Microsoft Word _陸上報告書Ver.12.docx

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• Nitrobacter winogradskyi Winslow et al. (ATCC® 25391™) 海水由来であったため。

• Nitrococcus mobilis Watson and Waterbury (ATCC® 25380™) 上記と異なる属で培養温度が比較的水槽中の温度に近いこと。

冷凍状態で届いた菌を、推奨培地を用いて前培養を行った。以下に各菌の推奨培地の組成を示す。

Nitrosococcus oceani (Watson) Watson (ATCC® 19707™) Ammonium sulfate 1.32 g

MgSO4·7H2O 380.0 mg

CaCl2·2H2O 20.0 mg

Chelated iron (Geigy Chem 13% iron) 1.0 mg

Na2MoO4·2H2O 100.0 mcg MnCl2·4H2O 200.0 μg CoCl2·6H2O 2.0 μg ZnSO4·7H2O 100.0 μg K2HPO4 8.7 mg Phenol red 0.04% 3.25 ml Seawater (filtered)※ 1.0 L

Adjust final pH to 7.5-7.8 with 1 N HCl. Autoclave at 121C for 15 minutes.

※インスタントオーシャンで作成したものを用いた。

Nitrosomonas europaea Winogradsky 1892

(NH4)2SO4 2.5 g KH2PO4 0.5 g HEPES 11.92 g NaHCO3 0.5 g MgSO4·7H2O 100 mg CaCl2·2H2O 5 mg Fe-EDTA 75 mg DI water 1.0 L pH 7.8 - 8.0

Nitrobacter winogradskyi Winslow et al. (ATCC® 25391™) Solution A (以下に記載) 0.5 ml Solution B (以下に記載) 0.5 ml Solution C (以下に記載) 1.0 ml Solution D (以下に記載) 0.5 ml Solution E (以下に記載) 0.5 ml Solution F (以下に記載) 2.0 drops DI Water to to1.0 ml Autoclave at 121ºC. Solution A: CaCl2 2.0 g DI Water 100.0 ml Solution B: MgSO4·7H2O 20.0 g

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26 DI Water 100.0 ml Solution C: EDTA 0.14 g FeSO4·7H2O 0.5 g H2SO4 (conc.) 0.05 ml DI Water 100.0 ml Solution D: Na2MoO4·2H2O 0.1 g MnCl2·4H2O 0.2 g CoCl2·6H2O 0.002 g ZnSO4·7H2O 0.1 g CuSO4·5H2O 0.02 g DI Water 1.0 L Solution E: NaNO2 41.4 g DI Water 100.0 ml Solution F: K2HPO4 1.74 g DI Water 100.0 ml

Nitrococcus mobilis Watson and Waterbury (ATCC® 25380™) Solution A (以下に記載) 0.5 ml Solution B (以下に記載) 0.5 ml Solution C (以下に記載) 1.0 ml Solution D (以下に記載) 0.5 ml Solution E (以下に記載) 0.5 ml Solution F (以下に記載) 2.0 drops Seawater※ 700.0 ml DI water to 1.0 L ※インスタントオーシャンで作成したものを用いた。 Solution A: CaCl2 2.0 g DI water 100.0 ml Solution B: MgSO4·7H2O 20.0 g DI water 100.0 ml Solution C: EDTA 0.14 g FeSO4·7H2O 0.5 g H2SO4 (conc.) 0.05 ml DI water to 100.0 ml Solution : Na2MoO4·2H2O 0.1 g MnCl2·4H2O 0.2 g CoCl2·6H2O 0.002 g ZnSO4·7H2O 0.1 g CuSO4·5H2O 0.02 g DI water 1.0 L Solution E:

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27 NaNO2 41.4 g DI water 100.0 ml Solution F: K2HPO4 1.74 g DI water 100.0 ml なお、硝化細菌の定量技術について調査を行った。Nitrosomonas 属に関しては株式会社ヤクルト本社が販売する「イムノラテックス“検出くん”」、Nitrospira 属（Nitrobactor 属）については株式会社ヤクルト本社が販売する「イムノラテックス“スピラくん”」を用いることで定量が可能と判明したが、今回の試験では実験期日の都合で実施ができなかった。また、 Nitrosococcus 属については菌の入手元である NBRC に定量手法のヒアリングを行ったが、特に定量手法があるわけではなく、上記培地で培養後に硝化能を測定して菌の増加を確認しているということであった。そこで、今回の検討では培養日数を合わせることとした。また推奨培地を用いて菌ストックを作製した。なお、推奨培地には微量であるが重金属が含まれている。濃度的には問題になるレベルではないが最終的に飼育水槽への投入は避けたほうが望ましい。そこで、推奨培地での培養後に培地中に重金属を含まない以下の条件での培養を試みた。表 A-2- 3 重金属を含まない培地での培養条件菌名温度人工海水培地組成培養温度アンモニア酸化細菌 Nitrosomonas europaea Winogradsky 1892 26℃ インスタントオーシャン 3.5% +(NH4)2SO4 2.5 g/L （硫安）静置 Nitrosococcus oceani (Watson)

Watson (ATCC® 19707™) 振盪

亜硝酸酸化細菌

Nitrobacter winogradskyi

Winslow et al. (ATCC® 25391™) インスタントオーシャン 3.5% +NaNO2 214 mg/L

（亜硝酸ナトリウム）

振盪 Nitrococcus mobilis Watson and

Waterbury (ATCC® 25380™) 静置 N. europaea及びN. oceaniについては推奨培地 4mL に対して菌ストック 1mL を追加して 1 週間培養した菌を 15,000rpm、4℃、5 分の条件で回収し、その沈殿に対して人工海水（100%海水）1mL で 3 回洗浄し、同条件で遠心分離した後に 5ppm アンモニア入り人工海水（100%海水） 10ml を加えて培養を行った。その後、経時的に産生される亜硝酸の量を測定した。 N. mobilis及びN. winogradoskyについては推奨培地 4mL 菌ストック 1mL を追加して 1 週間培養した菌を 15,000rpm、4℃、5 分の条件で回収し、その沈殿に対して人工海水（100%海水） 1mL で 3 回洗浄し、同条件で遠心分離した後に 5ppm アンモニア入り人工海水（100%海水）10mL を加えて培養を行った。その後、経時的に産生される硝酸の量を測定した。

