e h l d o m a i n , ] 9 1 [ w a s a u s o r e e n g g
i f
t f r o m C . r D l o r a . r e h c l u F VWF w a s p d e i f i r u f r o m F V I I I / V W F s e t a r t n e c n o c t c a f n o C ( R;
K A K E T S U K E N , K u m a m o t o , ) n a p a J g n i s u f l e g n o i t a r t l i o n a S s e o a r p h e C L - 4 B c o l u m n a n d i m m u n e
同s d e a b d e t a o c t h i w e d z l i b i o m m i I I I V F - i t n a m A b [ . ] 0 2 I I I V F t n e i c
町i f e d s t n e i t a p ’ l a s m a p (
G e o r g
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”K i n g I , . c n n d r l a v e O , k r a P , h S ) K u m a n a , X F I F X , F X a , c g i o o l a t e m ( H , s e i g o l o n h c e T , . c n I B
u r l i n g t o n
, VT） ， α , n i
・b m o r h t t a n i n m b o e c r , n i d u r i h G l u - G l e n o e t k l y t h e m y- o r l o h c - r g A ) , c k R - G ( E P
r o - P r o - A r
g
・h e t o m r l o c h yl n o t e k e( k ) A - c P P m c h e i o l b C a ( , S a n D , o e g i C A ) , a F p s - a I I V c i ec f i i
n h i b i t o
r e d i t p e p -76 ( E A c - A L C D D P R V D R W Y C Q F V E G - N H z ; B a c h e m , , f r d o n b e u B S
w i t z e r l a n d )
, t a n i n m b o e c r e u s s i t r o t c a f a y p a t h w r o t i b i h n i P I ( T F ; A m e r i c a n a c i t s o n g a i D G m b H , P
f u n g s t a d t
, n y ) , r m a G e a n d F X a s e t a r t s b u S
・2 2 2 2 g e n i x ( C h r o m o , , o n l a i M l y) a t I w er p e d e s a c h r u f
r o m
t i e h c i d n at v d e . s r o d n e An I I I V F - i t n a C 2 an y d o b i t wa o s d e n i a t b
仕o m a ev s er h e i a l h i p m o e A p
a t i e n
t h t i w r o t i b i h n i p s a y l s u o i v e r d e b i r c s e d . ] 1 2 [ - A 2 n t i A m A b ( m A b J R 8 ) n d a a 2 C - i t n m A b ( m A b E S H 8 ) w e r e o d e n i a b t r o m J f R S c i f i t n e i c . c n I , a n d d l W o o ( C A ) a A n d m e r i c a n a c i t s o n g a D i
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. , h c w i n e r e G ( ) , T C . y l e v i t c e p s e r T w o m A b s a t s n i a g e e h t r a l u l l e c a r t x d o m a i n o f T F w e r
巴p
u r c h a s e
d r o m f A m e r i c a n a c i s t o n g a i D . c n I a n d R&D S m s t e y s , s i l o p a e n n i M ( M N ) . E
G R -
m o d i f i
巴dF I a V I w a s o d e n i a t b p s a y l s u o i v e r d e t r o p e r . ] 4 1 [ n o - c e s a d i x o r P e d e t g a u I g G w a s p
r e p a r e
d g n i s u e s a d i x o r P e g i n l e b a L ( t i K , o d n i j o D K u m a m o t o , . ) n a p a J P L v s e l c i s e g n i n i a t n o c p
h o s p h a t i d y l s e r i n e
, , e n i l o h c l y d i t a h p s o h p e n i m a l n o a h t e l y d i t h a p s o h p ) 0 % : 3 6 0 : 1 0 ( e p w e r d e r a p r e s a p
r e v i o u s l
y d e t r o p e r . ] 2 2 [
P r e p a r a t i o
n o f F V I I U F V I I I a s t i n u b u s
・I I V I F s t i n u b u s w e r e d e t a l o s i f r o m r . I I I V F I I V I F 5 . 1 ( μ M ) w a s t d e t a e r t h g i n r e v o 4° t a C i b n r e f f u g n i n i a t n o c 0 1 mM M E S , p H 6. 0, 5 2 . 0 M N C l , a 5 0 mM E D T A , a n d t i e h t c a t n L C h ( 0 8
・k D a ) d i a n t c a t n H C h ( 0 9
・2 1 0 k D a ) w e r e d e t a l o s i g n i w o l l o f c
h r o m a t o g r a p h
y o n S e o s a r h e p - S P a n d Q s e r o h a e p - S s , n u m o l c y l e v i t c e p s e r . ] 3 2 [ T h e p d e i f i r u H C h w a s c v a e l
巴db y t , n i b m o r h a n d t A e h 2 a n d A l s s t i n u b u we p e r d e i f i r u b y h h g i c e a n r m f o e r p l
i q u i
d h y r a p o g a t r o m c h ( H P L C ) g n i s u p r a - T H i i n a r e p H c o l u m n d S a n s e o a r p h S e - P c o l u m n . ] 3 2 [ T h e 7 0
・k D a L C h w a s p d e i f i r u f r o m d e v a e c l - n i b o m r h t 8 0
・k D a L C h , g n i w o l l o f s e r o h a e p P - S S
c h r o m a t o g r a p h
y . ] 4 2 [ A c D N A c g n d i o C e h t 2 d o m a i n e n c e q u s e o f h u m a n I I I V F w a s c , d e t c u r t s n o t
r a n s f o r m e
d o t n i a i h c i P p a s
的s c i r s l l e d e a n d e s s e r p x y n i t s a e n o i t e r c e s m s e t s y s . ] 5 2 [ T h e C 2 p
r o t e i
n w a s d e i f i r u p b y a m m o n i u m e t a f l u s n o i t a n o i t c a r f a n d e g n a h c x e - n i o t a c H P L C . S D S
・P A G E o f t i e h d e t a l o s s t i n u b u s d e w o l l o f b y s g n i n i a t h t i w G e l C o d e l u e B e n t a g R e e c r e i P ( , R
o c k f o r d
, s ) L I h o w e d >9 5 % p . y t i r u n i e t o r P s n o i t a r t n e c n o c r e w e d e i n m r t e e d b y t B e h d o r f a d r m e t h o d . ] 6 2 [
4 1
2 t a 2° C [ . ] 7 2 I I I F V w a s r d e t c a e t h i w T F l a / F V I nM/ 1 ( n 1 . 0 M ) w h t i P L v s e l c i s e 印刷）．
F X a g n o i t a r e n e y a s s a -T h e r e t a o f c o n v er n o i s o f FX t F o X a w a s m d r e o i t o n a n i d e i f i r u p e m s t s y
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F V I I
a y t i v i t c a w a s t d e t a n i m r e r e t f a 3 0 s b c e y t a e h n o i t i d d o f E 6 ( - 7 5 . 2 U / , ) l m F n d a X a g n o i t a r e n e
w a s i d e t a i t i n b y t a e h n o i t i d d f F o I X a ( 1
凶) i t a n d FX ( 5 0 1
仙の．s t o u q i l A w e r e r e m o v e d t a
a p p r o p r i a t
e s e m i t a o t s s e s s e h t l a i t i n i s e t a r o f p t c u d o r n o t i a m r o f a n d w e r e a d d e d o t E D T A g n i n i a t n c o - s e b u t q o t h u e n c r e h t . s n o i t c a e s t e a R f F o X a g n o i t a r e n e e r e w d e i n m r t e e d by t
h e
a n o i t i d d o f S 2 2 2 - 2 6 4 . 0 ( m M ) . n s o i t c a e R w e r e r a d a e 4 t 0 5 nm u g n i s a m s t e y s b s L a a n k i s t u l M M
u l t i s o f
t e t a l p o r c i m r e d a e r , m s e t s y s b a L ( i k n i s l e H , ) d n a l n i F . C l o r t n o s t n e m i r e x p e d t e a t r s n m o e d t
h a t
t FX p e h n o i t a r a p e r i e d u s t n s i h y d u t s w a s n c t o d e a t n m i a t o n F h t i w X a ( a t a d s t o n . n ) w o h
F
V I I I n o i t a v i t c a F y b X a i t n c e h o e c
・e n s e p r f F o 1 α / I V
ーI I I V F y t i v i t c a w a s m r e d e a s u a n i o
n e - s t a g
e g n i t t o l c y a s s a g n i s u t n e i c i f e d - I I I V F . a m s a l p r l l A s n o i t c a e w e r e d m e o r r f p e 3 t a 7°C .