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28 図 A-2- 12 培養した菌により産生された亜硝酸の濃度（mg/L）図 A-2- 13 培養した菌により消費された亜硝酸の濃度（mg/L）以上の結果から、N.europaeaでは培養 4 日目に亜硝酸の産生は殆ど検出できなかったが、N. oceaniは、亜硝酸の産生が確認できた。また、N.winogradosky では培養 4 日後に亜硝酸の減少は確認できなかったが、N.mobilis では培養開始すぐに亜硝酸の減少を確認することができた。以上の結果より、今後の試験には、アンモニア酸化細菌に N.Oceani、亜硝酸酸化細菌

N.mobilisを用いることとした。また、N.OceaniとN.mobilisの硝化能を比較し、同条件で培

養したN.OceanusとN.mobilisを 8:1 の体積比割合で用いることとした。 N. oceaniについては推奨培地 80mL に対して菌ストック 20mL を追加して 1 週間培養した菌を 15,000rpm、4℃、5 分の条件で回収し、人工海水（100%海水）1mL で一度洗浄し、同条件で遠心分離した後に沈殿をタッピングして 50mL のチューブに移してまとめ、人工海水（100%海水） 50mL を加えて、10cm 程度のタイ 2 尾を入れた水槽へ投入した。N. mobilisについては推奨培地 10mL に対して菌ストック 2.5mL を追加して 1 週間培養した菌を 15,000rpm、4℃、5 分の条件で回収し、人工海水（100%海水）1mL で一度洗浄し、同条件で遠心分離した後に沈殿をタッピン 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0 1 2 3 4 濃度(mg /L) 経過時間（日） N. europaea N. oceani 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0 1 2 3 4 濃度(mg /L) 経過時間（日） N.winogradosky N. oceani

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29 グして 50mL のチューブに移してまとめ、人工海水（100%海水）50mL を加えて 10cm 程度のタイ 2 尾を入れた水槽へ投入した。その後、経時的にアンモニア、亜硝酸、硝酸の量を測定した。 Negative control としては菌を投入せずにて 10cm 程度のタイ 2 匹を入れた水槽を用いた。以下にその結果を示す。図 A-2- 14 アンモニア濃度の経時変化図 A-2- 15 亜硝酸濃度の経時変化図 A-2- 16 硝酸濃度の経時変化上記結果から、アンモニア等成分は Negative Control とほとんど変わらない推移を示した。これは設備上（遠心分離機の数）の問題から、培養終了後に菌投与をするための準備に時間がかかってしまったことに起因するのではないかと考えた。推奨培地の培地成分の持ち込みを最低限にするために遠心分離を行ってきたが、手持ちの設備では限界と考え、培地成分の持ち込みがあるが、遠心分離をしないで菌を添加する検討を行った。 N. oceaniについては推奨培地 16mL に対し菌ストック 4mL を追加して 1 週間培養した菌を基 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 濃度 (m g/L) 経過時間（日） Neg. 菌添加 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 濃度 (m g/L) 経過時間（日） Neg. 菌添加 0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 濃度 (m g/L) 経過時間（日） Neg. 菌添加

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30 本培地 80mL に加えて更に 1 週間培養した。その後、培養液を 10cm 程度のタイ 2 尾を入れた水槽へ投入した。N. mobilisについては推奨培地 8mL に対して菌ストック 2mL を追加して 1 週間培養した菌のうち 2.5 mL を基本培地 10mL に加えて更に 1 週間培養した。その後、培養液を 10cm 程度のタイ 2 尾を入れた水槽へ投入した。その後、経時的にアンモニア、亜硝酸、硝酸の量を測定した。Negative control としては菌を投入せずにて 10cm 程度のタイ 2 匹を入れた水槽を用いた。以下にその結果を示す。図 A-2- 17 アンモニア濃度の経時変化図 A-2- 18 亜硝酸濃度の経時変化図 A-2- 19 硝酸濃度の経時変化上記結果から、菌を添加した水槽において 7 日目を境に亜硝酸濃度は下がったため、この時点で生物ろ過槽が立ち上がったと考えられた。今後再現性を確認する実験は必要であると考えるが、硝化能を持つ菌を添加することにより生物ろ過槽の立ち上がりを早める事の可能性が示唆された。また、今回は定量的な議論ができなかったが、飼育水槽の体積あたりに必要な硝化細菌の量を明確にしていくことも必要であると考える。 0 2 4 6 8 10 0 7 14 濃度 (m g/L) 経過時間（日）菌添加 Neg. 0 2 4 6 8 10 0 7 14 濃度 (m g/L) 経過時間（日）菌添加 Neg. 0 10 20 30 40 50 0 7 14 濃度 (m g/L) 経過時間（日）菌添加 Neg.

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31 ４）試験 A-2-4.大島水槽、長崎水槽の生物ろ過槽中の細菌叢変遷の調査次世代シークエンサーを用い、各水槽の生物ろ過槽中の細菌叢の変遷を調査した。平成 27 年度に開発したプロトコルを元に、より安価に多くのサンプルを解析するために下記プロトコルにて解析を行った。表 A-2- 4 保存条件その他のプロトコルサンプル保管条件冷凍

DNA 抽出使用キット：Power Soil. （MO BIO Laboratories, Inc.）

1 個のろ材をハサミで小さく切断（16 分割）したもの全量をサンプルとし、プロトコルはメーカーの推奨に従う。

表 A-2- 5 次世代シークエンス用 1stPCR の条件 DNA 複製酵素 KOD FX Neo（東洋紡ライフサイエンス）

1 次 PCR プライマー Forward:5’-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTACGGGNGGCWGCAG-3’ Reverce ： 5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGACTACHVGGGTATCTAATCC-3’ PCR 条件 94.0 °C 2 分×1 サイクル 98.0 °C 10 秒 57.5 °C 30 秒 ×34 サイクル 68.0 °C 30 秒 68.0 °C 7 分 ×1 サイクル 12.0 °C hold PCR mix 2 × Buffer 12.5μl KOD FX neo 0.5μl 100uM Fw primer 1.0μl 100uM Rv primer 1.0μl Template DNA 1.0μl 10mM dNTP 5.0μl DW up to 25μl アガロースゲル電気泳動

Gel conc. 1.5% 100V 15min.