5
12345678
90123
445
78901234567890l236
45678
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45 67890
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12345
－1 114111
1ム112
2222222223333333333444
444
444445555555555666666
F V I I
I 0 1 (
仙のa n d P L ( μ 0 2 M ) w e r e i d t e a b u n c e i t h w r e h t i V I I a / T F F 2 . 0 (
品1/0 2 .
仙の，F X a ( 2 . 0 n M ) , o b r h o t 2 n i 0 mM H s , p e e 0 mM N 1 4 a C l , pH 7 ( 2 . H B S ) g n i n i a t n o c 5 mM C a C b . S a m p l e s w
e r e r e m o v e d f r o m t m e h e s r u x t i i t a d e t a c i d n , s e m i t a n d F X a / F V I I
ぁT F r n o i t c a e w a s i e l y a t e d i m m t
e r m i n a t e
d b y t a e h n o i t i d d o f E
・7 6 ( 5 . 2 μ M ) , P P A - c k 5 . 2 ( μ M ) , a n d h n i d u r i 5 2 . 0 (
仙の，a n d
5 0 0 . n o i t
・u l i d I I I F V y t i v i t c a w a s c d e t a l u c l a g n i u s a s d r a d a n t e v u r c o f F I I V I F n i t n e i c i f e d - I I I V p
l a s m a
s . T h e p e n c s e e r o f F X a , F T F , a / V I I a n d p e s a e t o r s r o t i b i h n i t n i d e h d e t u l i l e s s a m p n d i d t o a
f f e c
t I I I F V y t i v i t c a ( < 0 . 5 % ) i t n s i h . y a s s a F
V
I I I e g a v a e l c F y b X a
同I I F V I n 5 0 ( M ) p d t e a b u n c i e r VWF ( t h w i μ 0 5 g
／凶）w a s m i x e d h F w i t X a (
1
仙の，P L ( 0 0 1 μ M ) , a n d T F ( n 1 M ) i H n B S - b u f f e r g i n n i a t n o c 5 mM C a C h a 3 t 7°C A . s o t u q l i w e r e r e m o v e d t t a i e h d e t a c i d n e s m t i a n d t r e h s n o i t c a e w e r e i e l y i a t e d m m d t e a i n m e r t a n d p d r e p a r e f
o r
S D S - P A G E b y a i n g d d S D S a n d b g n i l i o 3 r o f . n m i E
l e c t r o p h o r e s i
s a n d W n r t e s e g n i t t o l b - S D S - P A G E w a s p d o r m e e r f n g i u s 8% g s l e 1 t a V f 5 0 1 r o h
r ,
f d w e l o o l b y W e s t e r n g n i t t o l b . s i s y l a n a n i e t o r P n d s b a w e r e p r o b e d n g i u s i t n a
凶I V I I F m A b s , f
o l l o w e
d b y g t a o s e o u m i - n t a d e k n i J e - s a d i o x r e p y a r o n d e c s m A b . s l a n g i S w e r e d e t c e t e d g i n s u e
n h a n c e
d n c e e s c e u m i n h e m i l c m e r E l k i n P e r ( e f i L c e e n c i S , , n t o s B o M A ) . c r i t m e o i t s e n D n s a c s w e r e q d e t a t i t n a u g n s i u I m a g e J 8 3 . 1 ト （ l a n o i t a J e t u t i t s n I o f H , h t l a e U S A ) .