次世代シーケンサ MiniSeq（イルミナ）

2 次 PCR 反応

表 A-2- 6 次世代シークエンス用 2ndPCR の条件

DNA 複製酵素 2xKAPA HiFi Hotstart ReadyMix（日本ジェネティクス株式会社）

2 次 PCR プライマー Forward 配列 501 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTAGATCGCTCGTCGGCAGCGTC 3' 502 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACCTCTCTATTCGTCGGCAGCGTC 3' 503 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTATCCTCTTCGTCGGCAGCGTC 3' 504 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACAGAGTAGATCGTCGGCAGCGTC 3' 505 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACGTAAGGAGTCGTCGGCAGCGTC 3' 506 5' AATGATACGGCGACCGAGATCTACACACTGCATATCGTCGGCAGCGTC 3' Reverse 配列 702 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTAGTACGGTCTCGTGGGCTCGG 3' 703 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTCTGCCTGTCTCGTGGGCTCGG 3' 704 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCAGGAGTCTCGTGGGCTCGG 3' 705 5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAGTCCGTCTCGTGGGCTCGG 3'

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32 PCR 条件 95.0 °C 3 分 ×1 サイクル 95.0 °C 30 秒 55.0 °C 30 秒 ×8 サイクル 72.0 °C 30 秒 72.0 °C 5 分 ×1 サイクル 4.0 °C hold

PCR mix 2xKAPA HiFi Hotstart ReadyMix 12.5μl 10uM Fw primer 2.5μl 10uM Rv primer 2.5μl Template DNA 2.5μl DW up to 25μl PCR 産物精製 PCR 後の反応溶液から NGS 解析の際には夾雑物となる primer などを除去するため、AMpureXP ビーズを用いて、精製を行う。プロトコルはメーカーの推奨に従う。上記手法を用いて、以下の点について解析を行った。試験 A-2-4-1 PilotFish 法による細菌叢の変遷試験 A-2-4-2 FishlessCycling 法による細菌叢の変遷試験 A-2-4-3 硝化細菌追加時の細菌叢の変遷試験 A-2-4-4 長崎水槽のメタゲノム解析による細菌叢の解析試験 A-2-4-5 大島水槽 1 のメタゲノム解析による細菌叢の解析試験 A-2-4-6 大島水槽 2 のメタゲノム解析による細菌叢の解析試験 A-2-4-7 大島水槽 3 のメタゲノム解析による細菌叢の解析試験 A-2-4-8 大島水槽 4 のメタゲノム解析による細菌叢の解析試験 A-2-4-9 ろ材の海水洗浄と真水洗浄の影響

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33 図 A-2- 20 小型水槽を用いた PilotFish 法による細菌叢の変遷 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% タイ表面 PF_D0 PF_D28 PF_D63 Neg_D1 Neg_D28 Neg_D63

Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Cenarchaeales Cenarchaeaceae Nitrosopumilus Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Nitrososphaerales Nitrososphaeraceae Candidatus Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Hyphomonas Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Sphingomonas Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales

Others

Archaea Other Other Other Other Other

Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075 Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales wb1 Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Muricauda Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Tenacibaculum Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae

Bacteria Gemmatimonadetes Gemm-2 Bacteria NKB19 TSBW08

Bacteria Planctomycetes OM190 agg27

Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales

Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales Phycisphaeraceae

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Planctomycetales Planctomycetaceae Planctomyces Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria BD7-3

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Kiloniellales Kiloniellaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Devosia Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Maricaulis Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Rhodospirillaceae

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Sphingobium Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales Nannocystaceae Plesiocystis Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Alteromonas Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae BD2-13 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Marinobacter Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales HTCC2188

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales J115 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales OM60 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Legionellales Coxiellaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Alcanivoracaceae Alcanivorax Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Oceanospirillaceae Oleibacter Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Oleiphilaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae Methylophaga Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Vibrionales Pseudoalteromonadaceae Pseudoalteromonas Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Vibrionales Vibrionaceae Vibrio

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34 図 A-2- 21 小型水槽を用いた FishlessCycling 法による細菌叢の変遷 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% FC_D0 FC_D28 FC_D63 Neg_D1 Neg_D28 Neg_D63

Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Cenarchaeales Cenarchaeaceae Nitrosopumilus

Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Nitrososphaerales Nitrososphaeraceae Candidatus

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Hyphomonas

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Sphingomonadaceae Sphingomonas

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales

Others

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Muricauda

Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Planctomycetales Planctomycetaceae Planctomyces

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria BD7-3

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Maricaulis

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Rhodospirillaceae

Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Methylophilales Methylophilaceae Methylotenera

Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales Nannocystaceae Plesiocystis

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Alteromonas

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae BD2-13

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Alcanivoracaceae Alcanivorax

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Oceanospirillaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Oceanospirillaceae Oleibacter

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae

(11)

35

図 A-2- 22 小型水槽を用いた硝化細菌追加時の細菌叢の変遷

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

ADD_D0 ADD_D14

Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Cenarchaeales Cenarchaeaceae Nitrosopumilus Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Nitrososphaerales Nitrososphaeraceae Candidatus Bacteria Nitrospirae Nitrospira Nitrospirales Nitrospiraceae

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Pirellulales Pirellulaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales

Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Nitrosomonadales Nitrosomonadaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales

Others

Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Flavobacterium Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Gaetbulibacter Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Maribacter

Bacteria Bacteroidetes Sphingobacteriia Sphingobacteriales Sphingobacteriaceae Sphingobacterium Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae

Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales [Exiguobacteraceae] Exiguobacterium Bacteria Gemmatimonadetes Gemm-2

Bacteria NKB19 TSBW08

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Planctomycetales Planctomycetaceae Planctomyces Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Caulobacterales Caulobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Caulobacterales Caulobacteraceae Mycoplana Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Kiloniellales Kiloniellaceae

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Rhizobiaceae Agrobacterium Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Loktanella Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Alcaligenaceae

Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Burkholderiales Oxalobacteraceae Janthinobacterium Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Glaciecola Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Marinobacter Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales HTCC2188 HTCC

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales OM60 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Oleiphilaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Pseudomonadales Moraxellaceae Acinetobacter Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Pseudomonadales Pseudomonadaceae Pseudomonas Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae

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36 図 A-2- 23 長崎水槽のメタゲノム解析による細菌叢の解析 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2015年5月 2015年7月 2015年11月 2016年2月 2016年4月 2016年8月 2016年10月 2016年12月

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Pirellulales Pirellulaceae

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Hyphomonas Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales

Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Nitrosomonadales Nitrosomonadaceae Others

Archaea Other Other Other Other Other Bacteria Acidobacteria Sva0725 Sva0725

Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075 Bacteria Bacteroidetes BME43

Bacteria Bacteroidetes Cytophagia Cytophagales Cytophagaceae Bacteria Bacteroidetes Cytophagia Cytophagales Flammeovirgaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Maribacter Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Polaribacter Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae

Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae Lewinella Bacteria Caldithrix Caldithrixae Caldithrixales Caldithrixaceae Caldithrix Bacteria Chloroflexi Thermomicrobia AKYG1722

Bacteria GN02 3BR-5F

Bacteria Gemmatimonadetes Gemm-2 Bacteria Planctomycetes OM190 Bacteria Planctomycetes OM190 agg27

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Planctomycetales Planctomycetaceae Planctomyces Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Kiloniellales Kiloniellaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae

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37 図 A-2- 24 大島水槽 1 のメタゲノム解析による細菌叢の解析 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2015年4月 2015年6月 2015年7月 2016年1月 2016年2月 2016年4月 2016年6月 2016年7月 2016年8月 2016年10月

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Pirellulales Pirellulaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales Others

Archaea Other Other Other Other Other Bacteria Acidobacteria Holophagae Holophagales Bacteria Acidobacteria Sva0725 Sva0725 Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075 Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales wb1

Bacteria Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Mycobacteriaceae Mycobacterium Bacteria Bacteroidetes BME43

Bacteria Bacteroidetes Cytophagia Cytophagales Cytophagaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Cryomorphaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Gaetbulibacter Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae

Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae Rubricoccus Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae

Bacteria Chlorobi OPB56 Bacteria Chlorobi SJA-28

Bacteria Chloroflexi Anaerolineae Caldilineales Caldilineaceae Bacteria Chloroflexi TK17

Bacteria Chloroflexi Thermomicrobia AKYG1722 Bacteria GN02 3BR-5F

Bacteria Gemmatimonadetes Gemm-2 Bacteria Planctomycetes OM190 agg27

Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales Phycisphaeraceae Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae S-70

Bacteria Planctomycetes Pla3

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria BD7-3 Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Maricaulis Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Rhodospirillaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Erythrobacteraceae Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales Nannocystaceae Plesiocystis Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria NB1-j

Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Syntrophobacterales Syntrophobacteraceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae BD2-13 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales HTCC2188 HTCC Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales J115 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales OM60

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Alcanivoracaceae Alcanivorax Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Oleiphilaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae Methylophaga Bacteria SBR1093 VHS-B5-50

Bacteria Verrucomicrobia Verrucomicrobiae Verrucomicrobiales Verrucomicrobiaceae

Bacteria Verrucomicrobia Verrucomicrobiae Verrucomicrobiales Verrucomicrobiaceae Persicirhabdus Bacteria Verrucomicrobia Verrucomicrobiae Verrucomicrobiales Verrucomicrobiaceae Rubritalea

(14)

38 図 A-2- 25 大島水槽 2 のメタゲノム解析による細菌叢の解析 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2015年4月 2015年6月 2015年7月 2016年1月 2016年2月 2016年4月 2016年6月 2016年7月 2016年8月 2016年10月

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Pirellulales Pirellulaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Erythrobacteraceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales

Others

Archaea Other Other Other Other Other Bacteria Acidobacteria Holophagae Holophagales Bacteria Acidobacteria Sva0725 Sva0725 Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075 Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales wb1

Bacteria Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Mycobacteriaceae Mycobacterium Bacteria Bacteroidetes BME43

Bacteria Bacteroidetes Cytophagia Cytophagales Cytophagaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Cryomorphaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Gaetbulibacter Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae

Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae Rubricoccus Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae

Bacteria Chlorobi OPB56 Bacteria Chlorobi SJA-28

Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales Phycisphaeraceae Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae S-70

Bacteria Planctomycetes Pla3

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria BD7-3 Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Maricaulis Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Rhodospirillaceae Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales Nannocystaceae Plesiocystis Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria NB1-j

Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Syntrophobacterales Syntrophobacteraceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae BD2-13 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales HTCC2188 HTCC Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales J115 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales OM60

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Alcanivoracaceae Alcanivorax Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Oleiphilaceae

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae Methylophaga Bacteria SBR1093 VHS-B5-50

(15)

39 図 A-2- 26 大島水槽 3 のメタゲノム解析による細菌叢の解析 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2015年4月 2015年6月 2015年7月 2016年1月 2016年2月 2016年4月 2016年6月 2016年7月 2016年8月 2016年10 月

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales Others

Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075 Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales JdFBGBact Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales SC3-41 Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales wb1

Bacteria Actinobacteria Actinobacteria Actinomycetales Mycobacteriaceae Mycobacterium Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Cryomorphaceae

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Gaetbulibacter Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Tenacibaculum Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae

Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae Bacteria Chlorobi OPB56

Bacteria Chloroflexi Anaerolineae Caldilineales Caldilineaceae Bacteria Chloroflexi Thermomicrobia AKYG1722

Bacteria Planctomycetes OM190 agg27

Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales Phycisphaeraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Methylocystaceae Pleomorphomonas Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales

Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria PB19

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales HTCC2188 HTCC Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae Bacteria SBR1093 VHS-B5-50

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40 図 A-2- 27 大島水槽 4 のメタゲノム解析による細菌叢の解析 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 2015年4月 2015年6月 2015年7月 2016年1月 2016年2月 2016年4月 2016年6月 2016年7月 2016年8月

2016年10月 Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Cenarchaeales Cenarchaeaceae Nitrosopumilus

Archaea Crenarchaeota Thaumarchaeota Nitrososphaerales Nitrososphaeraceae Candidatus Bacteria Nitrospirae Nitrospira Nitrospirales Nitrospiraceae

Bacteria Planctomycetes Planctomycetia Pirellulales Pirellulaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales Others

Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075 Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales JdFBGBact Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales wb1 Bacteria Actinobacteria Thermoleophilia Solirubrobacterales Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Cryomorphaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae Bacteria Chlorobi SJA-28

Bacteria Chloroflexi Anaerolineae Caldilineales Caldilineaceae Bacteria Chloroflexi Thermomicrobia AKYG1722

Bacteria GN02 3BR-5F

Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales Phycisphaeraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Hyphomonadaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Thiotrichales Piscirickettsiaceae Bacteria SBR1093 VHS-B5-50

(17)

41 図 A-2- 28 ろ材の海水洗浄と真水洗浄の影響 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% No.1_6月海水 No.1_7月海水 No.1_8月海水 No.1_6月真水 No.1_7月真水 No.1_8月真水 No.2_6月海水 No.2_7月海水 No.2_8月海水 No.2_6月真水 No.2_7月真水 No.2_8月真水 No.3_6月海水 No.3_7月海水 No.3_8月海水 No.3_6月真水 No.3_7月真水 No.3_8月真水 No.4_6月海水 No.4_7月海水 No.4_8月海水 No.4_6月真水 No.4_7月真水 No.4_8月真水