E L I S A t f o r F e h V I I I - T F g n i d n i b
”r e t i t o r c i M s l l e w w e r e c d t e a o h i t w I I F V I ( n 0 1 M ) i 2 n 0 mM T
r i s
, 1 4 0 mM
ト, l C a f p H 7 ( 4 . T B S ) t h g n i r v e o 4° t a . C T h e w s l l e w e r e w a s h e d H t h w i B S a n d w e r e b
l o c k e
d h H t w i B S c g n i n i a t n o 1 0 % s k i m m e d i l k f m 2 r o h a t 3 7°C V . o u s a r i a m o u n t s o f T F w e r e t
h e n
a d d e d H n i B S c g n i n i a t n o 5 mM C a C h a n d Oβ 1 % b e i n o v s e r u m a l b u m i n a n d w e r e i e d t a u b c n f
o r
2 h a t 3 7° C . o n c e - a s i d x r o P e d t e g a u F T - i t n a m A b l g G ( μ 2 g/ ) w m l a s a , d d e d a n d b o u n d l g G w a s q i t n a u 日 e d b y t a e h n o i t i d d o f T
恥侶t n e a g e r ( K P L , , g r u b s r e t h i a G M D ) . s o n i c t e a R w e r e t
e r m i n a t e
d b y t a e h n o i t i d d o f 2 M H 2S04 a , n d a s c e a n r b s o b w e r e m e a s u r e d 4 t a 5 0 n m . T h e a m o u n t c f i i e c s p n n o f o n g i d i n b - T F n t i o f a m A b I g G w t u h o i t T F w a s <3% o f t l a t o . l a n g i s S pe ci c i f b
i n d i n
g w a s r d d e r c o e r e t f a g n i t c a r t b u s n e h t c i f i c e p s n o n g d i n b i .
S u ヴ n o s m l a - p e a c e c a n n s o e r e d a s - b R ) S P ( y a s s a - s c i t e n i K o f T F i n o i t c a r e t n t h i w I I I F V i r o ts s
u b u n i t
s w e r e e d i n r m e t e d b y S P R - b a s e d ss a ay a s 3 t 7° C u g i n s B iac e r o T 2 0 0 t e n m r u t s i n ( GE H
e a l t h c a r e )
. l e b u o l S T F w a s c y l t e n l a v o e d u p l c o t o t s e h s e c a f r u o f a C M 5 c p i h a c t a g n l i u p o d
e n s i t
y o f 2 2 n g/ m m 2 . d L i g a n n g d i n b i w a s m r e d i t o o n r n i n g n i u n r e f f u b mM H 0 ( 2 , p e s e 1 mM
6123456789nu
－－2345
6789012
34567890
1
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14
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ム勺 4qL
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C a C h , 0 . 0 0 5 % ) 0 2 t e a b r o s l y o p 2 m r o f i n a a f t l o w e t a r 2 0 μ . n i m / I T h e d n o i t a i c o s s i o f b o u n d l
i g a n
d w a s r d d e r c o e e r o v a 2 - m i n d i o r e p b y r g n i c a l p e l e h t g n i n i a t n o c - d n a g i r e f f u b t h w i r e f f u b a
l o n
e . T h e l l e v e o f n c i f i c e p s n o , g n i d n i b n g i d o n p s r e r c o l o t d n a g i g n d i n b i t o t u e h d a t e c o n p , i h c w a s s d e t c a r t b u f r o m t s e h . l a n g i W a s h i n g r e f f u b mM N 0 5 ( a O H ) w a s u s e d r r o f s n o i t a r e n e g e o f t
h e
s r o s n e . s p i h c T h e r e t a s t n a t s n o c a r o f n o i t a i c o s s ) o s s a k ( a n d d n o i t a i c o s s i （ん刈 w e r e d e d i n r m t e e b y n r a e n i l n o n o i s s e r g e r s i s y l a n a g n i s u u a l v a e ti s n o e r w a t f o . d e d i v o r p n o i t a i c o s s i D s t n a t s n o c （ κ d ) w e r e c d e t a l u c l a k s a s s i d . o s s l a k
D
a t a a s e s y l a n - e l l A s n t e i m e r p x w e r e d r m e r f o p e o n t e e r h e t a r a p e s n i o s a c c o a , s n d t a e h g e a e r v v
a l u e
s a n d s d r a d n a t s n o i t a i v e d w e r e de e r t d . e n i m a r i n e n l N o t s a e l s q u
紅 白e r g e r ss n a o i s i s y l a n w a s p
e r f o r m e
d g n i s u p h r a a g i d l e K a g y n e r ( S y , e r a w t f o S , g i n a d R e . P A ) s s i y l n a A o f i n o i t c a r e t n b e t w e e n F e h t I V I I s t i n u b u s a n d T F f o r m s E n i L I S A s w e r e p f o r m e r
巴du n g i s e t i s a - e l g n i s g i n d i n b m
o d e l .