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Sphingomonadales

Bacteria Proteobacteria Betaproteobacteria Nitrosomonadales Nitrosomonadaceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Chromatiales

Others

Archaea Other Other Other Other Other Bacteria Acidobacteria Sva0725 Sva0725 Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Bacteria Acidobacteria [Chloracidobacteria] RB41 Ellin6075 Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales JdFBGBact Bacteria Actinobacteria Acidimicrobiia Acidimicrobiales wb1 Bacteria Bacteroidetes Bacteroidia Bacteroidales

Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Cryomorphaceae Bacteria Bacteroidetes Flavobacteriia Flavobacteriales Flavobacteriaceae Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae Bacteria Bacteroidetes [Rhodothermi] [Rhodothermales] Rhodothermaceae Rubricoccus Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Chitinophagaceae Bacteria Bacteroidetes [Saprospirae] [Saprospirales] Saprospiraceae Bacteria Chlorobi SJA-28

Bacteria Gemmatimonadetes Gemm-2

Bacteria Planctomycetes Phycisphaerae Phycisphaerales Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Hyphomicrobiaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhizobiales Phyllobacteriaceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodobacterales Rhodobacteraceae Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales

Bacteria Proteobacteria Alphaproteobacteria Rhodospirillales Rhodospirillaceae Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Myxococcales

Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria NB1-j

Bacteria Proteobacteria Deltaproteobacteria Syntrophobacterales Syntrophobacteraceae Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae Alteromonas Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales Alteromonadaceae BD2-13 Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Alteromonadales HTCC2188 HTCC Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales

Bacteria Proteobacteria Gammaproteobacteria Oceanospirillales Alcanivoracaceae Alcanivorax Bacteria Verrucomicrobia Verrucomicrobiae Verrucomicrobiales Verrucomicrobiaceae Rubritalea Bacteria WS3 PRR-12 Sediment-1 CV106

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42 ア.試験 A-2-4-1 PilotFish 法による細菌叢の変遷購入後すぐのタイ表面には古細菌であるCenarchaeaceae科、 Nitrososphaeraceae科の硝化細菌が存在していた。しかしながら Pilot Fish 法で生物ろ過槽が立ち上がったと考えられた後の細菌叢には両科の微生物は殆ど存在していなかった。また、Nitrococcus 属が属する Chiromatiales 目の微生物は高いポピュレーションを示しているが、ネガティブコントロールにも存在するため、本試験において消化能の獲得に貢献した原因ではないと考えられた。なお、硝化能を持つとされる Sphingomonadaceae科のポピュレーションが、PilotFish 法においてのみ増加していたため、本試験での硝化能の獲得に貢献したのではないかと考えられた。イ.試験 A-2-4-2 FishlessCycling 法による細菌叢の変遷 FishlessCycling 法では硝化能があると考えられる微生物の中で、ネガティブコントロールと比べて高いポピュレーションを示すものは存在しなかった。本試験系では 2 ヶ月間では硝化能を獲得できなかったと考えられる。ウ.試験 A-2-4-3 硝化細菌追加時の細菌叢の変遷

添加したN. oceani及びN. mobilis が属するChromatiales科は、添加後 14 日で存在率を 0.5

ポイントほど下げたが、1％以上のポピュレーションを保った。添加していないCenarchaeaceae科、 Nitrososphaeraceae科、 Nitrospiraceae科は試験開始直後に 1％以上のポピュレーションがあったが、14 日後は 1%以下に下がった。一方、Pirellulaceae科Nitrosomonadaceae科は 14 日で 2％以上のポピュレーションとなった。エ.試験 A-2-4-4 長崎水槽（試験区 2）のメタゲノム解析による細菌叢の解析オ.試験 A-2-4-5 大島水槽 1 のメタゲノム解析による細菌叢の解析カ.試験 A-2-4-6 大島水槽 2 のメタゲノム解析による細菌叢の解析キ.試験 A-2-4-7 大島水槽 3 のメタゲノム解析による細菌叢の解析ク.試験 A-2-4-8 大島水槽 4 のメタゲノム解析による細菌叢の解析昨年度に比較して、すべての水槽で硝化能を持つ古細菌の Cenarchaeaceae 科と Nitrososphaeraceae科のポピュレーションが高まった。生物ろ過層が成熟してくると上記 2 種、特にCenarchaeaceae 科はポピュレーションが高まることが分かった。また、Pirellulaceae科、 Nitrospiraceae 科の硝化細菌は昨年度から引き続き、比較的高いポピュレーションで存在し続けた。Nitrosomonadaceae科および Chromatiales科の硝化細菌はポピュレーションが安定しなかった。ケ.試験 A-2-4-9 ろ材の海水洗浄と真水洗浄の影響大島水槽では、生物ろ過材を定期的に洗浄していた。洗浄の際には水道水を通常用いていたが、微生物に対するカルキ、淡水の影響が考えられたため、今年度は従来通り水道水で洗浄するものと、海水を用いて洗浄するもので細菌叢がどのように変遷するかを調べた。

(19)

43 その結果、海水と水道水による洗浄により、Nitrospiraceae科とChromatiales科の硝化細菌は存在率を僅かに高める傾向があるように考えられた。それ以外の硝化細菌については傾向が見当たらなかった。 <考察> 平成 27 年度の課題であった細菌叢の年変化を追跡することが可能となり、生物ろ過を生物学的に解析することが可能となった。本試験系を用い、生物ろ過槽の早期立ち上げを目的に平成 28 年度の検討を行った。 45cm 小型水槽にて生物ろ過槽のモデルを構築することができれば、大きな水槽ではなかなか行うことができない条件検討を行うことができる。このため、一般的に行われている PilotFish 法と FishlessCycling 法を用いて生物ろ過槽の立ち上げ試験を行った。文献上はどちらも約 2 ヶ月で立ち上がるということであったが、実際に明確に立ち上がったと考えられるのは PilotFish 法であった。これは細菌叢を比較しても、PilotFish 法では Negative Control と比較して存在比が多い、硝化能を持つと考えられる細菌があった。このことからも PilotFish 法を用いることで、49 日で生物ろ過槽の立ち上げを行うことができると考えられた。本試験系を用い、飼育水でのツブリナ飼育を行うことにより、N 源を吸収することで水質の悪化による水換えの頻度も落とせることで生物ろ過槽の早期立ち上げに寄与するのではないかと考えて実験を行った。ところがツブリナ飼育をしなかったコントロールと比較して、アンモニア、亜硝酸、硝酸の量は殆ど同じ挙動を示した。このことは、今回の試験系ではツブリナの栽培によって生物ろ過槽の立ち上げを早める事ができないことを示している。しかしながら、ツブリナの成長は 1%海水では真水と殆ど同じであったことから、低海水での陸上養殖では応用の可能性はあると考える。その場合には、海水が植物体に直接かかることで葉緑体が抜けて白化することや、ツブリナの葉が横に広がる性質から水面で多くの栽培を行うことが難しいことなどを考慮し、できるだけ多くのツブリナを栽培できるような水槽の工夫を行うことができると考えられた。次に、硝化能を持つ菌を培養し、直接添加することによって生物ろ過槽を早期に立ち上げる事ができるという仮説のもとに実験を行った。予備試験により培養後に硝化能を確認できた N. oceani 及びN. mobilisを水槽中に添加した。亜硝酸の濃度は 7 日目をピークに下がったことから、1 週間程度で生物ろ過槽の立ち上げに成功したものと考えられた。細菌叢を確認した所、Chromatiales科（N. oceani及びN. mobilisが属する科）は 14 日で存在率を下げたが 1%以上の存在率を持ち続けた。な

お、添加していないがCenarchaeaceae科、 Nitrososphaeraceae科、 Nitrospiraceae科は試験直後に 1%以上の存在率があったが、その後存在率が 1%以下に下がってしまった。一方、Nitrosomonadaceae

科は 14 日で 2％以上の存在率となった。

PilotFish 法では、Cenarchaeaceae科、Nitrososphaeraceae科の微生物がタイ表皮に存在したが、その後ポピュレーションを下げた。これは硝化細菌を添加した上記実験でも同様の現象が起きていた。一方硝化細菌添加試験ではChromatiales目が高い存在率を維持した。これらのことから、硝化細菌の添加による生物ろ過槽の早期立上げを行うには、添加する硝化細菌の種類及び量が重要では

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44 ないかと考えられた。また、長崎、大島の水槽での細菌叢の変遷を 2 年に渡り定期的に調査を行った。昨年度と比較して、すべての水槽で硝化能を持つ古細菌の Cenarchaeaceae 科と Nitrososphaeraceae科の存在率が高まった。飼育条件等に変更があったわけではないため、この変化の原因は不明である。また、 Nitrospiraceae 科の硝化細菌は昨年度から引き続き、高い割合で存在し続けた。生物ろ過槽内で重要な働きをしていると考えられた。また、Nitrosomonadaceae科および Chromatiales科の硝化細菌は存在率が 1%以下になる時期もあり、安定しなかった。また、定期的にろ過材を洗浄する際に、海水を使う場合と水道水を使う場合で細菌叢に影響があるかを検討した。真水による洗浄により、Nitrospiraceae科とChromatiales科の硝化細菌は存在率を高める傾向があるような結果となったが、他の硝化細菌への影響は特に傾向が見当たらなかった。洗浄した水によって硝化能に大きな影響があった訳ではないため、コストの低い水道水での洗浄も可能であると考えられる。これらのことから、生物ろ過槽が立上がって 1 年以上経つと古細菌の Cenarchaeaceae 科と Nitrososphaeraceae 科が増加するようだが、それらの菌が持ち込まれたとしても、単純に定着して増加はしないと考えられた。また、Nitrospiraceae科とChromatiales科は水道水による洗浄によっても影響を受けにくいように思われたが、今回添加したChromatiales科（N. oceani及びN. mobilis）は長期間安定して生物ろ過槽に存在できない結果となっている。そこで、Nitrospiraceae 科の菌を添加することができれば、真水による洗浄にも強く、安定して生物ろ過槽に存在することができるように考えられた。以上のことから、通常 2 ヶ月ほど掛かる生物ろ過槽の立ち上げを、硝化細菌の添加によって 1 週間ほどに早めることができたと考えられた。今後は菌の種類及び、水量に対して添加量を最適化することにより、生物ろ過槽を早期に立上げ、陸上養殖の収益化に貢献できると考える。 c.今後の課題について添加する硝化細菌叢の最適化

今回の試験では、Chromatiales科（N. oceani及びN. mobilis）の添加によって生物ろ過槽の早期立上げを実現できる可能性を見いだせた。しかしながら、今回添加した菌は時間が経過しても安定して存在していないようだったので、安定して存在できるNitrospiraceae科の菌を添加することで生物ろ過槽の早期立上げと、安定した機能発揮に繋がると考えられた。また、生物ろ過槽が硝化能を獲得して 1 年ほど経つと古細菌の Cenarchaeaceae科とNitrososphaeraceae科が増殖してくるという結果となった。ろ過槽が成熟することにより Cenarchaeaceae 科とNitrososphaeraceae 科が増殖しやすい環境となった可能性があるため、この環境を特定、再現することができれば、Cenarchaeaceae 科とNitrososphaeraceae科を中心とした生物ろ過槽の立ち上げも可能になると考えられる。なお、今回は試験の都合上、量の議論をできなかったので、水量に対して必要な菌体数を定義することにより、準備するべき菌の量を特定し、早期立ち上げの系の安定化を実現することができると考えた。

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45 大型水槽における試験

今回の試験はあくまで 45cm の小型水槽で行ったものである。大型の水槽で同様の結果が出る保証はないため、小型水槽である程度条件を詰めた段階で、大型水槽による再現性試験を行う必要があると考える。これにより、様々なサイズや水量に合わせた菌体の準備を行うことができると考える。

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46 A-3：機械ろ過方式の検証、物理ろ過の改良、及び酸素溶解方式の改良 A-3-1）：高濃度気体溶解装置の評価検証ａ.実施内容飼育水中の溶存酸素濃度を上昇させることは、飼育環境の向上に寄与し、その結果、摂餌量の向上、成長量の増大につながる極めて重要な課題である。また、昨年度の試験結果から溶存酸素の上昇は飼育水の濁度の低減につながることが明らかになった。このため、本年度はさらなる溶存酸素濃度の上昇を目指して既存の酸素混合器＋酸素発生装置と比較して高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベの酸素溶解効果を検証した。本年度試験に用いた高濃度気体溶解装置の特徴は、従来、水の中に気体を通すということに対して、気体の中に水を通すという発想のものであり、水の分子の間隙に溶解する空気を酸素に置換し、飼育水中の酸素濃度を増大させようとする装置である。当装置を利用し、汚泥の堆積する河川湖沼の水底部の溶解酸素濃度を高めその浄化促進や産業排水の活性汚泥の処理に利用されている。本装置は平成 28 年 3 月 23 日に No.3 水槽に設置し、4 月 17 日までの 26 日間、毎日の飼育水中の酸素濃度と濁度の動向を対照区の No.4 水槽と比較した。また、平成 28 年 5 月 25 日と 6 月 2 日の 2 日間、経過時間毎の酸素濃度の動向をモニターした。