R e s u l t s
F V I / a / T F
圃e d d u c i n I J I - d F V ，
句n t n d e p e F X a g n o i t a e r n e - We f t s r i e x a m i n e d F V I I a /T F
・e n t n d e p e d F X a g n o i t a r e n e t n i p e h c e n e e s r o f F I I V I c o t f i r a l
シe p h t e l b i s s o e l o r F o f I V I I F n i V I I a /T F - i n d u c e d 3
2
3n o i t a i t i n i o f c u l g o a ti a . n o I I I F V n 1 ( M ) a n d P L ( μ 0 2 M ) w e r e p e d t a b c u n i r e wi F h t V I I a n 1 ( M )
456789012345678
901
234
56 78901
23 45 33 333
334
44444444455555
55 555
66 666
6
a n d l d e t a d i p i T F ( 1 . 0 n M ) f 3 r o 0 s . c e F X a g en n o i t a r e w a s t i n h e i t i n at by d e a e h t n o i t i d d o f F I X a (
1
n M ) a n d FX ( 0 1 5 n M ) , d w e o l l o f b y r n o i t c a e 4 m r o f i n ( e r u g i F ) . A 2 T h e t e s n i s h o w s e h t r
e a c t i o
n r e t f a i e h t l a i t i n 1 m . n i t n I e s e h , s e n c a t s m u c r i c r e h t t n a t c a e s e u r t i x m d n e i a n t o c h t b o i
n t r i n s i
c t ena m e s d a t e e d i b y F V I I a / T F - c a a l t d e z y I a V I I F a nd e c i s n i r t x e s a n e t d e t a t i l i c a f by FVI Ia . F T / T h e am o u n t s o f g e d t a r e e n F X a i e r c n e d s a t i me- de p e n y l t n e d r e t f a a e h t n o i t i d d o f n e v i t a F X , u p t 2 o 6 . 2
士7 nM a . 1 1 t m i n a n d 6 . 4 0
土2 nM a . 4 4 m t i n n p e o ( . ) s e l c r i c t n I a e h c e e n b s o f F
V I I
I , , v e r w e h o F V I I a / T F d e t a i
・t i n i c i s n i r t x e F X a g n i o t a r e n e 4± . 0 1 1 ( . 1 nM a 1 t m i n , 2 . 8 3
土8 nM . 1 a
t
4 m n ; i t p e n o ) s e l g n a i r w e r e a t u b o o f l a h f t e s o h i n i p s t . e c n e s e r A s e e d c t e x p
ラy l v e r e l t t i FX a g
ene t i a r w n o
出t n e d i v e t n i p e h re e nc s o e f F I I I V e n o l a 5 0 . 0 ( ±0 3 0 .
凶1 1 t a m i n , 7. 9
士7 nM a . 0 4 t m
i n
; p e n s o . ) s e r a u q T h e s e s t l u s e r d e t a c i d n i t a h t F X a g n o i t a r e n e b y F V I I a / T F w a s s y l t n a c i f i n g i e
n h a n c e
d b y F I I V I t a v i t c a
巴db y F V I l a / T F og t et w r e h h g i t l l a u d a r y d e a t r e n g e F X a .
T o f r e h t r u la c ri f
シt her e l o o f FVI i a I t n he r e s , s n o i t c a e r a l i m i s e xp e r i m en ts w e r e r e t a e p e d n g i u s a F
V I I a r o t i b
幽i h n i e d i t p e p ( E
・) a 6 7 d d e d 3 0 s a c e f
王r m e i x i n g F V I l a / T F F t h w i . I I I V T h e a m o u n t s o f F X a g d e t r a e n e t n i e s e h e s c n a s t m u c i r c w e r
巴4 . 3
土7 nM a . 0 1 t m i n a n d 3 9 . 0
士0 nM a . 1 4 t m i n d e s o l c (
7
14
o f F I a I I V w a s p e d u c o d r l t a r e t a p e m t i s t n i o g n i r u d i e h t n o i t a i t i n f c o . n o i t a l u g a o a n I , n o i t i d d T F
1 5
16
d r e a p e p a p o t y l e v i t i s o e t a p i c i t r a p F n i t n d e n e e p d - I I I V F X a g n o i t a r e n e l t n e d n e p e d n i y a . l V I f F o
1 7 18 19 20 21 22 23 2 4
2
2
5
6 27 28 29 30 3 1 32 3 3 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 4 7 48 49 50 515 2
53 54 55 56 57 58 59 60 6 1 62 63 64 6512345678901
23
14
寸ム 寸 ム
1ム
c ir ) s e l c
. F X a g n o i t a r e n e w a s f r e h t r u d e s s e s s a g n i s u s e r u t x i m f F o I I I V n d T a F w u t o h t i F V I l a . T h e a y t i v i t c o f F X a w
出l o w a 1 m t i n ( 4 7 . 0
土4 1 . 0 n M ) o s l c ( s e d , ) s e r a u q w t u b a s s t n a c i f i n g i l y g
r e a t e
r t n a h t t a h F h t i w I I I V . e n o l a A 4 m h , n i , e r e v w o m e a su s t e n m r e o f F X a w e 3 e r 0 . 0
土5 . 0 nM a
t
4 m , i n g n i t a r s t n o m e d a m a r k e d n o i t a c i f i l p m a f F o X a g . n o i t a r e n e h e s e T s y a s s a d e t c e l f e r F
V I I a / T
F
・d e c d u n i c i s n i r t n i - a I I I V F , e s a n e t d t a n d e h a t a w e r e t n e t s i s n o c h t i w h e h t s i s e h t o p y , t
h e r e f o r
e , t a h t a e h t y t i v i t c F o f / T F I I a V c i s n i r -e t x e s a n e t d e t u b i r t n o c l t n a i n m o d e r p y t t o r e h d i p a F X a g n o i t a r e n e d e d r o c e r t n i a e h e c n s e b f E o -76 a , n d t t a h c i s n i r t n i e s a n e t d c e u n d i t n i p e h e c n e s e r
I m p a c t o f VWF o T r F P I o n F e d t l a r e - I F / / a V / F V J l l
・n t n d e p e d e F X a g o n i t a r e n e
・I I V I F s i c
o m p l e x e
d VWF i h t w i c n g n i t a l u c r i o d l o b . ) 4 ( T o e x a m i n e i e h t t a c p m o f F I I V I / V W F o n t n e
出e g
e n e r a t i o n
, e r o f e r e h t r , a l i m i s s t n m e i r e p x e e r e w t n i p e h e c n e s e r o f VWF 1 ( μ g/ m l) (F e r u g i . ) B 2 FVI b I I s d n i VWF w o t h h t i a h g i y t i n i f f （ κ d ：～ 3 . ・ 0 n M ) ] , 8 2 ( a n d u r d e n r e u o l a t n e m i r e p x s n o i t i d n o c ,
>9 0 % o f F I I I V l d u o s h p b e t n e s e r t s a c e h m p l e x o h t w i V W F . F X a c n c e o n
むs n o i t a g n i s u F V I I I N W F c n i n o i a t n b i m o h t i w F l a / T F V I g n i t c e l f e r ( t h o b c i s n i r t x e n d i a c i s n i r t n ) e s a n e t w e r e
1 6 .
7
土4 . 1
仙1 I t a m i n , g n i d n o p s e r r o c o t
～7 5 % o f t t a h t u o h t i w VWF se ( F e e r u g i . ) A 2 r e t f A 4
・m i n ,t F e h X a l s l e v e w e r e 6 0. 6
土6 . 4 nM an d w e r e s r a l i m i t o t t a h t u o h t i w V W F . , y l r a l i m i S t n i he p
r e s e n c
e o f V W F , FX a g d e t a r e n e F h i t w T F / I a I F V I / I V I
厄ー7 6 ( g n i t c e l f e r c i s n i r t n i ) e s a n e t a n d t t a h w
i t h
F l I I V TF ( / g n i t c e l f e r n o i t a v i t c a b y e u s n o o g e n d F X a ) w e r e m l e t a r e d o y d e s a e r c e d 2 y b ( 9
・5 9 % ) c o m p a r e d t o t e s o h t n i a e h e n c e s b f V o W F . c n I t s a r t n o , e s a , d e t c e p x a e h t n o i t i d d o f VWF h a d l
i t t l
e e c n e u l f n i o n F X a g n o i t a r e n e b y F V I I a /T F i t n a e h c e n s e b I V I I f F o n i t c e l f e r ( c i g s n i r t x e ) e s a n e t , b
u t
s y l t n a c i f i n g i e d s a e r c e d t a h t d a d d e I I V I F g n i t c e l f e r ( n o i t a v i t c a b y e u s n o o g e n d F X a ) . h e s e T r
e s u l t
s w e r e i k n g i n p e e t h t i w i e h y r o t i b i h n l a i t n e t o p f VWF o o n t a e h n o i t a i c o s s t w e b e e n I I I V F a n d F X a , h g u o h t l a F e h t V I I l / V W F c o m p l e x e d r a e p p a h o t a v e a l d e t i m i t c e f f e o n F V I I a T F / d e t a l e r - F
V I I I - d e p e n d e n
t F X a g . en n o i t a r e
T F P I d o w n s e t a l
同u g e r d o o l b n o i t a l u g a o c by i g n i t i b i h n F X a a n d F V I l a /T F. T h e p l a c i g o l o i s y h c
o n c e n t r a t i o
n f T o F P I p n i s m a l a s i
～6 . 1 n M , al u o h t g h m o s t of c e h t n i t a l u c r i g T F P I s d n i b t o l
i p o p r o t e i n
s （ ～ 8 0 % ) , an d t p e h l a c i g o l o i s y h on c cen n o i t a r t t s a e h ‘ re f ' I F P T - e f o r m i s～0 5 .