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47 なお、3 月 23 日から 4 月 17 日までの試験は、既存の酸素混合器＋酸素発生装置に高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベを追加したものである。一方、5 月 25 日と 6 月 2 日の試験は、高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベのみの運転、既存の酸素混合器＋酸素発生装置のみの運転、酸素混合器＋酸素発生装置に高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベの運転での酸素濃度の測定データである。 b.結果と考察図A-3-1)-1 に酸素混合器＋酸素発生装置に高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベを追加した No.3 水槽と酸素混合器＋酸素発生装置のみの対照区の No.4 水槽の酸素濃度の動向を示した。酸素濃度は全期間を通して No.3 水槽が平均 11.2％高かった。また、同期間の濁度の動向を図 A-3-1)-2 に示した。図 A-3-1)-1.No.3 水槽と No.4 水槽の溶存酸素濃度図 A-3-1)-2.No.3 水槽と No.4 水槽の濁度の推移

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48 酸素ボンベを交換した以降の平均濁度は No.3 の 0.65 に対して No.4 は 1.18 であった。本施設では濁度が 1.2 を超えると魚影と水槽底が見えづらくなるが、No.3 は全期間を通してクリアに魚影が観察され、飼育水中の酸素濃度の増大は濁度の低減に繋がることが昨年度に続き証明された。図 A-3-1)-3 と図 A-3-1)-4 に高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベのみの運転、既存の酸素混合器＋酸素発生装置のみの運転、酸素混合器＋酸素発生装置に高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベの運転での酸素濃度の推移を示した。両者を同時運転した場合は、当然であるが、既存の酸素混合器＋酸素発生装置単独運転より、酸素濃度が 0.9mg/L 程度高まる。一方、高濃度気体溶解装置＋酸素ボンベのみの単独運転では酸素濃度は 6mg/L まで低下するが、酸素混合器＋酸素発生装置単独運転では 8.5mg/L 程度が維持できており、能力の差が推察された。これは両者の能力の違いもあるが、高濃度気体溶解装置の能力が出図 A-3-1)-3.No.3 水槽と No.4 水槽の溶存酸素濃度の推移図 A-3-1)-4.No.3 水槽と No.4 水槽の溶存酸素濃度の推移

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49 ていなかった可能性、あるいは水槽規模にあった機種選定ができていなかった可能性が指摘された。 c.今後の課題について今回の評価試験においては、既存の酸素混合器＋酸素発生装置の上乗せ効果のみが認められ、本装置の単独使用では既存装置より酸素溶解能が劣る結果となった。本装置は特にウナギ養殖の利用としては、養鰻池で溶存酸素濃度の増大に評価を受けている装置であり、今回の結果は使用方法や機種の選定条件に課題があり、適正な能力が発揮できてなかった可能性も指摘されている。また、本装置の酸素供給源を酸素ボンベから行ったが、対照区の条件に合わせて酸素発生装置使用の条件設定が必要であった。なお、酸素供給源として酸素ボンベを使用することでランニングコストが高くなったが、酸素供給装置に変更することでコストの低減が可能になると思われる。一方、既存の酸素供給に本装置を追加することによって、濁度低減に効果が得られたことは、昨年度の飼育水中の酸素濃度の向上が濁度の低減に貢献するという結果が再現できた。 A-3-2）：脱窒槽の評価検証ａ．実施内容 ①背景魚体から排泄される糞尿由来のアンモニア態窒素は魚体に対して急性毒性があるため、生物ろ過槽などを用いて積極的に処理を行い硝酸態窒素へ酸化させている（硝化反応）。一方で、硝酸態窒素については、急性毒性がほとんど無いことから、積極的な処理が行われていないのが現状である。しかしながら、硝酸態窒素は慢性毒性も疑われることから、可能な限り低位維持することが望ましい。硝酸態窒素を窒素ガスにまで還元（脱窒）するためには、嫌気的条件を維持する必要がある。一方、飼育条件・硝化反応条件は好気条件が必要で、前述の脱窒条件と相反することから、その両立が難しい。そこで、一般的には飼育水中に溶け込んでいる溶存酸素を低減させる必要があるために、槽を切り離して脱窒処理が行われるが、装置規模が大きくなるという課題がある。また、脱窒に必要な水素供与体を硝酸態窒素に応じた量で適切に添加する必要がある。特に脱窒反応の水素供与体として一般的に用いられるメタノールは魚体への毒性が強いため、厳密な制御が必要となり一層注意を要する。このことから、メタノールを用いる脱窒装置は制御系のコストも増大し、安価な閉鎖系陸上養殖システムの実現を困難にさせている。 ②目的安価な閉鎖系陸上養殖システムを実現するためには、脱窒装置の小型化と制御系の簡素化が必要である。そこで、脱窒処理の連続化による装置小型化、および脱窒に必要な水素供与体として生分解性ポリマーを用いることによる制御系の簡素化を狙い、その効果検証を行った。 ③実験方法生分解性ポリマーは株式会社カネカ製の商品名 KANEKA Biopolymer PHBHTM_{を用いた。こ}