凶1 . ) 9 2 ( I
n c e h t n o i t a l u g a o c e o r p , s s h o w e , r e v TF PI r e c n i s e s a p i a r l y by ～3 d 0
・・d l o f （ ～ 5 1 n M ) g n i w o l l o f v
a r i o u
s v a r t n i c u s a la me r ch m s i s a n g n i d u l c n i r a e h s s s e r t s a n d t r o h m b i n g ene n o i t a r . ) 0 3 [ M o s t T F P I b s d n i F o t T F I I a / V F a n d X a , s y l s u o e n a t l u m i g n i t i b i h n i F X a a n d F V I I a /T F wi h i t 3 n 0
・6 0 s c e
8
12344567890123
ーム寸 ム 寸 ム 14
a f t e
r FX a n o i t a v i t c . ] 1 3 [ We e i n e d x a m , e r o f , e r e h t i e h t c t a m p o f d t n e r e f f i s n o i t i d n o c f T o F P I o n F
V I l a / T
F d e t a
”l e r I I I F V
四n t e n d e p d e F X a g n o i t a r e n e e r u g i F ( . ) C 2 T h e a t s m o u n F o f X a g d e t a r e n e a
f t e
r 4 m i n b y F F I I a / T V m i x e d T h i t w F P I a 0 t 5 . nM l e n a p ( a ) a n d 1 5 nM l e n a p ( w ) b r e 3 e . 9± 2 . 4 1 nM ( 8 6 % o c f ) l o r t n o a n d 1 5 . 1
土8 . 0 nM ( 3 0 % o f c , ) l o r t n o . y l e v i t c e p s e r C oη e s p o n d i n g s l e v e l o f F X a w F h i t F / T a I I F V / I I I V m i x e d h 0 t i w 5 . nM T F P I w e r e 4 9. 2 ± 1 7 .
品f i % o 1 8 ( f c , ) l o r t n o w t u b e r e o
n l
y l y s t e o d m d e s a e r c e d 0 . 8 3 (
土3 nM, . 3 6 3 % o f c ) l o r t n o t n i p e h e c n s e e r f 1 o nM T 5 . I F P n I c
o n t r a s t
, F X a g d e t a r e n e b y F F T a / I V I / F l I I V t n i p e h c e n e s e r f E o - 7 6 w e r e n a t o d e t c e f f b y T F P I ,
1 4 567
g n i t s e g g u s t a h t p e h t l a i t n e t o d e t a l e r - F / T a l I V F / I I I F V f o F o t X a g n o i t a r e n e e n i d e m i t - y l r a s n o i t c a e r
89012
3456
78 9012
3456
78 90 123456
789
01 2345678 1111
122222
22222333
33 33 33 4344
44 4444455
5555555
( <3 0 s ) c e w a s n r t o d e t c i r t s e b y T F i n o i t i b i h n . M o r e o v e r , s y a s s a F o f X a g n o i t a r e n e b y F T F I / I I V a
l s
o w e r e s r a l i m i e t a c h a n o i t a r t n e c n o c T o f . I P F T a k e n , r e h t e g o t e e h t n g i n c a n h t c e f f e o f T F i n F
V I I I - d e p e n d e n
t F X a g n o i t a r e n e t n i a e h e n c e s b o f F , a I I V d e r e a p p a b o t e e t n e d i v e n e v t n i e h p
r e s e n c
e f T o I . P F
F V I I I n o i t a v i t c a t n i c e h o e
てc n s e e r p o f F X a a n d F V I / a / T F
・T o c f i r a l
シe m h t m s e c h a n i s o f F I I V I
a c t i v a t i o
n b y F F I a / T V I a n d F X a ( I I - y a w h t a p F n i e r u g i ), 1 w e i d e t a g i t s e v n e d n d u c a - i F X I I I V F a
c t i v a t i o
n t n i p e h e c n e s e r a . I V I f F o I I I F V n 0 1 ( M ) a n d T F / P L 1 . 0 (
凶0 2 / [ i μ M ) w e r e i d e t a b u c n w
i t h
F X a ( 2 . 0 刷） a r o / d n I a F V I 2 . 0 ( n M ) , r o i r p m o t n g r i s u e a I I I V F y t i v i t c a a n i o n
かe g a t s g n i t t o l c a
s s a
y e r u g i F ( ). B 3 o t h F X a a n d F I I a V d e s a e r c n i I I V I F y t i v i t c a b y
～- 2 . 2 r o
～6 . 1
・d l o f o f i l a i t i n l
e v e l s
, . y l e v i t c e p s e r , y l t n e u q e s b u S s o m e w h a t t n e r e f f i d , p e d e - m i t
巴t e n d n s n o i t c u d e r a n i y t i v i t c w
e r e d e d r o c e r p s a y l s u o i v e r d e t r o p e r . ] 2 3 , 4 1 [ n I c e h t o e c n
・e s e r p o f F X a a F n d , a I I V I I I V F a
c t i v i t
y d e s a e r c n i b y
～2 . 9 d
・l o f f i o l a i t i n , g i n t a r t s n o m e d a n a e v i t i d d . t c e f f e e o r m e r h r t u F , F X a t
o g e t h e
r h t i w e t i s - e v i t c a d e f i i d o m E G R - F V I I a d e t a v i t c a n i ( ) m r o f o s l a t e d r o m o p r a si l i m s e s a e r c n i i
n
F I I I V y t i v i t c a （ d l ～3 o f - 1 . o f i i t i n . al ) T h e s e s t l u s e r d e t s e g g u s F t a h t X a
・d e u c d i n I I I V F n o i t a v i t c a c
o u l
d b e e d n c e n h a b y t c e h e c n e s e r p - o o f F , a I I V i r o d e t a v i t c a n F V I I p n i y r m a i r n o i t a l u g a o c r
e a c t i o n s .
F X a a n o i t a v i t c o f F V I I I I V W F t n i p e h e c e n e s r o f TF
・e c n i S VWF p s t c e t o r I I I F V f r o m F
X a - c a t a l y z e
d s i s y l o e t o r p , ] 4 3 , 3 3 [ c e h t n o i s r e n v o F o t a I I I V s s i y l e r e v e . d e s s e r p e d l y n t e q u s e o n C , e n o u g h
創s n t u n o o f F X a , w h i c h y l e k i l e t a p i c i t r a p i n i l a i t i n l a c i g o l o i s y h p n o i t a l u g a o c s e s a h p (
p a t h w a y - I I
; e r u g i F ), 1 m a y n b t o e g . d e t a r e n e T h e r e l o T o f F i t n F e h V I I I / V W F a n d F X a i
n t e r a c t i o n
s s n a i m e r , r a e l c n u r . v e w e o h T o e e x a m i n e s e h t m e c h a n i s m F , s I I I V 0 1 ( n M ) w a s p
r e i n c u b a t e
d VWF ( h i t w μ 0 1 ) l m / g a n d m i x e d F h t i w X a / P L 0. ( n 2 M / 2 0 μ M ) i t n p e h r
巴e c n e s o f T F
5 9
2 . 0 ( n M ) p r o i r m o t g i n u r a s e I I V I F y t i v i t c a e r u g i F ( . ) A 4 t n I a e h e c e n s b o f T F, F e h t I I I V p e a k
60 6 1
62「 9
J4
に占 J
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