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50 のKANEKA Biopolymer PHBHTM_は淡水分解性だけでなく海水分解性に優れていることから、海水対応脱窒菌が好適に資化することができ、良好に脱窒できることが期待された（コンバーテック 2016 4 128-131, BioPla Journal 2016 No.62 5-9, 図 A-3-2)-1 参照）。図 A-3-2)-2 に設置イメージ図を示す。連続脱窒装置への流入水は、浮遊懸濁物質による装置詰まりが懸念されたため試作型物理ろ過槽出口より取水することとし、処理水は処理水中に含まれる脱窒菌を殺菌する目的で再度UV 殺菌灯を有する試作型物理ろ過槽を経由し飼育水槽に返送できるようにラインを設置した。この連続脱窒装置は本施設のNo.4 水槽に設置し、比較対照区を No.3 水槽として実験を行った。脱窒試験の評価は、アンモニア態窒素濃度、亜硝酸態窒素濃度および硝酸態窒素濃度で比較検討を行った。分析に用いた試薬は、HACH 社製の NitriVer3（亜硝酸態窒素）、NitriVer5（硝酸態窒素）、共立理化学研究所社製KR-NH4 パックテスト（アンモニア態窒素）を用い、分析は海水用プロトコルを用い測定を行った。また、処理水の溶存酸素濃度は、メトラー・トレド社製Seven2 GO を用いてオンラインで測定した。なお、運転は24 時間連続運転とし、試験期間は平成 28 年 6 月 23 日～ 10 月 22 日までの約 4 ヶ月であった。ｂ．結果と考察 ①アンモニア態窒素・亜硝酸態窒素・硝酸態窒素濃度の評価図 A-3-2)-1.各種生分解性樹脂の海水分解試験結果（測定：国立研究開発法人産業技術総合研究所）コンバーテック 2016 4 128-131 より抜粋図 A-3-2)-2.連続脱窒装置の設置イメージ図

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51 図A-3-2)-3 に硝酸態窒素濃度の経時変化（水槽中）を示す。脱窒装置稼動前は両者共に約250ｍｇ/Ｌであったが、装置稼動後は少しずつ試験区の水槽中の硝酸態窒素濃度が低下した。また、本装置の脱窒処理能力を調べるべく、装置入/出の硝酸態窒素の差分、即ち硝酸態窒素除去量を調べた結果（図A-3-2)-4）、稼動直後は装置出口の溶存酸素濃度が高く、脱窒反応が効率的に進んでいなかったが、稼動後約100 時間で定常状態に達し安定的な脱窒反応が起こっていることが確認できた。なお、その際の溶存酸素濃度は入り口が7～8ｍｇ/L であるのに対し、出口はほぼ0ｍｇ/L であることから、生分解性ポリマーにより菌が活性化することで、装置内に持ち込んだ溶存酸素を消費し、装置内が嫌気状態となり、脱窒環境が整ってきたと推察された。脱窒反応は硝酸態窒素→亜硝酸態窒素→一酸化窒素→亜酸化窒素→窒素ガスの経路で反応が進む。これら反応に関与する菌体は複数あるため、それらの菌のバランスが悪いと系中への亜硝酸態窒素の蓄積を引き起こす可能性がある。しかしながら、反応初期の段階では、亜硝酸態窒素の蓄積が見受けられたものの、最終的に対象区と同レベルで推移した（図A-3-2)-5）。おそらく反応初期と後期で菌叢が異なるものと推察されるが、現在までに明確な理由は分かっていない。なお、アンモニア態窒素については、対照区と比図 A-3-2)-4.処理性確認実験イメージ（左）硝酸態窒素除去量のグラフ（右）図 A-3-2)-3 硝酸態窒素のトレン図 A-3-2)-5.亜硝酸態窒素のトレンド

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52 較しほとんど大差はなく、脱窒によってアンモニア態窒素の硝化には何らの影響も及ぼさないことがあらためて確認された（図A-3-2)-6）。以上より、途中、装置改造（図 A-3-2)-3 中*1）やバイオフィルム付着によるライン詰まり（図 3 中*2）があったものの、対照区（図 A-3-2)-3 青）と比較し、硝酸態窒素を低減させることができ、KANEKA Biopolymer PHBHTM_を用いた連続脱窒装置の有効性を確認することができた。 ②重曹添加量本施設の実験では、pH 調整剤として重曹を添加していた。重曹添加が必要な大きな要因は、アンモニア態窒素を硝酸態窒素にまで硝化させる際にアルカリ分が消費され水槽内の pH が低下するからである。一方で脱窒反応は、上記硝化反応とは逆にアルカリ分が補給され、一般的に硝化に必要なアルカリ分の半量が補給されると言われている（ref. コロナ社生物学的排水処理工学）。そこで、本施設での脱窒反応開始後の重曹の添加量を比較した。その結果を図 A-3-2)-7 に示す。脱窒装置稼動前の5 月度は対照区である No.3 水槽と No.4 水槽ではほとんど差が見られないが、脱窒装置稼動後は重曹添加量が減少し、概ね対照区の半分程度の添加量となっていることが分かった。このことからも装置稼働中、脱窒反応が良好に進んでいることが伺える。また、脱窒装置を設置することにより、pH 調整剤の添加量の削減にも寄与することが確認できた。 ③魚体の成育速度改善水槽内の硝酸態窒素濃度を低減することにより魚体の成育速度に差が出ているかを解析した。まず、魚体重量の頻度分布は正規分布であると仮定し、ヒストグラムを作成した（事前にサンプリング生データn=30 を Smirnov-Grubbs 検定により有意水準 0.01 とし外れ値を検出した）。そのヒストグラムをガウス関数で残差自乗が最小になるようにフィッティングを行った。図 A-3-2)-7.重曹添加量比較グラフ図A-3-2)-6.アンモニア態窒素のトレンド

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53 その結果を図A-3-2)-8 に示す。脱窒装置稼動前（6/16 サンプリングデータ）は分布にほとんど差が見られないが、脱窒装置稼動後の分布には差が出てきていることが分かった。一方で、魚体重量の平均値の比較を行うべくチューキー検定（有意水準 0.05）を行ったところ、6/16 の魚体重量平均値および、10/28 の魚体重量平均値で、対照区である No.3 水槽と脱窒実験を実施した試験区の No.4 水槽では有意差がなかった。よって、現時点では脱窒を行うことによる平均魚体重量の差異は確認できなかったが、分布に差が出てきていることから考えると、長期的に硝酸態窒素を低位維持することで、魚体の成長になんらかの有意な変化が見られる可能性があると考えられた。ｃ．今後の課題についてこれまでの結果から、KANEKA Biopolymer PHBHTM_{を用いた連続脱窒装置は、水槽内の硝酸態} 窒素除去に一定の効果が得られた。しかしながら今回の運転では装置手前のストレーナの詰まりやライン中のバイオフィルム発生による詰まり発生といった装置上の課題が発生し、結果飼育担当者の作業負荷が上昇した。これらについては今後の課題であるものの、逆洗浄機構の設置および装置内部構造の最適化などで対応可能と考えられる。また、魚体の成育速度改善については、長期運転データ取得が必要と考えられた。以上より、簡便な装置で脱窒することを実証規模で確認できたことは非常に有意義な結果であり、安価な閉鎖系陸上養殖システムの実現に近づけたと考えられた。図 A-3-2)-8 魚体重量のヒストグラム